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방법 논문

동물 조직에서 글리코겐 합성효소 효소 활성의 방사화학적 평가

436 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69103

⸱

2025년 10월 24일

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

이 논문에서

요약

동물 조직 분석은 핵 섬광 검출을 활용하여 방사성 표지 포도당이 글리코겐에 혼입되는 것을 측정하여 글리코겐 합성효소의 효소 활성을 결정합니다.

초록

글리코겐은 많은 진핵 세포에 대한 중요한 대사 산물이며 에너지 저장 및 빠른 에너지 방출에 필수적입니다. 분자의 구성은 성장하는 글리코겐 중합체에서 포도당 단위의 순차적 부착을 촉진하는 주요 기능을 가진 고도로 조절된 효소인 글리코겐 합성효소에 의존합니다. 이 효소는 포도당-6-인산염에 의해 알로스테릭적으로 활성화되고 인산화에 의해 여러 부위에서 억제됩니다. 글리코겐 합성효소 효소 활성에 대한 지식은 글리코겐 대사, 근육 에너지 수준, 당뇨병 및 글리코겐 축적 질환과 같은 대사 장애를 이해하는 핵심 구성 요소입니다. 여기에 설명된 것은 방사성 표지된 [14C]-UDP-포도당에서 글리코겐 분자로의 통합 포도당의 양을 측정하여 동물 근육 조직에서 글리코겐 합성효소의 활성을 결정하는 매우 민감하고 효과적인 방법입니다. 이 절차는 방사성 14C를 사용하며 사용 및 폐기를 위한 적절한 승인과 실험실 공간이 필요합니다. 이 절차에는 액체 섬광 계수기에 대한 액세스도 필요합니다.

서론

포도당 단위로 구성된 고도로 분지된 다당류인 글리코겐은 근육, 간, 뇌 등 다양한 조직에서 중요한 에너지 비축 역할을 합니다1. 합성과 분해는 특수 효소와 조절 단백질의 복잡한 시스템에 의해 조정됩니다. 생합성에 필수적인 것은 효소 글리코겐 합성효소(GYS)이며, 그 중 두 가지 이소형(GYS1 및 GYS2)이 있습니다. GYS1은 간 세포가 아닌 포도당에서 글리코겐 생성을 직접적으로 담당하는 조절 효소인 반면, GYS2는 간에서 기능합니다. 당생성으로 알려진 이 과정은 성장하는 글리코겐 사슬에 개별 포도당 단위를 순차적으로 추가하는 과정입니다. GYS는 중간 우리딘 이인산 포도당(UDP-포도당)에서 글리코겐 사슬의 말단으로의 포도당 전달을 촉매하여 알파-1,4-글리코시드 결합을 생성합니다2. 글리코겐 분지 효소와 협력하여 이 반응은 글리코겐 분자를 확장하여 효율적인 에너지 저장 및 방출을 모두 제공합니다.

효소의 활성을 측정하기 위한 분석 기술이 존재하며, 분광 광도계 다양성 3,4로 구성된 보다 일반적인 방법 그룹 중 하나입니다. 이러한 분석은 일반적으로 간접 결합 반응 시스템에 의존하며 340nm에서 다운스트림 생성물인 NADH의 흡광도를 측정합니다. 글리코겐 합성효소에 의해 UDP-포도당에서 자유로워진 UDP의 모든 단위에 대해 1단위의 NADH가 소비되어 글리코겐 합성효소 활성과 직접적인 상관관계가 있는 측정 가능한 흥분을 생성합니다 5,6. 분광 광도법 분석은 상대적으로 저렴하고 접근하기 쉽지만, 간접 반응에 의존한다는 사소한 단점과 시료 탁도에 의한 간섭 및 낮은 감도의 주요 단점이 있으며, 특히 더 작은 시료 또는 인산화된 글리코겐 합성효소가 거의 없거나 높은 시료가 있는 시료의 경우 문제가 됩니다. 위에서 설명한 결합 반응을 사용하는 형광 분석은 인간7 및 마우스8의 근육 조직의 민감도를 개선하기 위해 개발되었습니다. 글리코겐 합성효소를 정량화하기 위한 다른 기술, 예를 들어 면역블로팅9 및 면역조직화학10; 그러나 이러한 기술은 효소의 물리적 양만 정량화할 수 있으며 기껏해야 인산화로부터 활성을 추론할 수 있지만 효소 활성을 직접 정량화할 수는 없습니다11.

