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방법 논문

Mettl3/Nrf2 축은 세로토닌 뉴런에서 NLRP3 유발 파이로시스를 억제하여 파킨슨병 진행을 억제합니다.

592 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

2025년 11월 7일

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

이 논문에서

요약

여기에서는 Mettl3가 m6A 변형을 통해 Nrf2를 조절하여 파킨슨병 모델에서 미세아교세포 파이로토시스를 억제하고 세로토닌 뉴런을 보호하는 방법을 조사하는 프로토콜을 제시하고 에피전사체 신경염증 연구에 적용합니다.

초록

파킨슨병(PD) 발병의 근간이 되는 정확한 메커니즘은 특히 미세아교세포 염증과 세로토닌 뉴런 생존의 역할과 관련하여 불완전하게 이해되고 있습니다. 이 프로토콜은 메틸트랜스퍼라제 유사 3(Mettl3)이 N6-메틸아데노신(m6A) 변형을 통해 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2(Nrf2)를 조절하여 미세아교세포 파이로토시스를 약화시키고 시험관 내 및 생체 내 PD 모델 모두에서 세로토닌 뉴런을 보존하는 방법을 설명하기 위한 포괄적인 프레임워크를 설명합니다. 주요 목표는 염증 캐스케이드를 시뮬레이션하기 위해 BV2 세포에서 지질다당류(LPS) 유도 미세아교세포 활성화를 시작으로 m6A 분석을 위한 메틸화 RNA 면역침전 정량적 PCR(MeRIP-qPCR)을 따르는 등 신경염증 경로의 에피전사체학 조절을 해부하기 위한 재현 가능한 방법론을 연구자에게 제공하는 것입니다. 생체 내에서, 우리는 선조체에서 표적 Nrf2 조절을 위한 아데노 관련 바이러스 혈청형 9(AAV9) 벡터의 정위 전달로 보완되는 MPTP 유도 PD 마우스 모델의 확립을 자세히 설명합니다. 행동 평가에는 운동 결손을 정량화하기 위한 전지 배치, 회전 가속 및 개방 필드 테스트가 포함되며, 분자 분석에는 파이로토시스 마커(예: NLRP3, 절단된 카스파제-1)에 대한 웨스턴 블로팅, 사이토카인에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 세로토닌 뉴런의 활성 산소종(ROS) 검출을 위한 디하이드로에티듐(DHE) 염색이 포함됩니다. Iba1 및 TPH2에 대한 면역조직화학과 같은 고급 현미경 기술을 사용하면 미세아교세포 역학 및 세로토닌 무결성을 시각화할 수 있습니다. 결과는 Mettl3 결핍이 Nrf2 하향 조절, NLRP3 인플라마솜 과활성화, 파이로프토틱 세포 사멸 및 그에 따른 세로토닌 뉴런 변성을 악화시킨다는 것을 입증합니다. 이 방법은 m6A 매개 신경 보호를 조사하기 위한 강력한 실험적 스캐폴드를 제공할 뿐만 아니라 신경퇴행성 맥락에서 Mettl3/Nrf2 축의 표적 조절을 통해 PD 진행을 완화할 수 있는 잠재적인 치료 방법을 강조합니다.

서론

파킨슨병(PD)은 노인들 사이에서 두 번째로 흔한 신경퇴행성 질환으로 65세 이상 인구의 약 2-3%에 영향을 미치며 가족과 사회 모두에 상당한 부담을 줍니다1. PD의 정확한 메커니즘은 부분적으로 이해되고 있지만, 축적된 증거는 노화된 뇌 및 PD를 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에서 흔히 볼 수 있는 특성인 미세아교세포에 의한 신경염증과 함께 PD 발달과 신경 전달의 문제 사이의 연관성을 나타냅니다 2,3,4,5. 미세아교세포는 중추신경계(CNS) 내에서 선천성 면역 세포 역할을 하며 뇌 항상성을 유지하는 데 필수적입니다6. 그러나 이러한 미세아교세포의 지속적인 과잉 활성화는 만성 신경염증 반응을 유발하여 궁극적으로 신경퇴행성 질환 진행에 기여할 수 있습니다.

중추 및 말초 염증 과정 모두 PD의 병리에 상당한 영향을 미칩니다 7,8. 미세아교세포의 활성화는 뉴런 생존에 영향을 미치는 염증 반응을 촉발하며9, 유비퀴틴 리가아제에 의한 프라이밍을 강조하는 새로운 증거가 있습니다10. 다양한 염증 경로 중에서 NOD-, LRR- 및 피린 도메인 함유 단백질 3(NLRP3) 인플라마좀 활성화는 미세아교세포 염증 조절의 주요 기여자역할을 합니다 11. 활성화는 NLRP3 발현 및 카스파제 활성화 및 모집 도메인(CARD) 어댑터 단백질과 프로-카스파제-1로 구성된 인플라마좀 복합체의 후속 조립으로 이어지며, 단백질 절단 및 사이토카인 방출로 절정에 이릅니다12. PD 환자와 질병의 다양한 동물 모델에서 증가된 NLRP3 활성화가 관찰되어 신경 세포 사멸을 초래했습니다. 특히, NLRP3 억제는 마우스 모델에서 PD 병리에 대한 보호 효과를 입증했으며, 이는 PD 발병에서 NLRP3 인플라마솜의 중요한 역할을 강조합니다13,14.

