시험관 내 상피 오가노이드-T 세포 공동 배양 시스템을 이용한 상류 기억 CD8 T 세포 분화

요약

CD8 T 세포의 분화 및 기능을 시험 관 내에서 연구하기 위해, CD8 T 세포를 마우스에서 분리하여 기존에 형성된 감염된 쥐 질 상피 유기체와 장기간 공동 배양할 수 있습니다. 여기서는 이 과정을 설명하고 공동 배양 시 상주 기억 T 세포 표지자의 획득을 평가합니다.

초록

장벽 점막 조직은 거주 T 세포의 분화와 기능에 중요한 역할을 합니다. 이 조직들 내 다양한 세포 집단 중에서 상피 세포는 T 세포 분화의 핵심 동인입니다. 그러나 점막 환경에서 T 세포 생물학을 형성하는 상피 유래 신호에 대한 이해는 구체적인 도구 부족과 사용 가능한 모델 시스템의 복잡성 때문에 제한적입니다. 여기서는 감염된 상피와 바이러스 특이적 CD8 T 세포 간의 동적 상호작용을 모델링하는 쥐 질 상피 오가노이드-CD8 T 세포 공동 배양 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜은 생리학적으로 중요한 3차원 상피 미세환경 내에서 T 세포 반응의 표현형 및 기능적 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템을 사용하여 효과자 CD8 T 세포가 조직 상주 기억 T 세포(TRM)로 분화하는 과정을 입증했습니다. 이 다목적 시험관 배양 시스템은 CD8 T 세포 분화 뒤에 있는 상피 단서의 분자적 세부사항을 연구할 수 있는 환원주의적 기회를 제공하며, 이는 장벽 장기에서 보호 면역과 면역병리를 조절합니다.

서론

CD8 상주 기억 T 세포(TRM)는 혈액 및 림프구 조직을 통해 순환하지 않고 말초 조직에 영구적으로 남아 있는 독특한 기억 CD8 T 세포 집단을 대표합니다. 이 TRM 세포들은 피부, 폐, 장, 생식관 등 장벽 기관에 전략적으로 배치되어 병원체와 신생 종양에 대한 감시자 역할을 합니다 ^1,2. 병원체가 검출되면 CD8 TRM 세포는 감염된 세포를 직접 제거하기 위해 세포독성 과립을 빠르게 방출하고, 동시에 염증성 사이토카인을 분비하여 주변 조직 세포에 경고하고 순환 면역 효과를 동원하여 병원체 확산을 억제합니다 ^3,4. CD8 TRM의 항병원체 면역 및 암 면역치료의 효과는 이미 입증되었습니다 ^5,6. 따라서 기능적으로 적합한 CD8 TRM을 장벽 점막 조직에 풍부하게 배치하는 것은 백신과 면역치료 전략의 중요한 목표입니다.

말초 장기에서 CD8 TRM의 형성과 유지는 국소 조직 특이적 프로그래밍에 매우 의존적입니다. 이러한 국소 환경 신호에는 독특한 조직 유래 사이토카인과 대사 인제, 그리고 조직 특이적 TRM 정체성을 강화하는 세포 간 상호작용이 포함됩니다 ^7,8,9. 이 조직 프로그래밍은 TRM이 면역감시 임무 수행 시 조직 특이적 요구에 적응할 수 있게 합니다. 그러나 이러한 상호작용의 본질에 대한 이해는 불완전하며, 이는 이러한 과정을 충실히 포착하는 견고한 모델 시스템이 부족하기 때문입니다. 소동물 모델은 매우 유익하지만, 종종 매우 상호 연결되고 복잡한 상호작용의 네트워크를 겪어 빠른 고처리량 연구를 방해합니다.

