방법 논문

쥐 무릎 아래 절단 모델 및 즉각적인 표적 근육 재신경

DOI:

10.3791/69119

⸱

2026년 5월 22일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 쥐에서 무릎 아래 절단을 수행하는 방법과 즉시 표적 근육 재신경 운동(iTMR)을 수행하여 절단 관련 통증 치료 및 예방 전략을 조사하고 절단과 관련된 통증 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 방법을 시연합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

절단 관련 통증은 환자의 삶의 질을 저하시키고, 오피오이드 사용을 촉진하며, 기능적 재활과 보철물 사용을 줄일 수 있습니다. 절단 후 통증을 신뢰성 있게 발생시키면서도 이동성을 유지하는 전임상 모델은 이러한 결과의 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다. 여기서는 Sprague-Dawley 쥐를 이용한 상세하고 재현 가능한 설치류 수술 프로토콜을 제시하여 무릎 아래 뒷다리 절단을 모델링합니다. 이 시술은 경골신경, 일반 비골신경, 설신경을 포함한 좌골신경 가지를 분리하고 절단하여 지속적인 절단 후 신경 병리와 통증 관련 행동을 유발합니다. 쥐는 이 시술에서 잘 회복하며 수술 직후 먹거나 마시는 데 어려움 없이 걸을 수 있습니다. 동물은 이후 반사적이고 자발적인 통증 측정으로 평가할 수 있습니다. 이 시술로 인한 통증 행동은 시간이 지남에 따라 견고하며, 절단 부위에서 표준 반사적 통증 행동을 얻을 수 있습니다. 중요하게도, 보존된 이동성은 운동 장애를 혼란시키지 않고 종단적 행동 검사를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 절단에 초점을 맞추고 있지만, 절단된 신경을 대퇴이두근과 반막근의 근접 운동 가지에 연결하여 절단된 신경 교정과 절단 후 통증에 미치는 영향을 조사하는 등 표적 근육 재신경 개입(TMR)을 포함하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 우리는 이전에 이 모델을 성공적으로 사용하여 절단 후 통증 행동의 성별 차이를 평가하고 TMR의 효과를 연구한 바 있습니다. 이 프로토콜은 절단 관련 통증, 신경종 형성 및 기능적 결과를 연구할 수 있는 견고하고 유연한 플랫폼을 제공하며, 절단 후 통증 개선을 목표로 하는 번역 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만성 통증은 주요 사지 절단 후 가장 쇠약해지는 합병증 중 하나로, 환자의 최대 70%에 영향을 미칩니다. 1,2,3. 약물 치료, 물리치료, 신경 차단, 심리 치료와 같은 전통적인 통증 관리 전략은 제한적이거나 일시적인 완화를 제공하는 경우가많습니다. 따라서 효과적인 장기 통증 관리 전략에 대한 임상적 필요성이 여전히 큽니다.

근전기 보철물 제어를 강화하기 위해 처음 개발된 표적 근육 재지신경 요법(TMR)은 사지 절단 후 통증 완화에 유망한 방법으로 떠올랐습니다. 수술 기법은 횡단된 혼합 운동 감각 신경을 인근 운동 가지로 재배치하는 것을 포함합니다. 임상적으로 TMR은 환상 지통, 잔여 사지통, 신경종 관련 증상 6,7,8에서 상당히 감소하는 것을 보였습니다. 재생 말초 신경 인터페이스(RPNI)는 신경 손상 및 절단 관련 통증에 사용되는 또 다른 외과적 개입입니다. 절단된 신경 말단은 자유(탈신경, 무신경) 근육 이식에 꿰매 후 감싸집니다9. 절단된 축삭은 탈신경화된 신경근 접합부를 신경화시켜 이식편 내 근육 수축을 만들어 근전합부 조절 신호를 생성할 수 있습니다. TMR과 달리, RPNI는 설치류 모델에서 광범위하게 연구되어 왔습니다. TMR과 유사하게, RPNI는 신경종 형성을 예방하고 신경 절단 손상과 관련된 통증을 줄이는 것으로 나타났습니다 10,11. 임상적으로 RPNI는 절단 환자의 환상 통증과 잔여 사지통을 모두 감소시키는 것으로 나타났습니다12.