세로토닌(5-HT) 신호 전달은 신경 조절의 중요한 메커니즘으로, 포괄적인 개요17에 자세히 설명된 CNS 병리학에서의 역할을 포함하여 최소 14개의 시냅스 후 수용체 아형15,16과의 상호 작용을 통해 수많은 행동 및 생리적 기능에 영향을 미칩니다. 5-HT 시스템의 광범위한 신경 조절 영향은 설치류 뇌의 약 26,000개 뉴런에 의해 지배됩니다18. 상당한 문헌에서 PD가 주로 도파민성 뉴런 손실과 연관되어 있지만 5-HT 뉴런과 PD 사이의 관계는 덜 철저하게 조사되었습니다.

진핵 세포에서 가장 널리 퍼진 mRNA 변형인 N6-메틸아데노신(m6A) 변형은 mRNA 접합, 안정성 및 수출을 조절하여 다양한 세포 활동에 영향을 미치는 핵심입니다19. m6A 수준은 메틸트랜스퍼라제와 데메틸라아제에 의해 조절됩니다. 뇌에서 상승된 m6A 변형은 신경 발달과 관련이 있으며, 조절 장애는 알츠하이머 모델에서 변경된 METTL3 발현을 포함하여 신경퇴행성 상태20,21와 밀접하게 연관되어 있습니다22. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 사후 뇌 조직의 불용성 분획에서 메틸트랜스퍼라제 유사 3(METTL3)의 축적은 불용성 타우 단백질23 수준과 양의 상관관계가 있습니다. 또한, 선조체의 m6A 수치가 크게 감소하면 도파민 신경 전달 물질 수치가 크게 감소할 수 있습니다24. 특히, 12개의 m6A 관련 단일 뉴클레오티드 다형성은 PD 감수성과 유의미한 연관성을 보여주었습니다25. 이 프로토콜은 METTL3 매개 m6A 변형이 Nrf2/NLRP3 축을 통해 미세아교세포 자사멸을 조절하여 궁극적으로 PD 모델에서 세로토닌 뉴런 생존에 영향을 미치는 방법을 조사하기 위한 포괄적인 방법론을 확립합니다. 급성 MPTP 생체 내 모델과 LPS 시험관 내 모델은 신경염증 반응의 강력한 유도를 위해 선택되었지만 만성 패러다임은 아래에서 논의된 대로 향후 연구를 보완할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 Feicheng People's Hospital의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 IACUC-2024-118)의 승인에 따라 수행되었으며 실험 동물 연구에 대한 기관 지침과 확립된 윤리 원칙에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 책임 있는 동물 연구 관행에 대한 제도적 표준과 ARRIVE 지침을 모두 준수하면서 고통과 고통을 최소화하는 데 특히 중점을 두고 모든 동물에 대한 인도적인 보살핌과 치료를 보장했습니다.