여기서는 CD8 TRM 분화의 상피세포 유래 단서의 분자 세부사항을 조사할 수 있는 마우스 모델의 시험 관 내 대안을 설명합니다. 활성화된 CD8 T 세포와 미리 형성된 질 상피 오가노이드(VEOs)를 공동 배양하여 시험관 내에서 CD8 TRM을 생성했습니다. CD8 T 세포 활성화 및 공동 배양 과정을 상세히 설명하면 조직 전반에 걸쳐 이 과정이 더 널리 채택될 수 있게 되어, 전면 조직에서 CD8 T 세포 기억을 형성하는 세포 상호작용에 대한 이해가 깊어질 것입니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 브라운 대학교 기관동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 22-10-0001)에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 활성화판의 기본 설치 및 준비

1. 실험 시작 하루 전, 나이브 CD8 T 세포를 시딩할 비처리 조직 배양 플레이트를 준비합니다. 멸균 dPBS 내 활성화 항체 용액을 최종 농도인 1 μg/mL(2C11)와 0.167 μg/mL(B7-1 Fc)로 준비합니다. 24웰 플레이트의 경우, 웰당 600 μL의 이 용액을 분사합니다. 사용 준비가 될 때까지 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
2. 멸균된 dPBS에 2% 숯 제거 FBS와 1 mM EDTA를 첨가하여 림프구 농축 완충제를 준비합니다. 사용 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하세요.
3. ddH₂O에 10 mM 중탄산칼륨, 155 mM 염화암모늄, 0.1 mM EDTA를 첨가하여 암모늄-클로라이드-칼륨 적혈구(ACK RBC) 용해 완충제를 준비합니다. 여과, 멸균, 그리고 실온에서 보관하세요.
4. 적절한 양의 수확 배지를 RPMI에 5% 숯으로 제거한 FBS를 첨가하여 준비하세요. 사용 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하세요. 채취할 쥐 한 마리당 50mL의 수확 배지를 권장합니다.
   참고: 페니실린/스트렙토마이신과 암포테리신 B는 선택 사항이지만, 최종 농도인 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.2 μg/mL 암포테리신 B가 조직 분리 중 T 세포 배양에 박테리아 및 곰팡이 오염이 발생할 경우 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다.
5. T 세포 배지를 RPMI에서 10% 숯 제거 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 1x의 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루브산을 첨가하여 준비합니다. 24웰 플레이트의 경우, 웰당 T 세포 배지 2mL를, 전체 플레이트를 위해 T 세포 배지 50mL를 사용합니다. 사용 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하세요.
6. 멸균 파우치에 오토클레이빙하거나 70% 에탄올에 담가서 해부 도구(0.4mm 미세한 해부 가위와 0.8mm 미세한 곡선 미세 해부 겸자)를 준비하세요.