임상적으로 채택되었음에도 불구하고, TMR과 RPNI의 진통 효과의 생물학적 기전은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 전임상 모델은 이러한 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다. 이전 연구에서는 신경 절단 모델을 변형하여 신경을 표면화하여 신경종 통증을 직접 검사한 바 있습니다10,11. 이 모델들은 직접 자극을 통한 신경성 통증과 발에 남아 있는 신경 분포의 척추 반사 행동을 평가하여 신경병성 통증을 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, 보존된 신경 손상은 설문신경을 유지하고, 경골신경과 총비골신경은 절단됩니다. 통증 행동 검사는 측면 발13에 대해 수행됩니다. 후肢 절단 모델은 사지에 가장 심각한 부상을 입히는 경우를 나타냅니다. 따라서 광범위한 신경 손실과 그러한 부상과 관련된 상당한 염증 및 치유 요구가 존재합니다. 신경 손상이 발생했을 때, DRG 내의 건강한 뉴런들이 손상된 뉴런을 유지하는 데 도움을 줍니다. 절단 수술로 인해 건강한 뉴런의 개체수가 크게 줄어들고, 손상된 신경 하나당 단일 신경만 손상되었을 때보다 더 큰 신경 손실이 발생합니다14, 15, 16. 설치류 후지 절단 수술 생존 사례는 드물다17,18. 그러나 상지 절단에 비해 좌골신경과 관련된 통증과 재생을 연구한 풍부한 과거 데이터, 그리고 여러 가지 외래 행동 검사 등 장점도 있습니다19,20.

이 격차를 해소하기 위해 우리는 최근 즉각적인 TMR을 포함하는 쥐 후다리 절단 모델을 개발했습니다(그림 1). RPNI 생성 기술은 이전에 발표되었으며 후肢절단 모델에 적용할 수 있습니다. 이 모델은 임상 절차와 매우 유사하여 다양한 통증 행동, 신경종 형성, 신경세포 보존을 평가할 수 있게 합니다(그림 2)22. 우리의 연구는 TMR이 표준 절단보다 유의미한 진통 효과를 보여주었으며, 신경종 예방에 효과가 있으며, 추위 민감성에서 성적 이형성 반응을 보였습니다22,23.

여기 제시된 프로토콜은 수술 기법의 상세하고 표준화된 시각적 시연을 제공하여 실험적 접근법의 재현성과 일관성을 보장합니다. 신경 분리, 정밀 절개, 긴장 없는 신경 결합 등 주요 단계를 명확히 설명함으로써, 이 프로토콜은 TMR 매개 진통과 신경종 예방의 기전을 연구자들에게 신뢰할 수 있는 틀을 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 하며, 미국 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드를 준수해야 합니다.

1. 수술 전 준비

참고: 8주에서 10주 동안 몸무게 250–300g인 수컷과 암컷 스프래그-도울리 쥐(찰스 리버 연구소)가 사용되었습니다.

  1. 보열 패드를 켜고 멸균 수술장을 준비하세요. 최적의 노출을 위해 쥐 몸에 수직으로 멸균 패드를 설치하세요.
  2. 모든 수술 도구와 재료를 준비하세요: 멸균 생리식염수(0.9% 염화나트륨), 포비돈-요오드 소독제, 멜록시캄, 지혈, 10-0 미세 봉합사, 4-0 흡수성 꼬임 봉합사, 자, 피부 접착제.
    참고: 모든 수술 도구는 오토클레이빙 또는 핫 비드 멸균으로 멸균되어야 합니다.
  3. 쥐를 4% 이소플루란, 분당 10리터 산소, 60% 공기가 들어간 유도 챔버에 넣어 마취를 유도합니다. 4분 후 또는 반응이 없으면 코 콘으로 전환하고 쥐 크기에 따라 이소플루란 함량을 1.5%에서 2.0%로 조절합니다.
  4. 허리 아래쪽부터 뒷다리 전체까지 수술 부위를 면도하세요. 포비돈-요오드 소독액과 알코올 면봉을 번갈아 사용해 삼중 준비를 시행하고, 마지막에는 알코올로 마무리합니다.
  5. 1 mg/kg을 투베르쿨린 주사기(보통 200g 쥐의 경우 0.2 mL)를 피하 투여합니다.