1. 세포 배양 및 미세아교세포 활성화 모델

  1. BV2 세포 준비 및 유지 관리
    1. 냉동된 BV2 미세아교세포 스톡을 37°C 수조에서 2분 동안 급속 해동하여 열충격을 방지하기 위해 부드럽게 소용돌이치도록 합니다.
    2. 해동된 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5 분 동안 300×g에서 원심분리하여 냉동 보호제를 제거합니다.
    3. 상청액을 버리고 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 보충된 완전한 고포도당 DMEM 배지 10mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    4. 트리판 블루 배제 방법(10μL의 세포 현탁액과 10μL의 0.4% 트리판 블루 혼합, 혈구계를 사용하여 계수)을 사용하여 세포 생존력 평가를 수행하여 진행하기 전에 >95% 생존율을 보장합니다.
    5. 플라스크당 1 × 106 세포의 밀도로 T75 배양 플라스크에 세포를 플레이트하고 5% CO2로 37°C의 가습 세포 배양 인큐베이터에 유지합니다.
    6. 표준 트립신화 절차를 사용하여 80-85% 합류에 도달할 때 48시간마다 세포를 계대합니다.
      참고: 재현 가능한 염증 반응을 보장하기 위해 일관된 계대 번호(계대 3-8)를 유지하십시오. 모든 세포 배양 실험은 변동성을 최소화하기 위해 조건당 3번의 기술적 반복으로 최소 3회 독립적으로 반복되었습니다.
  2. LPS 유도 미세아교세포 활성화
    1. 처리 24시간 전에 2mL의 완전 배지에서 웰당 2 ×10 5 개의 세포로 6웰 플레이트에 BV2 세포를 시드합니다.
    2. 멸균 PBS에서 1 mg/mL의 LPS 원액을 준비하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과-멸균하고, -20°C에서 일회용 분취량으로 보관합니다.
    3. 각 실험 전에 내독소 농도를 확인하기 위해 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 분석을 사용하여 LPS 활성을 검증합니다26.
    4. 사용하기 직전에 LPS 스톡을 무혈청 DMEM에서 작동 농도 1μg/mL로 희석합니다.
    5. 웰에서 배양 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
    6. 2mL의 LPS 함유 배지(1μg/mL 최종 농도)를 처리 웰에 추가하고 무혈청 DMEM을 컨트롤 웰에 추가합니다.
    7. 염증 활성화를 위해 37°C에서 5% CO2 와 함께 세포를 24시간 동안 배양합니다.
    8. 염증 반응을 검증하기 위해 100ng/mL 종양 괴사 인자(TNF)-α로 처리된 양성 대조군 웰과 비히클만(PBS)이 포함된 음성 대조군 웰을 포함합니다.
      참고: 일관된 생체 활성을 유지하기 위해 각 실험을 위해 신선한 LPS 용액을 준비하십시오. 염증 반응이 약한 경우(예: <사이토카인 2배 증가) 시약 안정성을 확인하거나 배양을 48시간으로 연장합니다.
  3. Mettl3 과발현 및 녹다운
    1. 표준 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜을 사용하여 Mettl3 및 스크램블된 대조군 서열을 표적으로 하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 서열을 설계하고 합성합니다. 19-21 뉴클레오티드 길이의 Mettl3 mRNA(GenBank 가입: NM_019721)의 코딩 영역에서 표적 서열을 선택하여 40-60%27의 GC 함량을 보장합니다.
    2. BLAST 분석을 사용하여 siRNA 서열을 검증하여 특이성을 확인하고 표적 외 효과를 방지합니다(비표적 유전자와 <70% 상동성 확인).
    3. 제한 부위 EcoRI 및 XhoI를 사용하여 pcDNA3.1 벡터에 클로닝된 전장 Mettl3 cDNA를 포함하는 과발현 벡터를 준비합니다.
    4. 양이온성 지질 형질감염 시약을 사용하여 70-80% 컨플루언션에서 세포를 형질감염시킵니다.
      1. 2μL의 양이온성 지질 형질감염 시약을 50 pmol siRNA 또는 2 μg의 플라스미드 DNA와 100 μL의 Opti-MEM 배지에 혼합합니다.
      2. RT에서 15분 동안 혼합물을 배양합니다.
      3. 형질감염 복합체를 세포에 적가하여 4-6시간 동안 배양한 후 신선한 완전 배지로 변경합니다.
    5. 적절한 단백질 발현 변화를 허용하기 위해 LPS 처리 전 48시간 동안 형질감염된 세포를 배양합니다.
    6. 형광 리포터 공동 형질감염(웰당 100ng의 pEGFP-C1)을 사용하여 형질감염 효율을 확인하고 진행하기 전에 형광 현미경으로 >70% 효율을 목표로 합니다.