이러한 효소 분석 기술 중에서 방사화학적 방법은 샘플 탁도에 의한 간섭이 없고 감도가 높기 때문에 포유류 조직에서 글리코겐 합성효소 활성을 결정하는 데 가장 널리 사용됩니다 8,9. 이러한 분석은 14C12 또는 3H13으로 표지된 UDP-포도당의 방사성 표지 포도당을 글리코겐에 통합하여 설정된 시간 동안 효소 활성을 직접 측정할 수 있습니다. 다음 절차에서, 글리코겐 합성효소를 함유한 조직 샘플을 UDP-포도당 및 글리코겐 프라이머에 노출시킨다. 글리코겐 합성효소는 아래 방정식에 표시된 반응을 촉매합니다.

UDP-[14C]포도당 + (글리코겐)n → (글리코겐)n+1 [14C] + UDP

일정 시간 후, 반응이 종료되고, 방사성 표지된 포도당을 함유하는 글리코겐이 여과지12 (아래에 기술된 바와 같이) 상에 침전되거나, Niederwanger et al.14 에 의해 기술된 바와 같이 겔 여과를 거치고, 섬광 검출기를 사용하여 측정된다. 이 방법은 또한 글리코겐 합성효소의 알로스테릭 활성화제인 포도당-6-인산염(G6P)을 포함하는 별도의 동일한 반응을 포함합니다. 충분한 수준의 G6P가 있는 조건에서 글리코겐 합성효소 활성이 최대로 활성화되어 주어진 샘플의 글리코겐 합성효소 활성에 대한 절대적인 잠재력을 보여줍니다. 여기에 기술된 방법은 Suzuki 및 동료들15 로부터 96-웰 형식으로 수정되었으며 마우스 근육 조직에 사용하도록 최적화되었습니다. 그러나 프로토콜은 다른 조직 및 동물 종에 대해 변경될 수 있습니다.

방사성 물질과 관련된 고유한 비용 및 안전 고려 사항에도 불구하고 방사성 분석은 장비를 사용할 수 있는 경우 비방사성 대안에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 다음 절차는 동물 근육 조직에서 글리코겐 대사의 핵심 효소인 글리코겐 합성효소의 활성을 결정하는 매우 민감하고 강력한 수단을 자세히 설명합니다.

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프로토콜

모든 절차는 볼 주립대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. B6의 남성 및 여성 코호트; 이 원고에서는 생후 3개월의 129-Gaatm1Rabn/J 야생형 마우스를 대표적인 예로 사용한다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 분석 전 준비

  1. 자궁경부 탈구16 에 의해 조직을 채취하고 즉시 액체 N2에서 동결하여 글리코겐 저장을 보존하고 분석이 시작될 때까지 액체 N2 또는 초저온 냉동고에 보관합니다.
  2. 글리코겐 합성효소 분석을 시작하기 전에 원액을 준비합니다(표 1).
  3. 분석에 필요한 복제 마우스 샘플 및 대조군의 수를 결정합니다. 각 마우스 샘플에는 각 반응(G6P의 존재 또는 부재)에 대해 2회씩 총 4번의 반복이 필요합니다( 그림 1 및 표 2 참조).
  4. 크로마토그래피 종이를 4cm 스트립으로 자릅니다. 글리코겐은 이 종이에 부착되어 세탁 과정에서 결합된 상태로 유지됩니다. 종이 분쇄기의 너비(6mm)를 사용하여 크로마토그래피 종이를 얇은 개별 세그먼트로 파쇄합니다.
  5. 연필을 사용하여 지정된 종이 스트립에 마우스 식별, 공백 및 합계로 라벨을 붙입니다. 잉크 사용을 피하십시오.
  6. 크로마토그래피 용지를 나무 블록 템플릿에 넣습니다. 각 템플릿에는 96웰 플레이트의 한 행에 해당하는 최대 12개의 용지가 들어 있습니다.
  7. 크로마토그래피 용지 클램프(클립보드 상단)를 가져옵니다.
  8. 크로마토그래피 용지의 가장자리를 고정하여 반응의 각 행에 대해 하나의 클램프를 준비하고 대부분의 용지 표면적을 노출시킵니다. 레이블이 지정된 가장자리가 표시되는지 확인합니다.
  9. 샘플 식별이 있는 1.7 mL 마이크로분리기 튜브에 라벨을 붙입니다. 샘플당 2개의 튜브; 하나는 균질용이고 다른 하나는 상청액용입니다.
  10. 분석을 시작하기 전에 + 및 - G6P 반응 혼합물을 모두 준비하십시오(자세한 내용은 표 3을 참조하십시오). 각 반응 혼합물의 2,400 μL 분취량을 준비합니다.

