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방법 논문

랑겐도르프 관류 및 중력 침전을 통한 성체 쥐 심근세포의 분리 및 정제

284 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69102

⸱

2026년 3월 31일

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

이 논문에서

요약

이 연구는 성체 마우스 심근세포의 추출 절차를 최적화하고 간소화하는 것을 목표로 하며, 궁극적으로 심혈관 질환 연구 방법론을 개선하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 낮은 처리 시간 내에 높은 생존력과 순도를 가진 심근세포를 효율적으로 확보하여 더 신뢰할 수 있는 실험과 치료 발전을 가속화할 수 있게 합니다.

초록

심혈관 질환은 여전히 주요 글로벌 보건 과제로 남아 있어 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델에 대한 긴급한 수요를 만들어냅니다. 본 연구는 기존 방법에서 생존율이 낮고 비심근세포 오염의 한계를 해결하기 위해 성체 마우스 심근세포의 분리 및 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 역행성 랑겐도르프 관류를 기반으로 하며, 항응고를 위해 헤파린 나트륨을 사용하고 소화를 위해 콜라겐제 2형(1.2 mg/mL) 단독으로 사용합니다. 심근세포는 중력 침전으로 정제되어 라미닌 코팅된 표면에서 배양되었다. 이 방법은 심장당 8.75 ± 0.36 × 105 개의 심근세포를 꾸준히 생산했으며, 막대세포 비율이 높았으며(91.2% ± 2.11%), 높은 순도(dapi⁺ 세포 대비 cTNT⁺DAPI⁺ 세포 비율은 약 97.47% ± 1.365%)로 명확한 근절 구조를 보였다. 고품질 성인 심근세포를 얻기 위한 표준화되고 재현 가능한 방법을 제공함으로써, 이 프로토콜은 시험관 내 연구와 병태생리학적 관련성 간의 간극을 효과적으로 메우고 고급 심혈관 연구를 지원합니다.

서론

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망 원인의 주요 원인으로 남아있습니다. 심근세포는 심장 연구의 중심 연구 주제로서 오랫동안 심장 생리학과 병리학을 조사하는 데 필수적인 도구로 사용되어 왔습니다. 상업적으로 이용 가능한 심근세포 세포주와 최근 대중화된 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포(hPSC-CMs)는 접근성과 조작의 용이성 측면에서 더 큰 이점을 제공하지만, 3,4,5 1차 심근세포는 체외에서 분리된 경우 심장 생리학적 및 병리학적 기전과 구조적·기능적 상관관계가 우수함을 보인다. 따라서 시험관 내 심근세포 분리 기술을 숙달하는 것이 매우 중요합니다.

심근세포는 발달 과정에서 뚜렷한 형태학적 및 기능적 변형을 보입니다. 특히, 이 세포들은 배아 발달기와 신생아 기간(출생 후 7일 이내)에는 증식 능력을 유지하지만,그 이후에는 이 재생 능력이 영구적으로 상실됩니다. 출생 후 성숙을 거치면서 심근세포는 상당한 형태학적 재형성을 거쳐, 결국 2개월 전까지 특징적인 성체 표현형을 갖게 되는데, 이는 고도로 조직화된 근근 구조를 가진 막대 형태를 특징으로 합니다 7,8. 이러한 발달 단계 의존적 특성은 심장 병태생리의 기전적 연구에 성체 마우스 심근세포를 활용하는 것이 매우 중요함을 강조합니다.

이 분야를 발전시키는 데 중요한 것은 특히 인간 심장 생리를 정확히 모방하는 성인 유래 세포를 신뢰성 있게 확보하는 것입니다. 성체 쥐 심근세포에 대한 현재 분리 프로토콜은 여러 지속적인 도전에 직면해 있습니다: (i) 세포 생존 능력 저하, (ii) 이질적인 집단 특성, (iii) 기술적으로 까다로운 절차 - 이 모든 것이 연구 진행을 저해합니다 9,10. 이는 향상된 수확량과 순도를 모두 달성하기 위해 분리 방법론을 최적화해야 한다는 시급한 필요성을 강조하며, 심혈관 질환 연구에 생리학적으로 더 적합한 세포 플랫폼을 제공할 수 있게 됩니다.