2. 성체 쥐 2차 림프구 기관의 채취 및 해리

1. 15 mL 원뿔 튜브를 담을 수 있는 적절한 어댑터를 사용해 원심분리기를 4 °C까지 빠르게 냉각하세요.
2. 수확 및 부화 기간 동안 조직과 림프구를 운반할 얼음을 준비하세요.
3. 해부할 쥐 한 마리당 최소 5mL의 채취 배지가 포함된 멸균된 15 mL 원뿔형 튜브를 준비하세요.
4. 기관 프로토콜에 따라 층류 후드에서 성체 CD8 T 세포 형질전환 마우스(~8주 된 경우)를 마취하고 안락사시킵니다.
5. 쥐의 팔다리를 깨끗한 스티렌 폼 표면에 고정시키고, 크기에 상관없이 고정시키고, 털이 절개 부위를 막고 도구에 달라붙지 않도록 몸통에 70% 에탄올을 뿌려 주세요.
6. 깨끗한 미세 해부 가위와 겸자를 사용해 수직 복부 절개를 하여 얇은 결합 조직층에서 피부를 분리하세요. 피부를 폴리스티렌 폼 표면에 핀으로 고정시키고, 남은 결합 조직을 잘라내어 몸통 내 장기를 노출시킵니다.
7. 비장을 조심스럽게 찾아 절제하고, 곡선형 겸자를 사용해 과도한 지방을 제거한 뒤, 채취 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮기세요. 비장은 얼음 위에 두고 가능한 한 많은 림프절(예: 장골과 서혜부)을 분리하여 비장과 같은 원뿔형 관에 얼음 위에 넣으세요.
   참고: 장골림프절은 위장관 아래 하복부 부위 꼬리정맥 양쪽에 위치하며, 서혜부 림프절은 몸통 하복부 피부 양쪽의 얕은 상복정맥 분기 근처에 위치합니다. 풍부화 후 CD8 T 세포의 수율을 높이기 위해 더 많은 림프절을 분리함; 비장만 분리해도 수백만 개의 CD8 T 세포를 생성할 수 있습니다.
8. 비장과 림프절을 상쇄된 60mm 접시에 옮기고, 3mL 주사기 플런저의 평평한 끝을 사용해 조직을 갈아 기계적으로 비장과 림프절을 분리하여 큰 조각이 남지 않을 때까지 합니다.
9. 부유물을 멸균된 70 μm 세포 체를 통과시켜 신선한 멸균 15 mL 원뿔 튜브에 넣어 수집합니다. 60mm 접시를 5mL의 수확 배지로 세척하여 분해된 세포가 완전히 전달되도록 하고, 같은 15mL 원뿔 튜브로 여과하세요.
10. 서스펜션을 584 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상청액을 버리고 튜브를 거치기 바닥을 빠르고 힘차게 원심분리관 홀더의 격자에 가로질러 흘려 펠릿을 느슨하게 만듭니다.
11. 느슨해진 펠릿을 2mL의 ACK 적혈구 용해 완충제에 재현탁하여 적혈구를 용해합니다. 소용돌이 후 실온에서 2분간 배양하세요.
12. 2분 후, 2mL의 수확 배지를 추가하여 용해 버퍼를 중화시킵니다. 5mL 혈청학적 피펫으로 현탁액을 흡인하고 멸균된 70 μm 필터를 통해 동일한 15 mL 원뿔 튜브로 다시 필터링합니다.
    참고: 이 여과는 모든 덩어리를 제거하는 데 중요합니다.
13. 서스펜션을 584 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상청액을 버리고 950 μL 림프구 풍부 완충제에 펠릿을 재현탁합니다.

3. CD8 T 세포 풍부화 및 활성화

1. 시판 분리 키트를 사용해 림프구에서 나이브 CD8 T 세포를 농축하세요. 제조사 규정을 따르세요.
2. CD8 T 세포가 농축된 후에는 농축된 현탁액을 새로운 멸균 15 mL 원뿔 튜브로 옮기고, 최대 10 mL까지 채취 배지를 채웁니다.
3. 혈구계를 사용해 세어보세요.
   참고: 성체 쥐 한 마리에서 최소 500만에서 1,000만 개의 순도 > 95% 순도로 CD8 T 세포를 분리할 수 있습니다.
4. 24웰 플레이트의 웰당 최소 50만 개의 세포를 2mL T 세포 배지에 배납합니다. 플레이트 전에 T 세포를 충분히 혼합하여 균일한 단일 세포 현탁을 확보하세요. T 세포 배지에 최종 농도인 100 단위/mL IL-2, 2.5 ng/mL IL-12, 55 μM 베타-머캅토에탄올을 보충합니다.
5. 4 °C에서 이전에 항체 코팅된 조직 배양판을 제거하고, 웰 바닥에 닿지 않고 조심스럽게 코팅 용액을 흡입합니다.
6. 즉시 T 세포를 플레이트링하세요. 37°C에서 5%_CO2 로 2일간 배양하세요.