2. 방사화학적 글리코겐 합성효소 활성 반응

주의 : 이 단계에는 방사성 물질인 [14C]-UDP-포도당의 사용이 포함됩니다. 원자력 규제 위원회(NRC)에서 승인한 방식으로 취급, 보관 및 폐기하십시오.

  1. 0.0012 μCi/μL의 최종 농도를 위해 두 (+/- G6P) 반응 혼합물의 2,400 μL 분취량에 30 μL의 [14C]-UDP-포도당(0.1 μCi/μL)을 첨가합니다. 이 레시피는 18개의 샘플에 적합합니다.
    참고: [14C]-UDP-포도당의 부피는 사용량을 절약하고 적절한 감도를 보장하기 위해 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 뇌 조직에는 50μL, 마우스 심장에는 25μL를 사용합니다.
  2. 와류 반응 혼합물을 분취하고 샘플, 블랭크 및 총계를 보유할 96웰 플레이트의 각 웰에 50μL를 분취합니다(표 2). 그런 다음 플레이트 필름으로 덮고 4C에 놓습니다.
  3. 프로테아제 억제제를 실온에서 해동하도록 설정합니다. 이러한 억제제는 추가 정보와 함께 표 4에 항목화되어 있습니다.
  4. 30-50mg의 냉동 조직을 덩어리로 배출합니다. ~30mg은 골격근 및 심장 샘플에 최적입니다. 뇌에 ~50mg. 조직과 미세분리기 튜브를 액체 N2에 보관하고 조직이 동결된 상태로 유지되도록 조직의 무게를 빠르게 측정합니다. 식힌 유봉을 사용하여 조직을 더 갈아줍니다.
  5. 얼음 위에 프로테아제 억제제로 균질화 완충액을 준비합니다.
  6. 한 번에 하나의 샘플, 조직이 담긴 튜브를 액체 N2에서 콜드 캡이 있는 얼음으로 1분 동안 옮깁니다. 액체 N2에 있는 동안 콜드 캡(액체 N2에서 냉각된 세 개의 작은 구멍이 있는 튜브 캡)을 샘플 튜브에 추가합니다. 이는 튜브에 남아 있는 액체 N2가 증발함에 따라 조직 손실을 방지합니다. 액체 N2에서 나오면 샘플은 얼음 속에 남아 있어야 합니다.
  7. 얼음 위에 오르면 균질화 완충액의 부피(10-30 μL/mg)를 샘플에 추가하고 Tissue-Tearor로 샘플을 균질화합니다. 이 두 단계를 완료한 후 다음 샘플로 이동합니다.
    참고: 샘플에 추가되는 완충액의 양은 조직의 공급원에 따라 최적화될 수 있습니다. 예를 들어, 골격근의 경우 30 μL/mg, 심장의 경우 15 μL/mg, 뇌의 경우 10 μL/mg입니다.
  8. 3,600g에서 4°C에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상청액을 깨끗한 미세분리기 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 만지지 않도록 주의하십시오. 소용돌이치고 얼음 위의 v-바닥 96웰 플레이트의 해당 웰에 ~150 μL를 추가합니다. Bradford 분석을 위해 나머지를 상청액으로 저장합니다(2.15단계 참조).
    참고: 원하는 경우 면역블로팅과 같은 이후 분석을 위해 추가 샘플 분취량을 저장할 수 있습니다.
    주의 : 2.9-2.14단계에서는 14C를 처리해야 합니다. NRC가 승인한 방식으로 모든 오염된 물질을 폐기하십시오.
  9. 반응 믹스 플레이트를 4°C에서 제거하고 필름을 제거한 상태에서 열순환기에서 30°C로 가열합니다. 이 시간 동안 -20°C 66% 에탄올 1L를 얻고 교반판에 교반봉을 사용하여 세척 비커에 첨가합니다.