관류 매개변수, 효소 소화 프로토콜, 시약 제형의 체계적 최적화를 통해 이 연구는 성체 쥐 심근세포를 분리하고 배양하는 개선된 방법론을 성공적으로 확립하였습니다. 최적화된 프로토콜은 형태학적 완전성이 잘 보존된 심근세포를 제공하며, 높은 막대 형태 비율과 명확하게 보이는 근절 구조를 특징으로 합니다. 이러한 발전은 심근세포 병태생리를 심층적으로 연구할 수 있는 견고한 실험 플랫폼을 제공하며, 심근 세포 메커니즘에 초점을 맞춘 심혈관 질환 연구를 크게 촉진합니다.

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프로토콜

본 연구의 모든 동물 시술은 데칭 인민병원 윤리위원회가 승인한 기관동물 관리 및 이용 위원회(IACUC) 지침에 엄격히 따라 수행되었습니다. 이 연구는 GemPharmatech Co., Ltd.에서 구입한 8-12주 된 수컷 C57BL/6기 마우스를 사용했습니다. 모든 동물은 SPF 등급의 방벽 시설에 보관되었으며, 환경 매개변수는 국가 기준(실내 온도 22 ± 2°C, 상대습도 50 ± 10%, 12/12시간 빛/어둠 주기)을 충족했습니다. 실험 전반에 걸쳐 이 연구는 "3R" 원칙(대체, 감소, 정제)을 엄격히 준수했으며, 동물의 고통을 최소화하기 위해 마취와 진통을 포함한 표준 절차를 시행했습니다.

참고: 간단히 말해, 온전한 심장은 신속히 쥐 흉강에서 절제되어 Langendorff 장치를 통해 콜라겐제 II 용액으로 역행성 관류하여 세포외기질을 효소적으로 소화합니다. 조직 소화 후 부드러워진 심근은 조심스럽게 단세포 현탁액으로 분리됩니다. 생성된 세포 현탁액은 순차적으로 여과되어 소화되지 않은 조직 조각을 제거한 후, 중력 침전을 통해 생존 가능한 심근세포를 풍부하게 만듭니다. 정제된 심근세포는 이후 실험 응용에 활용될 수 있습니다.

1. 랑겐도르프 관류 장치 준비

참고: 랑겐도르프 시스템의 총 튜빙 부피는 15.5 mL입니다. 심장 관류의 경우 분당 3.5 mL, 시스템 플러싱의 경우 분당 10-15 mL입니다.

  1. 랑겐도르프 관류 시스템을 75% 에탄올 50mL로 세척합니다.
    참고: 멸균을 위해 1M HCl로 매달 유리관 세척을 하세요.
  2. 멸균 ddH2O 250mL로 세척하여 에탄올 잔류물을 제거하고 기포를 제거하세요.
  3. 수욕 온도를 42 °C로 설정하세요. 펌프를 켜서 순환 가열을 시작하고, 서펜타인 튜브의 외부 공간에 따뜻한 물을 채우세요.
    참고: 이 방법은 37°C에서 퍼퓨전이 심장에 도달하도록 보장합니다.

2. 완충 준비

  1. 표 1에 명시된 제형에 따라 크렙스-중탄산염 용액 버퍼(KB), 관류 버퍼(PB), 소화 버퍼(DB), 근세포 플레이트 배양액(MPM), 근세포 배양 배양액(MCM)을 준비합니다.
    참고: 사용 당일에 신선하게 준비하세요.
  2. 얼음 위에 KB 버퍼 10mL를 미리 냉각하세요.
  3. 루멘을 피나비로 채우세요. 유량을 3.5 mL/min로 설정하고 폐수 온도(최적 37 °C)를 측정하세요.
  4. 7mL의 DB(조용한 알코올)를 파이프라인에 플러시한 후 관류 라인을 닫으세요.
  5. 헤파린 나트륨 용액(0.5%, 62.5 KU)을 준비하고 300 μL을 인슐린 주사기에 주입합니다.
  6. 피터록 10mL와 KB 10mL를 두 개의 페트리 접시에 나눠서 얼음 위에 미리 냉장하세요.
  7. 50 mL 원심분리관 뚜껑에 100 μm 세포 체를 놓고, 1 mL KB로 미리 적셔 50 mL 원심분리관 위에 고정합니다.