4. 활성화 신호를 제거하고 활성화된 CD8 T 세포를 안정시킨다

1. 활성화된 우물을 광학 현미경으로 관찰하세요. 활성화 후 2일 후, 웰 곳곳에 작은 T 세포 군집을 찾아보세요. 더 큰 클러스터는 더 많은 활성화를 나타냅니다. 클러스터가 없거나 적으면, 37°C에서 5%_CO2 와 함께 1일 더 배양한 후 휴지시킵니다.
2. 잠복 기간 동안 또는 사용하지 않을 때 T 세포 현탁물을 저장할 얼음을 준비하세요.
3. P1000 피펫을 사용해 웰의 각 모서리에서 여러 번 위아래로 피펫팅하여 T 세포를 재현탁합니다. T 세포가 상승하면 웰의 내용을 멸균된 50 mL 원뿔 튜브로 옮기고 계수합니다.
   참고: 각 웰에 1mL dPBS를 세척하는 것은 선택 사항이지만, dPBS 세척액을 T 세포 현탁액과 함께 모으면 T 세포 수율이 증가할 수 있습니다.
4. T 세포를 3.4단계와 동일한 농도로 재도금하는데, 웰당 2mL에 250,000 세포/mL를 투여합니다. 적절한 양의 T 세포 배지를 100 단위/mL IL-2와 55 μM 베타-머캅토에탄올을 보충하여 준비합니다.
5. 현탁액을 584 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버린 뒤, 이전 단계에서 준비한 적절한 양의 T 세포 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 균질한 단일 세포 현탁물을 위해 충분히 혼합하세요.
6. 항체 코팅 없는 새로운 비처리된 조직 배양판에 2mL의 T 세포 현탁액(500,000 세포/웰)을 플레이트 배치합니다. 37°C에서 5%_CO2 로 2일간 배양하세요.

5. 기성 쥐 질 상피 오가노이드에 바이러스를 감염시키는 방법

참고: 우리는 오르가노이드 바이러스 감염을 위해 단순포진 바이러스-2(HSV-2)와 림프구 융모수막염 바이러스(LCMV)를 모두 사용했습니다. 두 기관 모두 생물안전 레벨-2(BSL-2) 에이전트로 간주됩니다. 감염성 인자와 관련된 모든 절차를 인증된 BSL-2 생물안전 캐비닛 내에서 수행하십시오. 사용 전후로 70% 에탄올로 작업 공간을 깨끗하게 하고, 기관 생물안전 지침에 따라 모든 자재를 폐기합니다. 이 프로토콜에서는¹⁰ 이전에 기술된 C57BL/6 암컷 마우스의 질 상피에서 채취한 질 상피세포로부터 VEO를 확립하였습니다.

1. 감염 7-10일 전 24웰 플레이트의 웰당 20 μL 기저막 추출물(BME)당 10,000 세포 밀도로 플레이트 VEO를 수행한다.
2. 공동 배양 하루 전, 트립신화 및 정확한 감염 중수 측정(MOI)을 얻기 위해 VEO 웰 한 곳을 따로 따로 떼어놓고 계수합니다. 0.25% 트립신-EDTA를 37°C 물에 5분간 예열하세요.
   참고: 감염 중에는 0.25% 트립신-EDTA를 사용하지 않습니다; MOI 계산 시 VEO를 분리할 때만 필요합니다. 이 단계에서 플라스틱기구(예: 피펫 팁, 원뿔 튜브)에 2.5% BSA dPBS를 코팅하는 것은 선택 사항이지만, 보다 정확한 계수를 위해 오가노이드 및 세포 손실을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
3. 지정된 웰에서 세포 배양 배지를 흡입하고 dPBS로 세척합니다.
4. 600 μL 예열된 0.25% 트립신-EDTA를 웰에 투여하고, BSA 코팅 P1000 피펫으로 완전히 재현탁하여 기계적으로 BME를 교란합니다. 우물의 내용을 BSA 코팅된 멸균 15 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
5. 37°C 물욕에서 5분간 배양하세요. 5분 후에는 RPMI에 10mL 10% FBS를 추가하여 트립신 반응을 억제합니다.
6. 500 x g 압력에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상청액을 버리고 BSA 코팅 피펫 팁을 사용해 100-300 μL T 세포-오가노이드 배양 배양 배양 또는 일반 DMEM/F12에 재현탁합니다.
   참고: 부피는 펠릿 크기에 따라 달라집니다. 펠릿이 거의 보이지 않는다면 낮은 부피로 재현탁하세요.
7. 혈구계를 사용해 세어보세요. 알려진 바이러스 역가와 VEO 웰당 세포 밀도를 사용하여 0.1 MOI를 달성하는 데 필요한 적절한 양을 다음 식에 따라 계산합니다:
   