  10. 반응 웰에 25 μL의 샘플 상청액을 첨가하고 블랭크 및 전체 웰에 균질화 완충액 25 μL를 첨가하여 반응을 시작합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 반응 플레이트의 한 번에 1줄에 추가하고 행 사이에 최소 1분 동안 기다립니다. 각 행에 대해 반응이 시작된 시간을 기록합니다. 자세한 내용은 표 2를 참조하십시오. 다중 채널 피펫을 사용하고 동일한 양의 액체가 추가되었는지 확인하십시오.
  11. 반응이 실행될 때까지 10-15분 동안 기다립니다. 그러나 런타임은 행 간에 동일해야 합니다.
  12. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 55μL를 흡인하고 이전에 준비한 각 크로마토그래피 용지에 분배합니다. 흡인 전에 위아래로 피펫팅하여 반응을 혼합합니다. 크로마토그래피 용지 중앙에 액체를 발견합니다.
  13. 우물에서 액체를 발견한 후 집게를 사용하여 클램프에서 총계가 있는 종이를 제거합니다. 알루미늄 호일 위에 놓아 안전하게 건조할 수 있습니다. 다른 모든 크로마토그래피 용지를 교반하는 66% 에탄올 수조에 떨어뜨립니다. 글리코겐은 66% 에탄올에 녹지 않는 반면 [14C]-UDP-포도당은 용해성이며 크로마토그래피 종이를 씻어냅니다.
  14. 반응판의 각 행에 대해 2.11단계와 2.12단계를 반복합니다. 반응의 시작 및 중지 시간을 기록하여 각 행의 반응 시간이 동일한지 확인합니다.
  15. 교반하는 66% 에탄올에 모든 행을 첨가하면 15분 동안 세척합니다.
    참고: 이 단계 및 후속 세척 단계 동안 효소 활성을 계산하는 데 필요한 정규화를 위한 단백질의 총 부피를 결정하는 Bradford 분석과 같은 보완 분석을 위해 샘플 분취량을 준비할 수 있습니다.
  16. 크로마토그래피 용지를 잃지 않고 66% 에탄올을 폐기하십시오. 새로운 66% 에탄올 1L로 30분 동안 세척합니다. 이 66% 에탄올은 실온에서 사용할 수 있습니다.
  17. 총 30분 66% 에탄올 세척을 3회 반복합니다.
    참고: 원하는 경우 최종 세척 단계의 66% 에탄올을 저장하고 후속 분석을 위해 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  18. 66% 에탄올을 제거한 후 세척 비커의 모든 크로마토그래피 용지를 아세톤에 담그십시오. 아세톤은 건조 과정을 촉진합니다.
  19. 아세톤에서 크로마토그래피 용지를 제거하고 알루미늄 호일 위에 놓습니다. 아세톤을 보관하거나 폐기하십시오.
  20. 열 램프 아래에서 15분 동안 크로마토그래피 종이를 건조시킵니다.
    알림: 마른 종이는 무기한 보관할 수 있습니다. 용지는 섬광 감지를 진행할 준비가 될 때까지 안전하게 보관할 수 있습니다.

3. 섬광 감지로 활동 측정

  1. 집게를 사용하여 크로마토그래피 용지를 섬광 선반에 보관된 섬광 유리병으로 옮깁니다. 샘플 용지의 방향을 기록합니다.
  2. 뚜껑 펌프를 사용하여 각 바이알에 5mL의 섬광유를 추가합니다. 각 바이알의 캡을 조입니다.
  3. 샘플을 섬광 검출기에 넣고 샘플 뒤에 정지 트랙을 로드합니다. 모니터링 프로그램 14C가 선택되어 있는지 확인하십시오. 자동 계산을 선택하여 감지를 시작합니다.
  4. 결과 인쇄
  5. 섬광관과 내용물은 NRC가 승인한 방식으로 폐기하십시오.