2. 동물 모델 개발 및 실험 설계

  1. 동물 준비 및 무작위화
    1. Vital River Laboratory에서 C57BL/6J 마우스를 확보하여 8주 령후, 체중 19-26g의 동일한 수컷 대 암컷 비율을 보장합니다.
    2. 12:12시간의 명암주기, 제어된 온도(22± 2°C) 및 습도(50-60%)로 특정 병원균이 없는(SPF) 조건에서 동물을 사육합니다.
    3. 표준 차우와 물을 자유롭게 이용할 수 있는 7일간의 적응 기간을 허용하십시오.
    4. 순응 중 기본 행동 평가 수행: 앞다리 배치 테스트(측면당 10회 시도), 가속 로타로드 평가(5분 동안 4-40rpm) 및 개방 필드 운동 활동 분석(50cm × 50cm × 50cm 장치에서 10분 세션)28,29,30.
    5. 편향을 최소화하기 위해 전산화된 무작위화를 사용하여 동물을 실험 그룹(그룹당 n = 6)에 무작위로 할당합니다: 가짜, 모델, 모델+Nrf2-KD, 모델+oe-Nrf2.
    6. 행동 평가를 수행하는 조사관이 그룹 할당을 인식하지 못하는 맹검 실험 설계를 구현합니다.
  2. 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP) 유발 파킨슨병 모델
    1. MPTP 염산염 15mg을 멸균 식염수 5mL에 녹이고 동물의 체중에 따라 부피를 조절하여 주사 직전 멸균 식염수에 30mg/kg의 MPTP 용액을 준비합니다.
      주의: MPTP는 매우 신경독성이 있습니다. 이중 장갑과 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 화학 연기 후드에서 다루십시오.
    2. 매일 같은 시간(09:00 ± 30분)에 연속 3일 동안 30mg/kg 체중(주사량 10mL/kg)으로 복강내 주사를 통해 MPTP를 투여합니다.
    3. 동일한 주사 일정에 따라 가짜 그룹 동물에게 동등한 양의 멸균 식염수를 주입합니다.
    4. 표준화된 점수 시트를 사용하여 MPTP 투여 기간 동안 매일 고통, 체중 감소(>15%가 종점으로 간주됨) 또는 부작용의 징후에 대해 동물을 모니터링합니다.
    5. 신경퇴행성 발달을 허용하기 위해 최종 주사 후 8일 동안 동물을 유지합니다.
      알림: 이 기간 동안 동물은 지속적인 모니터링을 통해 정상적으로 사육될 수 있습니다.
  3. 정위 바이러스 주입
    1. 폴리에틸렌니민(PEI; 1:3 DNA:PEI 비율)을 사용하여 HEK293T 세포의 삼중 형질감염에 의해 AAV9 바이러스 벡터를 준비하고, 형질감염 후 72시간에 수확하고, 요오딕산올 구배 초원심분리(2시간 동안 177,000 × g )를 사용하여 정제하고, 원심 필터 장치를 사용하여 농축하여 1 × 1012 게놈 카피/mL를 달성합니다.
    2. ITR 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 바이러스 역가를 검증하고, 표준 곡선 분석을 통해 역가가 1 × 10¹² 게놈 카피/mL에 도달하도록 합니다.
    3. ITR 특이적 프라이머와 함께 SYBR Green 기반 정량적 PCR을 사용하여 바이러스 역가를 검증하고, 알려진 표준물질의 연속 희석을 수행하고, 표준 곡선 분석을 사용하여 게놈 카피를 계산합니다. p24 ELISA를 사용하여 복제 능력이 있는 바이러스 오염이 없는지 확인합니다.
    4. 노즈콘을 통해 0.8-1.0 L/min의 산소 유량으로 전달되는 이소플루란(3% 유도, 1.5-2% 유지)으로 마우스를 마취시키고, 절차 전반에 걸쳐 호흡수(60-100호흡/분) 및 발가락 꼬집기 반사를 모니터링합니다. 정위 프레임에 마우스를 고정하고 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바릅니다.
    5. 정위 프레임에 마우스를 고정하고 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바릅니다.
    6. 멸균 메스 칼날을 사용하여 1.5cm 정중선 두피 절개를 하고 0.1mm 정밀도의 정위 좌표를 사용하여 브레그마 랜드마크를 식별합니다.
    7. 선조체에 대한 주사 좌표를 계산합니다: 전방-후방 -0.5mm, 내측-외측 ±2.0mm, 등쪽-복부에서 -3.0mm.
    8. 형광 추적자(예: 녹색 형광 단백질[GFP])로 파일럿 주사를 수행하여 표적 정확도를 검증하고 실험 주사 전에 면역조직화학을 통해 미세아교세포 마커(Iba1)와의 >80% 공동 국소화를 확인합니다.
    9. 주사 바늘(33-G)을 1mm/min 속도로 목표 깊이로 낮추고 자동 컨트롤러가 있는 마이크로 주사기 펌프를 사용하여 0.2μL/min으로 2μL의 바이러스 현탁액을 주입합니다. 주사 바늘을 목표 깊이까지 내리고 마이크로 시린지 펌프를 사용하여 0.2μL/min의 속도로 2μL의 바이러스 현탁액을 주입합니다.
    10. 역류를 방지하기 위해 주사 후 5분 동안 바늘 위치를 유지하십시오.
    11. 0.5mm/min의 속도로 바늘을 천천히 빼내고, 단속된 패턴을 사용하여 4-0 실크 봉합사로 절개 부위를 봉합하고, 가열된 회복 패드에서 마취에서 회복할 수 있도록 합니다.
    12. 수술 후 진통제(카프로펜 5mg/kg을 1일 1회 3일 동안 피하 투여)를 투여하고 자세한 관찰 시트로 24시간 동안 회복을 모니터링합니다.