8. VEO 웰에서 감염할 세포 배양 배지를 흡입하여 500 μL 예열(37 °C) dPBS로 세척합니다. 37°C에서 dPBS와 함께 5분간 웰을 배양합니다.
9. 5분 후 dPBS를 버리고 1웰당 500 μL 오르가노이드 배지를 추가하여 바이러스 입자가 충분한 MOI를 0.1로 만듭니다. 37°C에서 5%_CO2 와 함께 1시간 동안 인큐베이팅하고, 조직 배양판을 20-30분마다 부드럽게 수동으로 휘젓습니다.
10. 1시간 배양 후 바이러스 오가노이드 배지를 흡인하고 500 μL 예열된(37 °C) dPBS로 세척합니다. dPBS를 흡입하고 신선한 오르가노이드 배지를 교체하세요.

6. 바이러스에 감염된 기성 생쥐 질상피 오가노이드와 CD8 T 세포의 공동 배양

1. 공동 배양 전(이상적으로는 4-24시간 전), 해동을 위해 BME를 -80°C에서 4°C로 옮깁니다. 공동 배양 실험 설계에 따라 해동에 필요한 적절한 양의 BME를 예상하세요: 96웰 플레이트의 웰당 8 μL BME, 24웰 플레이트의 웰당 20 μL BME 도판을 계획하세요.
   참고: BME는 점성이 높으며, 4°C에서 더 긴 해동 기간이 점도를 줄이고 기동성을 향상시킵니다.
2. 2.5% BSA를 dPBS에 준비하고 필터 멸균하세요. 이 BSA 용액을 사용해 VEO와 접촉하는 모든 플라스틱 표면(예: 피펫 팁, 원뿔 튜브)을 코팅하세요.
   참고: 이 코팅은 VEO가 플라스틱 표면에 달라붙어 취급 중에 손실되는 것을 방지합니다.
3. VEO를 광각 현미경으로 확인해 크기와 전반적인 건강 상태를 확인하세요. VEO는 배양 후 7-10일 이내이며 평균 직경 ~100 마이크론임을 확인하세요. 건강한 VEO는 단일 세포가 거의 없거나 전혀 나타나지 않으며, 균일하고 둥근 형태를 보입니다.
   참고: 24웰 플레이트에서 배양하고 24웰 플레이트에서 재배양할 경우(즉, VEO 웰 한 웰이 T 세포-오가노이드 공동 배양 웰 한 웰을 재씨앗하는 경우) 공동 배양에서 VEOs는 1:1로 재판 배양해야 합니다. 24웰 플레이트에서 96웰 플레이트로 재판할 경우, VEO를 1:2로 재판합니다(즉, VEO 웰 1개가 T 세포-오가노이드 공동 배양 웰 2개를 재시딩합니다).
4. 공동 배양에 사용할 무균 96웰 또는 24웰 조직 배양판을 37 °C 인큐베이터에 배치합니다.
   참고: 가열판은 BME 접착과 응고를 가속화합니다.
5. DMEM/F12에서 T 세포-오가노이드 배양 배양지를 2% B-27 보충제, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 1x 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 0.2 μg/mL 암포테리신 B를 첨가하여 준비합니다. 사용 준비가 될 때까지 4 °C에서 보관합니다.
6. VEO 웰에서 세포 배양 배지를 흡입하고, 각 웰마다 500 μL의 차가운 (2-8 °C) 멸균 dPBS로 세척합니다.
7. dPBS를 흡입하고 200-500 μL의 차가운 오가노이드 수확용액(최소 10배 이상의 유기효소 BME 방울)을 추가합니다. BSA 코팅된 P200 피펫으로 위아래로 피펫을 움직이며 BME를 기계적으로 방해하세요.
8. 4°C의 궤도 셰이커에서 부드럽게 흔들며 (~100 rpm) 20분간 인큐베이션을 부양합니다. 냉기 궤도 셰이커가 없으면 5분마다 수동 흔들면서 플레이트를 얼음 위에 부양하세요. 20분 후에도 BME가 탈중합되지 않으면 필요에 따라 배양 시간을 연장하세요.