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결과

프로토콜에 따라, 섬광 검출기에서 생성된 인쇄물에는 글리코겐 합성효소의 활성 수준과 직접적인 상관관계가 있는 바이알을 포함하는 각 크로마토그래피 용지에서 방출되는 측정된 이온화 방사선의 양이 포함됩니다. 섬광 검출기는 설정된 시간 동안 각 샘플, 블랭크 및 총계에 대해 감지된 방사선의 분당 수(CPM)를 계산합니다. 먼저 CPM을 DPM(분당 붕괴수)으로 변환하는데, 이는 사용된 섬광 카운터의 효율(DPM=CPM/효율)을 기반으로 합니다. 효율성은 알려진 DPM이 있는 표준 소스를 계산하여 결정됩니다. 효소 활성을 계산하는 방정식은 다음과 같습니다.

[샘플 평균 DPM/2.2 x 10^6] [총 분석 부피(75 μL)/크로마토그래피 용지에 발견된 부피(55 μL)] x (1/특정 활성) x(분석 배양 1분) x (1/mg 단백질) x(1000 nmol/μmol)

비활성은...

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토론

글리코겐 합성효소 효소 활성의 측정은 다양한 대사 및 질병 상태에서 글리코겐 대사를 모니터링하는 데 유용한 도구입니다. 포도당-6-인산염(G6P)의 부재 및 존재 시 측정은 효소의 조절 상태와 인산화 상태의 간접 지표에 대한 통찰력을 제공합니다. [U-14C]-UDP-포도당 혼입 분석은 글리코겐 합성효소 효소 활성을 측정하기 위한 효율적이고 잘 문서화된 기술로, 마우스 골격근과 같은 작은 조직 샘플에 대한 높은 감도, 기질 특이성 및 적응성을 제공합니다. 이 기사에서는 쥐 근육 용해물에서 GYS1 활성을 정량화하는 동시에 다른 효소 분석과 비교하여 기술적 강점 및 광범위한 사용과 관련된 고려 사항을 강조하기 위해 서면 절차를 최적화합니다.

이 기술은 성공적인 구현을 위해 몇 가지 고려 사항이 필요합니다. 조직 균질화는 불완전한 용해 또는 다양한 단백질 수율로 인해 효소 활성 정상화에 아티팩트가 발생할...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

자금은 Ball State University, Indiana University School of Medicine-Muncie 및 Aro Biotherapeutics에서 부분적으로 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
[14C] 우리딘 5-디포스포-포도당미국 라디오 표지 화학ARC 0154
31 ETCHR 크로마토그래피 용지왓맨3031 915
벤자미딘 하이드로클로라이드 하이드레이트시그마B6506
베타 머캅토에탄올시그마M3148
건조 목욕토리 파인스 사이언티브SC25
에탄올 (200 프루프)팜코아퍼111000200
에틸렌 글리콜 사세트산 (EGTA)시그마E4378
에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA)시그마E5134
포도당-6-인산염 나트륨 염시그마G7879
토끼 간에서 나온 글리코겐(제3형)시그마G8876
마이크로플레이트, 평바닥, 96 우물그라이너655101
마이크로플레이트, PCR, 96 웰닷 사이언티픽951-PCR
다목적 섬광 계수기벡먼 쿨터LS 6500
불화칼륨 이수화물시그마221872
프로테아제 억제제 칵테일골드바이오GB-108-2
섬광 칵테일리서치 프로덕츠 인터내셔널111195
섬광 바이알리서치 프로덕츠 인터내셔널125509
불화나트륨시그마S7920
티슈 티어러바이오스펙 제품모델 398
토실리신 클로로메틸 케톤(TLCK)시그마T7254
트리즈마 기지 (99.9%)시그마T1503
트리즈마 하이드로클로라이드시그마T3253
우리딘 5-디포스포-포도당시그마U-4625

참고문헌

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  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).

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UDP6
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