3. 분자 생물학 기술 및 검증

  1. RNA 추출 및 품질 관리
    1. CO2 흡입 후 자궁경부 탈구를 통해 동물을 인도적으로 안락사시켜 실험 종점 직후 세포 또는 선조체 뇌 조직 샘플을 수확합니다. 얼음 위에서 조직을 해부하고, 잘게 다진 다음, 세포를 수확하는 경우 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신으로 효소적으로 해리합니다.
    2. 기계적 균질화(dounce 균질화기에서 20-25 스트로크) 및 클로로포름상 분리(TRIzol 1mL당 0.2mL의 클로로포름)와 함께 TRIzol 시약(1, 106 세포당 1mL 또는 조직 100mg)을 사용하여 총 RNA를 추출합니다.
    3. 분광광도법(A260/A280 비율 1.8-2.0) 및 겔 전기영동(1% 아가로스)을 사용하여 RNA 품질을 평가하여 28S 및 18S 리보솜 밴드를 확인합니다.
    4. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 정량화합니다.
    5. RNA 샘플을 -80°C의 뉴클레아제가 없는 물에 분석할 때까지 RNase 억제제(40단위/μL)를 첨가하여 -80°C에서 보관합니다.
  2. 핵-세포질 분획
    1. 세포를 수확하고(최소 2× 106 개) 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척합니다(세척당 5mL, 300× g에서 5분 원심분리).
    2. 다음 프로토콜과 함께 상용 세포 분획 키트를 활용하십시오.
      1. 프로테아제 억제제가 포함된 200μL의 세포질 추출 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
      2. 3분마다 소용돌이치면서 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
      3. 16,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상청액(세포질 분획)을 수집합니다.
      4. 세포질 추출 완충액으로 펠릿을 두 번 세척합니다.
      5. 펠릿을 100μL의 핵 추출 완충액에 재현탁합니다.
      6. 10분마다 소용돌이치면서 얼음 위에서 40분 동안 배양합니다.
      7. 16,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상청액(핵 분획)을 수집합니다.
    3. 웨스턴 블롯을 사용하여 핵 마커(U6) 및 세포질 마커(GAPDH) 분포를 분석하여 분획 효율을 검증합니다.
    4. 핵 및 세포질 분획에서 RNA를 별도로 추출합니다.
    5. 분획 특이적 참조 유전자와 함께 RT-qPCR을 사용하여 각 분획의 Nrf2 mRNA 수준을 분석합니다.
  3. 정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)
    1. 랜덤 프라이머가 있는 역전사 시약 키트를 사용하여 총 RNA 1μg에서 cDNA를 합성합니다.
    2. Real-Time PCR 시스템에서 유전자 특이적 프라이머와 함께 Premix Ex Taq II 키트를 사용하여 qPCR을 수행합니다.
    3. 용융 곡선 분석을 사용하여 프라이머 특이성을 검증하고 겔 전기영동으로 단일 앰플리콘을 확인합니다.
    4. 다음과 같은 열 순환 조건을 사용합니다: 95°C에서 10분 동안 초기 변성, 95°C에서 15초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초 동안 40회 사이클이 이어집니다.
    5. β-액틴을 내부 참조로 사용하는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 상대적인 mRNA 발현 수준을 계산합니다.
    6. 템플릿이 없는 대조군을 포함하고 geNorm 분석(안정성 값 M < 0.5)을 사용하여 실험 조건 전반에 걸쳐 참조 유전자 안정성을 검증합니다.
      참고: 재현성 점수: 분석 내 변동 계수(CV)<3개의 독립적인 실행에 걸쳐 10%.
  4. m6A 변형 분석을 위한 MeRIP-qPCR
    1. 총 RNA(최소 20μg)를 추출하고 RNA 단편화 시약(10mM ZnCl2, 10mM Tris-HCl, pH 7.0)을 사용하여 70°C에서 5분 동안 100-200개의 뉴클레오티드로 단편화합니다.
    2. 면역침전 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 750mM NaCl, 0.5% NP-40)에서 회전(10rpm)하면서 4°C에서 밤새 m6A 특이적 항체(RNA 20μg당 2μg)를 사용하여 면역침전을 수행합니다.
    3. 알려진 m6A 변형 및 변형되지 않은 RNA 대조군을 사용하여 항체 특이성을 검증합니다.
    4. 면역침전 복합체를 세척 완충액으로 5회 세척합니다.
    5. 결합된 RNA를 용리하고 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사합니다.
    6. 랜덤 프라이머를 사용하여 용출된 RNA를 역전사하고 잠재적인 m6A 부위를 덮는 Nrf2 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR 분석을 수행합니다.
    7. Nrf2 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR 분석을 수행하고 입력 RNA에 대한 농축을 계산합니다.
      참고: 검출이 일관되지 않은 경우 단편화 시간(4-6분)을 최적화하여 재현성을 개선합니다. 정량적 벤치마크: IgG 대조군과 비교한 신호 대 잡음비>15:1.

4. 단백질 분석 및 검증

  1. 단백질 추출 및 정량
    1. 프로테아제 억제제(1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 1mM, 1μg/mL 류펩틴, 1μg/mL 펩스타틴 A) 및 포스파타제 억제제(1mM 오르토바나데이트, 5mM 불화나트륨)를 함유한 방사면역침전 분석(RIPA) 완충액 200μL에서 세포(1× 106개 세포 )를 용해하거나 조직 샘플(선조체 조직 100mg)을 균질화합니다.
    2. 주기적인 소용돌이와 함께 얼음 위에서 30분 동안 용해물을 배양합니다(10초 동안 10분마다).
    3. 12,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 상청액을 수집합니다.
    4. 소 혈청 알부민 표준물질(0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL)과 함께 비신코닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 3회 측정하여 정량화합니다.
    5. 웨스턴 블롯을 사용하여 모든 샘플에서 하우스키핑 단백질 수준(GAPDH, 예상 MW: 36kDa)을 분석하여 단백질 무결성을 검증합니다.
  2. 웨스턴 블롯 분석
    1. 도데실 설페이트나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 로딩 완충액(최종 농도: 62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 5% β-메르캅토에탄올, 0.003% 브로모페놀 블루)에 동일한 로딩(30-50μg)으로 단백질 샘플을 준비하고 95°C에서 5분 동안 변성합니다.
    2. 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, 80V에서 30분 동안 실행한 후 Tris-glycine-SDS 완충액에서 120V에서 90분 동안 실행합니다.
    3. 전사 완충액(25mM Tris, 192mM 글리신, 20% 메탄올)에서 반건식 전사 시스템(90분 동안 400mA)을 사용하여 단백질을 폴리불화비닐리덴(PVDF) 멤브레인으로 전사합니다.
    4. 항체 배양을 진행하기 전에 가역적 단백질 염색(Ponceau S: 5% 아세트산에 5분 동안 0.1%)을 사용하여 전달 효율을 확인합니다.
    5. 부드럽게 교반하면서 RT에서 1시간 동안 TBST(TBS + 0.1% Tween-20)에서 5% 탈지 우유로 멤브레인을 차단합니다.
    6. 1차 항체를 블로킹 완충액에서 1:1000으로 희석한 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
    7. 멤브레인을 TBST로 3회(각각 10분) 세척하고 HRP 접합 2차 항체(1:5000 희석)와 함께 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    8. 향상된 화학발광을 사용하여 단백질 밴드를 검출하고 밀도계를 사용하여 정량화합니다.
    9. 표적 단백질 발현을 로딩 대조군(GAPDH)으로 정규화하고 적절한 대조군(1차 항체에 대한 펩타이드 차단, 2차 단독 대조군)을 사용하여 항체 특이성을 검증합니다.