9. BSA 코팅된 피펫 팁을 사용해 웰의 내용을 BSA 코팅된 멸균 15mL 또는 50mL 원뿔형 튜브에 얼음 위에 옮깁니다. 500 × g 에서 4 °C에서 5분간 현탁액을 원심분리합니다.
10. 상정액은 버리고 VEO를 5-10 mL(2-8 °C) dPBS(결합 유기체 내 BME 방울의 최소 10배 부피)로 세척합니다. 500 × g 에서 4 °C에서 5분간 현탁액을 원심분리합니다.
11. dPBS를 버리고 BSA 코팅 P1000 피펫 팁을 사용해 1mL의 T 세포-오가노이드 배양 배양지에 펠릿을 재현탁합니다. T 세포가 공동 배양할 준비가 될 때까지 VEO 현탁액을 얼음 위에 보관하세요.
12. 공동 배양을 위해 T 세포를 채취하기 시작하세요. 광각 현미경으로 휴식 중인 T 세포의 크기와 전반적인 건강 상태를 확인하세요. 신호를 활성화하지 않으면 T 세포는 증식을 늦추지만 여전히 일부 군집을 형성해야 합니다. 세포 잔해나 조각이 없고, T 세포의 형태가 커졌는지 확인하세요. P1000 피펫을 사용해 웰의 각 모서리에서 여러 번 위아래로 피펫팅하여 T 세포를 재현탁하고, 살아있는 CD8 T 세포의 총 수를 세어보세요.
    참고: 96웰 플레이트의 웰 단위로, 8 μL BME 내 각 공동 배양당 100,000 T 세포를 시드합니다. 24웰 플레이트의 웰 하나에 20 μL BME 안에 각 공동 배양당 200,000 T 세포를 시드합니다.
13. 서스펜션을 584 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 10mL의 T 세포-오가노이드 배양 배양지에 재현탁합니다. VEO가 포함된 원뿔형 튜브에 플레딩할 적절한 수의 T 세포를 전달하여 T 세포와 VEO를 결합합니다.
14. 원심분리기 584 × g , 4 °C에서 5분간 사용. 상정액은 버리고 적절한 양의 BME 내에서 VEO와 T 세포를 재현탁합니다. BSA 코팅된 피펫 팁을 사용해 미리 가열된 조직 배양 플레이트에 충분히 혼합하고, 24웰 플레이트의 웰당 20 μL 또는 96웰 플레이트의 웰당 8 μL 용량을 사용합니다.
    참고: 도금 중에는 BME를 얼음 위나 4°C 냉각 블록에 보관하세요. 도금 전 30분간 피펫 팁을 4 °C 냉장고에 넣으면 BME의 조기 굳어짐을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다.
15. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 거꾸로 넣고 30분간 기다리며 BME 접착과 고체가 완료됩니다.
16. 이 배양 기간 동안, 100 ng/mL 마우스 EGF, 55 μM 베타-머카토에탄올, 10 단위/mL 마우스 IL-2를 미리 만들어진 T 세포-오가노이드 배양 배양액에 첨가하여 완전한 T 세포-오가노이드 배양 배양지를 준비합니다.
17. 배양 기간 후, 24웰 플레이트의 웰당 500 μL 완전 T 세포-오가노이드 배양 배양지를 조심스럽게 첨가하고, 96웰 플레이트의 웰 1 웰당 250 μL의 완전 T 세포-오가노이드 배양지를 첨가합니다. 유정 측면에 배지를 분사하여 BME 방울을 방해하지 않도록 하세요. 수확할 때까지 매체를 2일마다 교체하여 분석을 위해 사용하세요.