2. 무릎 아래 절단 (그림 1)

  1. 자로 무릎 관절선을 표시하고, 무릎 2cm와 3cm 지점에 두 개의 추가 표시를 남기세요.
  2. 무릎에서 3cm 떨어진 곳에 메스를 사용해 원형 피부 절개를 하세요.
  3. 무딘 세리를 사용해 피부를 원형 방향으로 아래 근육과 분리하여 근육이 자유롭게 후퇴할 때까지 진행하세요.
  4. 이 밑 근육을 반복하여 뼈까지 조심스럽게 해부하면서 조직면을 보존하세요. 멸균 소작기나 마커로 경골/비골을 원치 절개 부위 1cm 지점에 표시하세요.
  5. 작은 뼈 가위로 표시된 위치의 경골과 비골을 절단하세요. 지혈을 위해 소작을 사용하세요. 뼈 끝에 날카로운 모서리가 있는지 살펴보고 필요에 따라 무딘 부분이나 다듬어도 됩니다.
  6. 4-0 흡수성 땋은 봉합선을 사용해 앞뒤 근육 구획을 뼈 위에 함께 닫아 근육 패드를 만듭니다. 먼저 경골, 즉 주요 압박점인 앞가장자리를 봉합하는 것부터 시작하세요. 일반적으로 4–6개의 중단 봉합이 사용됩니다.
  7. 피부를 측면으로 단단히 봉합하며, 체중 부하 절단 부위에 직접 부착하지 않도록 합니다. 절개 부위에 피부 접착제를 붙이세요.

3. TMR 중재 수술 (그림 1)

  1. 대퇴골 뒤쪽 약 5mm 지점에 1.5–2cm 길이의 둔근 분할 절개를 합니다.
  2. 둔탁한 박리술을 사용해 둔근과 햄스트링 근육을 분리하여, 좌골신경이 경골, 일반 비골신경(CP), 설음신경으로 삼각되는 지점 바로 근처를 노출시킵니다.
  3. 근위 운동 가지를 식별하라: 한 개의 큰 가지는 꼬리대퇴근(CFM) 아래를 지나며, 이 가지는 CFM, 반막근(SM), 그리고 대퇴이두근(BF)으로 발전한다.
  4. 면봉으로 CFM을 들어 올려 나누세요. SM과 BF 가지를 미세수술용 미세한 Dumont 겸자를 이용해 둔한 해리로 조심스럽게 신경분해합니다.
    1. 겸자를 사용해 신경상막을 잡고, 가늘게 굽은 스프링 가위로 신경막을 열어 세로로 나누어 서로 다른 가지를 분리합니다.
    2. CFM 지류는 보존하고 나머지는 좌골신경통 근처에서 나누세요. 곡선 운동은 하위로 가지하여 결합을 촉진합니다.
  5. 신경상막을 열어 미세한 곡선 가위로 분리하여 좌골신경 삼중 분열을 신경분해합니다. 가느다란 겸자로 신경 가지를 부드럽게 벌려 주세요. 삼분기에서 5–10mm 떨어진 세 가지 가지(경골, 경골, 흉측)를 겸자로 잡으세요.
  6. 장력을 걸고 각 신경을 가능한 한 먼 쪽으로 절단하세요. 절개 끝을 잡고 최소 5–10mm 절제 하여 근위 끝까지 깔끔하게 절단합니다.
  7. 10-0 나일론 봉합사로 결합 수술을 수행하세요: CP에서 SM까지는 한 봉합사로, 경골 부근은 큰 BF 가지에 1에서 2개의 봉합사로, 설랄은 작은 BF 가지까지 1개의 봉합사로 진행합니다. 봉합사당 최소 3개의 매듭을 사용하고, 긴장이 없는 위치로 하며, 신경이 주름이 생길 정도로 조이지 않고, 관절을 날카로운 각도 없이 배치하세요.

4. 절단 전용 그룹

  1. 5-0 실크 봉합사로 뇌뇌막, 경골, 비음신경을 결찰합니다. 듀몽 봉합 겸자로 실크를 만지세요. 결박이 신경을 주름지게 하고 4개의 정사각형 매듭으로 고정되도록 하세요.
  2. 매듭을 이용해 각 신경을 근위부에서 부드럽게 당기고, 결실에서 1–2mm 떨어진 곳을 횡단합니다. 원위 신경 분절 10mm를 제거하세요.
  3. 2절에 자세히 설명된 절단 수술을 진행하세요.