3. 심장 추출 및 관식 삽입

참고: 이 프로토콜에서는 외부 오염을 최소화하기 위해 멸균 장갑, 기구, 거즈, 면봉을 시술 내내 사용했습니다. 완전 무균 기술은 1차 세포 배양에 필수적이지만, 이 경우에는 세포 분리를 위한 무균 유지보다는 동물 복지와 조직 조직 분석을 위한 조직학적 및 분자 분석을 위한 무결성 유지를 지원하는 역할을 했습니다.

  1. 80 mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨(제약 등급)과 5 IU/g 헤파린 나트륨을 복막 내 주사로 투여하여 마취합니다. 심마취가 이루어질 때까지 면밀히 관찰하세요. 쥐의 발가락을 꼬집고 발가락 꼬집는 반사가 사라지는 것을 관찰하여 마취의 성공을 확인한다.
  2. 제모 크림을 사용해 흉부 털을 제거하세요.
  3. 마우스를 폼보드에 고정시키고 가슴 피부를 75% 알코올로 소독하세요.
  4. 겸자로 흉부 피부를 들어 올리고 상골 돌기에 절개를 하세요.
  5. 상골을 들어 올리고 양쪽으로 갈비뼈를 겨드랑이 부위 쪽으로 절단한 후 횡격막을 완전히 절단합니다.
    참고: 심장을 손상시키지 마세요.
  6. 심장을 완전히 노출시키기 위해 정혈겸자로 흉골과 갈비뼈를 고정하세요.
  7. 혈액을 흡수한 후 조직으로 간을 뒷다리 쪽으로 부드럽게 이동시킵니다. 면봉을 조심스럽게 사용해 심장을 조작해 하대정맥을 노출시키세요.
  8. 준비된 인슐린 주사기를 사용해 하대정맥에 300 μL 헤파린 나트륨 용액(2.5단계에 나오는 것)을 주입합니다.
    참고: 공기 방울 유입을 방지하기 위해 주의하세요.
  9. 흉선 조직을 절제한 후 주변 정맥과 동맥을 절단하세요. 심장을 즉시 미리 냉각된 PB 버퍼로 옮기세요(2.6단계에서).
    참고: 흉선 제거는 대동맥 가시성을 향상시킵니다. 절제 시 대동맥 구간을 보존하세요. 심근 수축은 미리 냉각된 PB 용액으로 느려졌다. 마취 하에 심장 절제는 인도적인 안락사를 달성합니다.
  10. 마이크로포셉을 사용해 대동맥을 잡아 랑겐도르프 관류 시스템의 캐뉼라에 부착합니다. 5-0 실크 봉합사로 고정하세요.
    참고: 이 단계를 빠르게 수행하세요. 심장 장착 시 관류 시스템이 꺼져 있는지 확인하세요.

4. 심장 관류

  1. 관류 시스템을 켜고 2분 30초 동안 타이밍을 시작하세요. 이 기간 동안 폐수는 피터비탄 완충제로 구성되어 수집이 필요하지 않습니다.
  2. 2분 30초 간격이 끝나면, DB 버퍼를 수집하고 재순환시키며 15분 동안 타이밍을 맞춥니다.
    참고: 심근 상태를 모니터링하세요 - 최적의 소화는 조직 탄력 감소와 투명성 증가로 나타난다. 소화가 불완전해 보일 경우 지속 시간을 중간 정도 연장할 수 있으나, 심근세포 손상을 방지하기 위해 총 20분을 초과해서는 안 됩니다.
  3. 시간 제한 후 DB 버퍼에서 PB 버퍼로 전환하고 추가로 4분 30초 관류를 계속합니다. 이 단계의 방류에는 DB 버퍼가 포함되어 있습니다; 거기 가져가.
  4. 최종 타이밍 간격 이후에는 시스템을 종료하여 관류를 종료합니다.