7. 유세포분석 분석을 위한 공동 배양된 CD8 T 세포 수집

1. 공동 배양이 최소 7일째에 도달하면 분석을 위해 수확합니다. 만약 T 세포가 7일째까지 공동 배양에서 TRM 유사 마커를 발현하지 못하면, 표현형 획득과 VEO 및 T 세포 생존성에 따라 7일째에서 14일째 사이의 수확일을 최적화합니다.
2. 플로우세포 염색 및 분석을 위해 0.2% w/v 소 혈청 알부민과 0.1% w/v 나트륨 아지드를 dPBS에 첨가하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충제를 준비합니다.
   참고: 아지아나트륨은 매우 독성이 강한 화학물질입니다. 모든 폐기물의 처리 및 처분에 있어 기관의 권고사항을 준수하여 기관 생물안전 규정을 준수하십시오.
3. 분석 대상에 따라 FACS 버퍼에서 표면 염색을 위해 형광 항체 칵테일을 준비합니다. 각 웰마다 최소 50 μL의 항체 혼합물이 필요합니다.
4. dPBS에 형광 생존 염료를 준비하세요. 각 웰마다 최소 50 μL의 생존 염료를 포함해야 합니다.
5. 각 웰의 매체를 조심스럽게 제거하고, 차가운 2-8 °C의 FACS 버퍼에 완전히 재현탁하며, 10-20번 피펫팅을 위아래로 움직이며 BME를 기계적으로 교란합니다. 각 우물의 내용을 라벨이 붙은 96 웰 둥근 바닥판으로 옮깁니다.
6. 원심분리기는 859 × g 에서 4 °C에서 2분간 사용했습니다. 펠릿 재혼합으로 인한 샘플 손실을 방지하기 위해 모든 원심분리 단계에서 감속 램프를 낮추세요.
7. 판을 뒤집어 한 번의 단단한 아래로 액체를 배출하여 상청액을 제거합니다. 50 μL 항체 혼합물에 재현탁합니다. 멀티채널 피펫을 사용해 최소 5번 이상 피펫을 위아래로 움직이며 세포 펠릿의 완전한 재현탁을 보장합니다.
8. 필요에 따라 4°C 또는 실온에서 30분간 배양시키고, 빛을 차단해 보관하세요. 인큐베이션 기간이 끝나면, 다중 채널 피펫과 원심분리기를 사용해 각 웰에 150 μL의 dPBS를 859 × g 에서 4 °C에서 2분간 첨가합니다.
9. 상원액을 뒤집고 한 번 아래로 한 번 튕기며 계속 디캔팅하세요. 생존 염료 50μL에 재현탁합니다. 멀티채널 피펫을 사용해 최소 5번 이상 피펫을 위아래로 움직이며 세포 펠릿의 완전한 재현탁을 보장합니다.
10. 빛을 차단한 실온에서 15분간 배양하세요. 배양 기간이 끝나면, 4 °C에서 2분간 859 × g 원심분리기를 사용해 각 웰에 150 μL FACS 버퍼를 추가합니다.
11. 상정액을 이전처럼 디캔트하고, 샘플을 즉시 유동식도계에 검사할 경우 150 μL FACS 버퍼에 재현탁하거나, 0.5% 파라포름알데히드 150 μL에 고정하여 4 °C에서 두세요. 멀티채널 피펫을 사용해 최소 5번 이상 피펫을 위아래로 움직이며 세포 펠릿의 완전한 재현탁을 보장합니다. 필터는 기기 막힘을 방지하기 위해 고정 샘플을 사용하고, 형광 손실을 방지하기 위해 12-36시간 이내에 유량세포계에서 작동시킵니다.
    참고: 파라포름알데히드는 유해 화학물질로 간주됩니다. 취급 및 폐기 시 기관의 생물안전 규정을 준수하세요.

결과

CD8 T 세포 감염 오가노이드 공동 배양의 현미경 시각화
미리 형성된 마우스 VEO는 LCMV에 감염되어 LCMV 특이적 CD8 T 세포와 공동 배양하였습니다. 또한 프로토콜의 다양성을 입증하기 위해 HSV-2 감염 모델과 함께 공동 배양을 수행했으며, LCMV 모델에 대해서는 현미경 데이터를 보여주고 아래 HSV-2 모델에는 T 세포 분화 데이터를 포함하고 있습니다. LCMV는 노란 형광 단백질(YFP)을 발현하므로, 감염된 세포는 일상적인 후형형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이를 위해 7일 된 VEO는 CD8 T 세포 인베이팅 24시간 전에 LCMV-YFP에 감염되었습니다(그림 1A). 별도로, 위에서 설명한 활성화 및 휴식 프로토콜을 사용하여 LCMV 특이적 형질전환 P14 CD8 T 세포를 활성화하였습니다. 공동 배양 당일, 감염된 오가노이드를 BME 기질에서 방출하...