5. 수술 후 관리

  1. 쥐를 데운 우리에 넣어 보행 가능할 때까지 보관하세요. 24시간 후에 두 번째 멜록시캄 용량(0.2 mL)을 피하 투여하세요.
  2. 상처 상태, 감염 징후, 통증 또는 고통을 매일 관찰하고, IACUC 지침에 따라 필요시 개입하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 후다리 절단 모델은 쥐의 보행 및 탐색 능력을 유지하면서 신경병성 통증 관련 행동을 신뢰성 있게 유도했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 원위 표적 없이 절단 시 말초신경이 절단되면 B-튜불린 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 면역염색으로 결합 부위의 축삭 성장과 신경종 형성이 불규칙하게 나타납니다. 반면, TMR로 치료받은 절단된 신경은 수혜기 가지로 조직적인 축삭 성장을 보였으며, 운동(B-튜불린)과 감각(CGRP) 축삭이 모두 존재하여 성공적인 재신경 신경과 신경종 유사 형태의 부재를 보였다.

행동 검사에서는 절단 후 안정적이고 장기적인 통증 관련 행동이 나타났습니다. 폰 프레이 검사에서 측정된 기계적 철회 임계치는 기저선에서 유의하게 감소했으며, 절단 후 시점에서도 감소한 상태를 유지하여 지속적인 기계적 과민성을 시사합니다(

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 후肢 절단 모델의 재현성을 보장하기 위한 필수 수술 단계를 상세히 설명하며, 절단 후 검사에서 보행 및 행동 참여의 보존을 보여줍니다. 신중한 해부학적 식별, 최소한의 신경 조작, 절개된 신경의 긴장 없는 처리 등 주요 수술 원칙이 강조되어 외과의사 간 일관성과 재현성을 보장합니다. 이러한 기술적 고려사항은 절단 후 신경병리를 신뢰성 있게 유도하고 수술 외상과 관련된 의도치 않은 변동성을 최소화하는 데 매우 중요합니다.

절단 중 말초신경 절단은 절단 후 개입이 없을 때 축삭 재생과 신경종 형성을 불규칙하게 만듭니다. 이 모델에서 보듯, 절단은 기계적 및 냉기 과민성 등 지속적인 통증 관련 행동을 유발하는 반면, 동물은 보행 능력을 유지했으며, 이는 OFT와 EPM에서 입증되었습니다. 불안과 통증 관련 보행 영향의 관계는 중재를 통해 더 자세히 밝혀져야 하지만, 현재로서는 이 검사들이 보행 능력을 보여줍니다...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 위스콘신 의과대학 신경과학 연구센터, 리타 앨런 재단, 성형외과 재단의 지원을 받았습니다. 저자들은 동물 관리와 지원에 대해 비교의학 부서에 감사를 표합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13미세 신경 결합 봉합사. 10-0 마이크로 봉합사. 
4-0 polyglycolic acid sutureEthiconAQ1268근육 및 피부 폐쇄 봉합사. 흡수성 4-0 봉합사. 
5-0 silk surgical sutureGenericGeneric신경 결찰 봉합사
Adult Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesGeneric실험용 동물
Alcohol prep padsDukal CorporationGeneric피부 소독
Betadine 10%Avrio Health LPGeneric소독제
Bone scissorsFST16030뼈 절단 도구
Cautery deviceFST18010-00지혈 장치
Cotton tip applicator (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100조직 조작
Curved microdissector scissorsFST15019-10신경 용해를 위한 미세 가위
Forceps (fine Dumont)FST11254-20신경 취급 도구
Forceps (suture tying Dumont)FST11063-07봉합사 취급 도구
Gauze USP type VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146멸균 환경 유지
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)GenericTC1000온도 제어 장치
Induction chamber (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.Generic마취 유도용
Isoflurane (Isospire)PhoenixGeneric마취제
Meloxicam (Ostilox)VetONE5 mg/mL진통제
RulerGenericGeneric해부학적 랜드마크 측정 도구
Sterile salineBaxter0.9 Sodium Lot Y425131관개 용액
Surgical blade 15 FST10015-00피부 절개 도구
Tuberculin syringeGenericGeneric약물 투여
Vaporizer (Surgivet model 100)SurgivetModel 100 S/N W2211123마취 유지용
Vetbond tissue adhesiveWorld Precision InstrumentsGeneric피부 접착제