5. 행동 평가 및 기능 분석

  1. 전퇴 배치 시험
    1. 평가하기 전에 마우스가 테스트 환경(조용한 방, 22°C, 희미한 조명)에 30분 동안 적응하도록 합니다.
    2. 마우스의 등쪽 피부를 부드럽게 잡고 네 팔다리를 모두 테이블 가장자리 위 약 0.5cm 높이에 매달고 마우스가 테이블 표면을 볼 수 없도록 합니다.
    3. 테이블 가장자리에 대해 양쪽에 진동사를 칫솔질하여 배치 반사를 유발하고 2초 이내에 성공적인 전지 배치를 기록합니다.
    4. 시도 사이에 30초 간격으로 왼쪽과 오른쪽을 번갈아 가며 한 면당 10번의 시도를 수행합니다.
    5. 일주기 영향을 최소화하기 위해 일관된 조명 조건(50-100lux)과 시간대(13:00-17:00)에서 테스트를 수행합니다.
    6. 성공률을 성공적인 배치의 백분율로 계산: (성공적인 배치/총 시도) × 100.
  2. 로타로드 테스트 가속화
    1. 로타로드 장치를 4분 동안 40rpm으로 선형 가속도로 5rpm의 초기 속도로 설정합니다.
    2. 학습 효과를 최소화하기 위해 테스트 전에 연속 3일 동안(하루 3회 시도, 15분 간격) 로타로드에서 마우스를 훈련시킵니다.
    3. RT(22 ± 2°C), 조명(100lux) 및 배경 소음 수준(<50dB)을 포함한 테스트 조건을 표준화합니다.
    4. 회전 막대에 마우스를 앞을 향하게 놓고 즉시 가속 프로토콜을 시작합니다.
    5. 각 시도에 대해 낙하 대기 시간(시작부터 마우스가 넘어지거나 5분 시도를 완료할 때까지의 시간)을 기록하고 15분의 휴식 간격으로 동물당 5회 테스트합니다.
    6. 동기 부여 요인으로 인한 변동성을 최소화하기 위해 가장 긴 세 번의 시도에서 평균 잠복기를 계산합니다.
  3. 오픈 필드 테스트
    1. 경기장 위 50m에 비디오 추적 시스템이 있는 열린 필드 장치(50cm × 50cm × 투명 아크릴 상자)를 사용하십시오.
    2. 냄새 신호를 제거하기 위해 동물 사이에 70% 에탄올로 장치를 청소하십시오(스프레이 및 물티슈, 5분 자연 건조).
    3. 마우스를 장치 중앙에 놓고 10fps의 비디오 캡처로 일정한 조명(200lux)에서 30분 동안 활동을 기록합니다.
    4. 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 여러 매개변수를 분석합니다.
      총 이동 거리(cm)
      중심 구역 시간(벽에서 10cm로 정의, 초 단위로 보고)
      이동 속도(cm/s)
      주변 영역과 중앙 영역에서 보낸 시간
  4. 중앙 영역을 벽에서 10cm로 정의하고 중앙 영역과 주변 영역에서 소요된 시간과 이동 거리를 정량화합니다.