토론

CD8 TRM은 구분과 유지를 위해 국소 환경 신호에 의존합니다. 이 신호들은 조직 특이적 프로그래밍을 심어주어 CD8 TRM이 환경에 적응하고 필요에 따라 면역 감시 임무를 수행할 수 있게 합니다. 안타깝게도 TRM은 조직에서 추출한 후 시험관 내에서 생존하지 못해 상세 분석이 제한되었습니다^12,13. 이 프로토콜에서는 CD8 T 세포를 상피세포와 공동 배양하여 생체 내 TRM과 유사한 표현형 특징을 가진 TRM으로 발달시키는 방법을 제시했습니다. 이 방법은 장기적으로 TRM을 연구할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 조직, 바이러스, 유전자 변형을 수용하도록 쉽게 조작할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 요소는 세포 건강과 관련이 있습니다. T 세포가 증식되고 살아있는 상태여야...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드 수용액	전자현미경 과학	15710-S
24웰 폴리스티렌 비처리 다정 티수스 배양판	VWR 인터내셔널	10861-558
2-머캅토에탄올	깁코	21985023
3mL 멸균 주사기	피셔 사이언티브	14-955-457
5 mL, 그리고 nbsp; 스냅캡, 그리고 nbsp; 멸균 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관	팔콘	352058
60 mm 페트리 접시	피셔 사이언티브	FB0875713A
70 & mu; 멸균 세포 체류	피셔 사이언티브	22-363-548
96웰 비처리 폴리스티렌 라운드 바텀 마이크로플레이트	그레이너 바이오-원	650101
96웰 폴리스티렌 비처리 다중 웰 조직 배양 플레이트	VWR 인터내셔널	10861-562
알부민 소/분율 V	열보 사이언티브 케미컬스	J6465518
염화암모늄	피셔 사이언티브	A661-500
암포테리신 B	시그마-올드리치	A9528-100MG
B-27 보충	깁코	17504044
ioTek 세포 5 세포 영상 멀티모드 리더
DMEM/F12 1:1 미디엄	시티바	SH30271. FS
둘벡코의 인산염 완충염 용액 1회	코닝	21031CV
에틸렌디아미네테트라아세트산 (0.5 M 용액/pH 8.0)	피셔 사이언티브	BP2482-500
초고운 미세 해부 가위	로보즈 외과 기기 회사	RS-5882
태아 소 혈청 - 숯/덱스트론 처리	R& D 시스템즈	S11650
Flowjo v10 소프트웨어	벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니	플로우조 (RRID:SCR_008520)
그라페 겸자	로보즈 외과 기기 회사	RS-5135
HEPES 솔루션	시티바	SH30237.01
L-글루타민 (200 mM)	깁코	A2916801
마그넷 5mL	바이오레전드	480019
마우스 CD8 Naï 베 T 세포 분리 키트	바이오레전드	480044
마우스 EGF 재조합 단백질	깁코	315091MG
비필수 아미노산 용액 (100배)	깁코	11140050
페니실린-스트렙토마이신 용액	시티바	SV30010
중탄산칼륨	MP 생의학	0215255780
정제된 항마우스 CD3&엡실론; 항체	바이오레전드	100360
재조합 마우스 B7.1 (CD80)-Fc 키메라 (캐리어 없음)	바이오레전드	555406
재조합 마우스 IL-12 (p70) (운반체 없음)	바이오레전드	577004
재조합 쥐 IL-2 (캐리어 없음)	바이오레전드	575406
저축 성장 인자 기저막 추출물	R& D 시스템즈	BME001-10
RPMI 1640 미디어	시티바	SH30027.LS
아지드 나트륨	피셔 사이언티브	S227I-25
피루베이트 나트륨 (100 mM)	깁코	11360070
트립신 0.25% 프로테아제와 돼지 트립신 함께합니다	시티바	SH30042.02
생존 염료 (레드 780)	사이텍 바이오사이언스	13-0865-T100