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balakhanlou, E., Webster, J., Borgia, M., Resnik, L. Frequency and severity of phantom limb pain in veterans with major upper limb amputation: results of a national survey. PM R. 13 (8), 827-835 (2021).
  2. Resnik, L., Ekerholm, S., Borgia, M., Clark, M. A national study of veterans with major upper limb amputation: survey methods, participants, and summary findings. PLoS One. 14 (3), e0213578(2019).
  3. Ephraim, P. L., Wegener, S. T., MacKenzie, E. J., Dillingham, T. R., Pezzin, L. E. Phantom pain, residual limb pain, and back pain in amputees: results of a national survey. Arch Phys Med Rehabil. 86 (10), 1910-1919 (2005).
  4. R, L., et al. Prosthesis satisfaction in a national sample of veterans with upper limb amputation. Prosthet Orthot Int. 44 (2), 81-91 (2020).
  5. Kuiken, T. A., et al. Targeted muscle reinnervation for real-time myoelectric control of multifunction artificial arms. JAMA. 301 (6), 619-628 (2009).
  6. Valerio, I. L., et al. Preemptive treatment of phantom and residual limb pain with targeted muscle reinnervation at the time of major limb amputation. J Am Coll Surg. 228 (3), 217-226 (2019).
  7. Chang, B., Mondshine, J., Attinger, C., Kleiber, G. Targeted muscle reinnervation improves pain and ambulation outcomes in highly comorbid amputees. Plast Reconstr Surg. 148 (2), 376-386 (2021).
  8. Dumanian, G. A., et al. Targeted muscle reinnervation treats neuroma and phantom pain in major limb amputees: a randomized clinical trial. Ann Surg. 270 (2), 238-246 (2019).
  9. Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (12), e1038(2016).
  10. Dehdashtian, A., et al. Sexually dimorphic pattern of pain mitigation following prophylactic regenerative peripheral nerve interface (RPNI) in a rat neuroma model. Neurosurgery. 93 (5), 1192-1201 (2023).
  11. Senger, J., et al. A direct comparison of targeted muscle reinnervation and regenerative peripheral nerve interfaces to prevent neuroma pain. Neurosurgery. 93 (5), 1180-1191 (2023).
  12. Kuniak, C. A., et al. Prophylactic regenerative peripheral nerve interfaces to prevent postamputation pain. Plast Reconstr Surg. 144 (3), 421e-430e (2019).
  13. Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
  14. Hu, P., McLachlan, E. M. Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats. J Neurosci. 23 (33), 10559-10567 (2003).
  15. Welin, D., et al. Survival and regeneration of cutaneous and muscular afferent neurons after peripheral nerve injury in adult rats. Exp Brain Res. 186 (2), 315-323 (2008).
  16. Jivan, S., Novikova, L. N., Wiberg, M., Novikov, L. N. The effects of delayed nerve repair on neuronal survival and axonal regeneration after seventh cervical spinal nerve axotomy in adult rats. Exp Brain Res. 170 (2), 245-254 (2006).
  17. Garg, R., Uygur, S., Cwykiel, J., Siemionow, M. Development of targeted muscle reinnervation model in hind limb amputated rats. J Reconstr Microsurg. 34 (7), 509-513 (2018).
  18. Lago, N., Navarro, X. Evaluation of the long-term regenerative potential in an experimental nerve amputee model. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 108-120 (2007).
  19. Hogan, Q. Animal pain models. Reg Anesth Pain Med. 27 (4), 385-401 (2002).
  20. Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nat Rev Neurosci. 23 (2), 70-85 (2022).
  21. Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) in the adult rat. J Vis Exp. (156), e60841(2020).
  22. Zepeda, J. L., Mraz, G., Roth, E., Weihrauch, D., Hoben, G. Rat hindlimb amputation model shows analgesia and sexually dimorphic cold hypersensitivity with immediate targeted muscle reinnervation. J Pain. 33, 105460(2025).
  23. Roth, E., et al. Targeted muscle reinnervation prevents and reverses rat pain behaviors after nerve transection. Pain. 164 (2), 316-324 (2023).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

동영상 곧 제공

관련 논문