6. 고급 현미경 및 이미징

  1. ROS 검출을 위한 DHE 염색
    1. 사용 직전 PBS에서 10μM의 신선한 디하이드로에티듐(DHE) 용액을 준비합니다(빛으로부터 보호).
    2. DHE와 트립토판 하이드록실라제 2(TPH2) 항체(1:500 희석)를 결합하여 공동 면역형광 염색을 수행하여 세로토닌 뉴런을 특이적으로 식별합니다.
      참고: 이 이중 표지 접근법은 DHE가 슈퍼옥사이드에 의해 산화될 때 기원 세포 내에 국한된 상태로 유지되는 막 불투과성 형광 산물을 형성한다는 원리에 기초하여 주변 신경교 세포의 산화 스트레스로부터 TPH2 양성 신경세포체 내의 ROS 생산을 구별할 수 있습니다.
    3. 조직 절편(두께 20μm)을 DHE 용액과 함께 가습 챔버의 어두운 조건에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. ROS 검출 특이성을 검증하기 위해 음성 대조군(DHE 없음) 및 양성 대조군(30분 동안 100μM H2O2 처리)을 포함합니다.
    5. PBS로 절편을 세 번 세척하고 퇴색 방지 마운팅 매체로 마운트합니다.
    6. 형광 현미경(DHE: 518nm 여기/605nm 방출, TPH2: 488nm 여기/525nm 방출)을 사용하여 샘플 전체에서 일관된 노출 설정(200ms)을 사용한 이미지; 이미징 시스템은 표준 형광 비드(신호 대 잡음비 > 20:1)를 사용하여 매주 보정되었습니다.
    7. 표준화된 분석 프로토콜(임계값: 50-255, 입자 크기: 10-∞ 픽셀2)이 있는 ImageJ 소프트웨어만 사용하여 TPH2 양성 세포의 형광 강도를 정량화합니다. TPH2 면역반응성을 기반으로 ROI 경계를 설정하여 인접한 미세아교세포, 성상세포 또는 기타 세포 유형의 신호를 배제하면서 특히 세로토닌성 뉴런 내에서 산화 스트레스를 측정합니다. 각 동물에 대해 여러 조직 절편에 걸쳐 최소 50개의 TPH2 양성 뉴런을 분석합니다.
  2. 면역조직화학
    1. 조직 절편을 PBS의 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 24시간 동안 부드럽게 교반하면서 고정합니다.
    2. 등급이 매겨진 에탄올 계열(각각 70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1시간)을 통해 탈수하고 자동 프로세서를 사용하여 파라핀에 내장합니다.
    3. 마이크로톰을 사용하여 5μm 절편을 절단하고 하전된 유리 슬라이드에 장착하여 슬라이드당 3-4개 절편을 보장합니다.
    4. 자일렌(2× 10분)을 사용하여 절편을 탈파라핀화하고 등급이 매겨진 에탄올을 통해 물로 재수화합니다.
    5. 구연산염 완충액(10mM 구연산나트륨, pH 6.0)을 전자레인지(2분 냉각 간격으로 10분 동안 750W)에서 사용하여 항원 회수를 수행합니다.
    6. 적절한 음성 대조군(1차 항체 없음) 및 양성 대조군 조직(표적 단백질을 발현하는 것으로 알려진 뇌 절편)을 사용하여 항체 특이성을 검증합니다.
    7. RT에서 10분 동안 메탄올에 3% 과산화수소로 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다.
    8. 가습 챔버에서 4°C에서 밤새 1차 항체를 적용합니다.
    9. HRP 접합 2차 항체(1:500 희석, RT에서 1시간) 및 DAB 발색원(갈색이 나타날 때까지 배양, 일반적으로 2-5분)을 사용하여 검출합니다.
    10. 헤마트실린으로 대조염색(30초), 탈수, 투명 및 영구 마운팅 매체로 마운트합니다.
    11. 체계적인 무작위 샘플링(5번째 섹션마다, 섹션당 3개의 카운팅 프레임, 40× 배율)과 함께 입체학적 방법을 사용하여 양성 세포를 정량화합니다.

7. 통계 분석 및 데이터 검증

  1. 통계 설계 및 분석
    1. G*Power 3.1.9.7 소프트웨어를 사용하여 생물학적으로 의미 있는 차이(효과 크기 ≥ 0.8, 검정력 ≥ 0.80, α = 0.05)를 감지하기 위한 적절한 표본 크기를 결정하기 위해 검정력 분석을 수행합니다.
    2. Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 데이터 정규성을 검증하고 파라메트릭 분석 전에 Levene의 테스트를 사용하여 분산의 동질성을 평가합니다.
    3. 실험 설계 및 데이터 분포를 기반으로 적절한 통계 테스트를 통해 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
    4. 단일 요인 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA)을 적용하고 요인 설계(예: 치료 × 시간 상호 작용)에는 양방향 분산 분석을 적용합니다.
    5. ANOVA가 유의성을 보일 때(p < 0.05) 다중 비교를 위해 Tukey의 사후 검정을 사용하고 적절한 경우 Bonferroni 보정을 적용합니다.
    6. p << 0.01 및 p < 0.001에 대한 추가 표기법을 사용하여 모든 분석에 대해 통계적 유의성 임계값을 p 0.05로 설정합니다.
    7. 포괄적인 통계적 해석을 제공하기 위해 p-값과 함께 효과 크기(Cohen's d 또는 η2) 및 95% 신뢰 구간을 보고합니다.
    8. 최소 3개의 독립적인 실험에서 데이터를 평균 ± SEM으로 제시하며, n≤ 10일 때 개별 데이터 포인트가 표시됩니다.
      참고: 모든 세포 배양 실험은 각 실험에 적절한 대조군과 여러 기술 반복이 포함되며 최소 3회 독립적으로 반복되어야 하며, 관찰된 가변성(예: CV<행동 데이터의 경우 15%)은 눈가림 및 표준화된 타이밍을 통해 최소화되었습니다.

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결과

이 프로토콜은 대조군에 비해 mRNA 및 단백질 수준 감소로 입증된 바와 같이 LPS 처리된 미세아교세포에서 Mettl3 발현이 감소한다는 것을 성공적으로 입증합니다(그림 1B,C). ELISA 분석은 배양 상청액에서 IL-6 및 TNF-α 수치 상승을 통해 성공적인 LPS 매개 염증 활성화를 확인합니다(그림 1A).