5. 세포 해리 및 정화

  1. 심장을 캐뉼라에서 분리하여 미리 냉각된 KB 버퍼(2.6단계에서 준비됨)로 옮깁니다.
    참고: 효소 소화는 심장을 즉시 KB 버퍼로 옮겨 종료했습니다. 이로 인해 잔류 효소가 빠르게 희석되어 과소화를 방지하고 세포 생존율을 높입니다.
  2. 가는 가위를 사용해 심방 조직과 대동맥 조직을 조심스럽게 절제하고, 심근만 남겨둡니다.
  3. 마이크로포셉을 이용해 심근 조직을 작은 조각(<1 mm3)으로 기계적으로 해리합니다.
  4. 2mL 스포이드를 사용해 조직 조각을 부드럽게 불어내어 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
    참고: 바람을 부는 동안 간상형 심근세포 형태를 보존하기 위해 극도의 주의를 기울이세요. 표준 피펫 팁은 좁은 구경 때문에 세포 무결성을 기계적으로 방해할 수 있으므로 피하세요.
  5. 결과 세포 현탁액을 미리 습윤한 100 μm 셀 스트레이너(2.7단계에서 조립)를 통해 50 mL 튜브로 필터링합니다.
  6. 여과된 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고, 심근세포가 중력 침전(15분, 4°C)에 의해 안정되도록 합니다.
    참고: 15 mL 튜브의 기저 표면적이 줄어들어 50 mL 튜브에 비해 세포 회수 효율이 크게 향상됩니다.
  7. 상청액을 조심스럽게 흡인하고, 2mL 전이용 피펫을 사용해 10mL의 얼음 차가운 KB 완충액에 펠릿 심근세포를 재현탁한 후 침전(15분, 4°C)을 반복합니다.
  8. 5.4-5.7단계를 반복하여 적용에 적합한 온전하고 막대형 심근세포의 정제된 준비물을 얻습니다.

6. 세포 배양

  1. 배양 접시에 10 μg/mL 라미닌을 코팅하고 37 °C에서 2시간 배양합니다.
    참고: 간상형 심근세포의 기계적 손상을 최소화하고 차동 플레이트에 따른 처리 시간을 단축하기 위해, 본 연구는 차동 플레이트 대신 라미닌 코팅을 사용했으며, 이는 세포 부착 효율을 높일 뿐만 아니라 심근세포의 고유한 생리적 특성을 보존하는 전략입니다.
  2. 심근세포를 미리 가열한 4mL(37 °C) MPM에 재현탁합니다. 라미닌 용액을 제거한 후, 코팅된 접시에 심근세포를 씨앗 뿌리세요. 2%CO2 와 함께 37°C에서 1시간 배양하세요. 세포의 형태, 크기, 밀도를 현미경으로 관찰하세요.
  3. 배양 후에는 MPM을 조심스럽게 디캔트하여 미리 가열한 37 °C의 MCM으로 교체하세요. 24시간 동안 27°C에서 2%CO2 로 배양하세요.
  4. 24시간 후에는 심근세포의 구조적 완전성과 형태를 검사합니다.
    참고: 시술 내내 엄격한 무균 기술을 유지하세요.
    주의: 콜라겐제 2형은 호흡기 알레르기, 피부 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하며 먼지를 흡입하거나 피부 및 점막에 닿지 않도록 주의하세요. 버려진 쥐 심장 조직, 혈액 샘플, 그리고 접촉한 일회용 용품은 생물학적 위험 폐기물로 수거되어야 하며, 생물학적 위험 기호가 표시된 전용 누출 방지 용기에 보관해야 합니다. 이 물질들은 이후 중앙집중식 오염 제거 및 폐기 절차를 거칩니다.

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결과

성체 마우스 심근세포의 분리 및 배양 절차는 프로토콜에서 시연되어 있으며, 필요한 기구 및 관 설치는 그림 1에 나와 있습니다. 형태학적 평가 결과, 갓 분리된 심근세포와 1시간 및 24시간 배양된 심근세포 모두 특징적인 막대형 또는 추측형 형태를 보였으며, 뚜렷한 줄무늬가 보였다(그림 2A-C). 24시간 배양된 심근세포에서 심장 트로포닌 T(cTNT)의 면역형광 염색은 높은 세포 순도(그림 2D)와 명확한 근절(그림 2D)을 보여주었으며, 이 방법이 높은 순도와 생존력을 모두 갖춘 심근세포를 얻는다...