MeRIP-qPCR 분석은 Mettl3 과발현이 Nrf2 mRNA m6A 메틸화를 강화하여 분해를 촉진하기보다는 역설적으로 단백질 안정성과 발현을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 m6A 변형이 특정 세포 맥락에서 번역 효율성을 향상시킬 수 있다는 새로운 증거와 일치합니다(그림 2A,B

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토론

재현 가능한 결과를 보장하기 위해 세심한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. LPS 활성화 시기는 매우 중요합니다 - 염증 반응은 치료 후 24시간에 최고조에 달하며, 저장된 용액은 생체 활성을 잃을 수 있으므로 각 실험에 대해 새로운 LPS 용액을 준비하는 것이 좋습니다19,20. MeRIP-qPCR 분석의 경우 항체 품질이 가장 중요합니다. 우리는 실험 샘플 전에 알려진 양성 및 음성 대조군을 사용하여 항체를 검증하면 나중에 많은 문제 해결 문제를 방지할 수 있음을 발견했습니다. 정위 바이러스 주입 중에 정확한 좌표와 주입 속도(0.2 μL/min)를 유지하는 것은 표적화 정확도에 매우 중요합니다. 주입 후 5분의 대기 시간은 역류를 방지하여 형질도입 효율을 크게 감소시킬 수 있습니다.

몇 가지 수정...

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공개 사항

저자는 이 작업과 관련된 경쟁적인 재정적 이해관계나 이해 상충이 없음을 선언합니다. 저자는 이 기사에 언급된 제품을 사용하는 회사와 재정적 관계를 맺지 않습니다.

감사의 글

저자는 실험 절차와 동물 관리에 도움을 준 Feicheng People's Hospital과 Yantai Yantaishan Hospital의 기술 직원에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AAV9 바이러스 벡터벡터 코어 시설관습Nrf2 구성 개념 포함
가속 로타로드우고 바질47600행동 검사를 위해
항-GAPDH 항체세포 신호 전달 기술51741차 항체, 1:5000
항-GSDMD 항체앱캠AB2198001차 항체, 1:1000
항-Iba1 항체와코019-197411차 항체, 1:500
항NLRP3 항체아디포젠AG-20B-00141차 항체, 1:1000
항-Nrf2 항체앱캠AB623521차 항체, 1:1000
항-SLC6A4 항체노부스 바이오로지컬스NBP1-857261차 항체, 1:500
항-TPH2 항체밀리포어MAB8471차 항체, 1:500
BCA 단백질 분석 키트뚫다23225단백질 정량화를 위해
BV2 미소아교세포셴겐 생물학SG-BV2마우스 미세아교세포주
C57BL/6J 마우스바이탈 리버 연구소2138주 된 생애, 19-26g
세포 분획 키트세포 신호 전달 기술9038핵-세포질 분리
완전 고혈당 DMEM깁코11965092세포 배양 배지
DAB 크로모젠벡터 연구소SK-4100면역조직화학을 위해
치과 드릴(Dental drill)파인 사이언스 툴즈18000-17버홀 드릴링을 위해
DHE(디하이드로에티듐)분자 프로브D11347ROS 검출
ELISA 키트 (IL-1β)R& D 시스템즈MLB00C마우스 IL-1&베타; 탐지
엘리사 키트 (IL-18)R& D 시스템즈7625마우스 IL-18 탐지
엘리사 키트 (IL-6)R& D 시스템즈M6000B마우스 IL-6 탐지
ELISA 키트 (TNF-&알파)R& D 시스템즈MTA00B쥐 TNF-&α; 탐지
태아 소 혈청깁코16000044세포 배양 보충제
HRP 결합 2차 항체잭슨 면역연구소111-035-003안티 래빗, 1:10000
이소플루란RWD 생명과학R510-22마취제
LAL 분석 키트론자50-647ULPS 활동 검증
리포펙타민 형질전환 시약인비트로젠11668019세포 형질전환을 위해
LPS(지방폴리당류)시그마-올드리치L2630대장균에서 추출한 1 mg/mL 스톡
m6A 항체시냅스 시스템202003MeRIP을 위한 1:200
마이크로 시린지 펌프하버드 장치70-3007입체정위 주사에 대해
MPTP시그마-올드리치M0896신경독소, 30 mg/kg
개방 필드 장치ANY-미로관습50cm 및 급성; 50cm 및 급성; 50cm
파라포름알데히드시그마-올드리치P6148PBS에서 4%
pcDNA3.1 벡터인비트로젠V79020발현 벡터
페니실린-스트렙토마이신깁코15140122항생제 용액
프리믹스 Ex Taq II 키트타카라RR820AqPCR에 대해
PrimeScript RT 키트타카라RR037A역전사
PVDF 멤브레인밀리포어IPVH00010웨스턴 블롯을 위해
RIPA 버퍼세포 신호 전달 기술9806단백질 추출
siRNA (Mettl3)리보바이오관습표적 서열 검증
입체 정찰 프레임RWD 생명과학68001뇌 수술을 위해
트리졸 시약인비트로젠15596026RNA 추출
트리판 블루시그마-올드리치T8154세포 생존성 염색

참고문헌

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