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토론

이 연구는 성체 마우스 심근세포 분리 및 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 확립함으로써 심혈관 연구에서 중요한 방법론적 돌파구를 제시합니다. 완충 조성과 효소 소화 매개변수의 체계적 정교화를 통해 이 접근법은 배양 시스템의 신뢰성을 크게 높이고 심근세포의 순도와 생존력을 모두 향상시킵니다. 이러한 기술적 발전은 1차 성인 심근세포를 이용해 심혈관 질환을 모델링할 수 있는 견고한 플랫폼을 제공합니다.

일반적으로 가벼운 소화는 심근세포의 부착과 생존을 촉진하는 반면, 소화 효소의 지나치게 낮은 농도는 조직 해리가 부족할 수 있습니다. 따라서 효소 농도를 최적화하는 것은 효과적인 심장 조직 소화와 심근세포 생존 유지 모두에 필수적입니다. 특정 심근세포 분리 프로토콜12에서는 프로테아제 칵테일(콜라게나제 및 프로테아제 XIV) 사용이 심근세포의 장기 배양 생존율을 감소시키는 것으로 나타...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

중국국가자연과학기금(82400312호)의 재정 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BDM알라딘 과학 공사, 상하이, 중국D111028
BSA알라딘 과학 공사, 상하이, 중국B265994
C57BL/6 마우스  젬파마테크 주식회사8– 12주 된 수컷  
CaCl2알라딘 과학 공사, 상하이, 중국C431202
콜라겐제 II 유형워딩턴 생화학 회사(미국)LS004176LOT#:43D23502    효소 활성 단위: 270u/mg dw
FBS비오타임 바이오테크놀로지, 중국C0226
포도당알라딘 과학 공사, 상하이, 중국D639737
젠장시그마-올드리치H7006
KCl알라딘 과학 공사, 상하이, 중국P112134
KH2PO4알라딘 과학 공사, 상하이, 중국P104075
L-글루타민써모피셔 사이언티브25030081
MEM써모피셔 사이언티브11095080
MgSO4알라딘 과학 공사, 상하이, 중국M116444
Na2HPO4알라딘 과학 공사, 상하이, 중국S274390
나클알라딘 과학 공사, 상하이, 중국C111547
아니2PO4알라딘 과학 공사, 상하이, 중국S108339
NaHCO3알라딘 과학 공사, 상하이, 중국S112338
페니실린-스트렙토마이신 (100배)비오타임 바이오테크놀로지, 중국C0222
프라이모버트 역세포 배양 현미경  칼 자이스
타우린알라딘 과학 공사, 상하이, 중국T103829

참고문헌

  1. Crea, F. The burden of cardiovascular risk factors: a global perspective. Eur Heart J. 43 (30), 2817-2820 (2022).
  2. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circ Res. 119 (8), 909-920 (2016).
  3. Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80 (2), 466-482 (1980).
  4. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  5. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: From developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  6. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  7. Mohamed, T. M. A., et al. Regulation of cell cycle to stimulate adult cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration. Cell. 173 (1), 104-116.e12 (2018).
  8. Wang, W. E., et al. Dedifferentiation, proliferation, and redifferentiation of adult mammalian cardiomyocytes after ischemic injury. Circulation. 136 (9), 834-848 (2017).
  9. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
  10. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357(2014).
  11. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  12. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  13. Dambrot, C., et al. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. J Cell Mol Med. 18 (8), 1509-1518 (2014).
  14. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128 (1), 376-382 (1985).
  15. Zheng, X., et al. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnol Prog. 22 (5), 1294-1300 (2006).
  16. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 357, 271-296 (2007).
  17. Gong, Y., et al. Mitochondrial tumor suppressor 1A attenuates myocardial infarction injury by maintaining the coupling between mitochondria and endoplasmic reticulum. Circulation. 152 (3), 183-201 (2025).
  18. Xiao, C., et al. FMO2 prevents pathological cardiac hypertrophy by maintaining the ER-mitochondria association through interaction with IP3R2-Grp75-VDAC1. Circulation. 151 (23), 1667-1685 (2025).

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