노화 연구를 위한 마우스 모델에서 다기관 채집

요약

이 프로토콜은 젊은 및 노년 마우스에서 장기 채취를 표준화하여 여러 조직에서 연령 관련 해부학적 및 조직학적 변화를 평가하며, 윤리적이고 비용 효율적인 실험 설계를 지원합니다.

초록

노화는 거의 모든 장기와 조직에 점진적으로 영향을 미치는 전신적이고 다요인적인 생물학적 과정으로, 구조적, 세포적, 분자적 변화를 초래합니다. 이 프로토콜은 종합적인 장기 수집을 통해 연령 관련 해부학적 및 형태학적 변화를 평가하는 표준화되고 재현 가능한 접근법을 제시하여 이후 조직학 및 분자 분석을 수행합니다. 2-3개월 된 어린 쥐와 20-24개월 된 노년의 마우스를 사용하여, 주요 장기의 대접 해부학적 해부와 체계적 채취를 위한 단계별 절차를 상세히 설명합니다. 이는 하류 절절, 조직학적 염색, 현미경 평가를 위한 것입니다. 이 프로토콜은 한 동물로부터 뇌, 눈, 식도, 흉선, 심장, 대동맥, 폐, 림프절, 간, 췌장, 위, 소장, 비장, 신장, 방광, 피부, 골격근, 뼈, 지방 조직 등 다양한 장기와 조직을 채취할 수 있게 합니다. 피험자별 데이터 생산량을 극대화함으로써 이 워크플로우는 동물 사용을 줄여 윤리적 사용을 지원하고, 연구 간 재현성을 높이며, 생물 노화의 통합 분석을 용이하게 합니다.

서론

노화는 거의 모든 장기에 영향을 미치는 전신적 과정이지만, 대부분의 실험 연구는 단일 조직에만 집중하여 연령 관련 변화가 신체 전반에서 어떻게 공존하거나 상호작용하는지에 대한 통찰을 제한합니다. 노화는 면역 기능 장애, 대사 변화, 재생 능력 상실, 구조 퇴행 등 조직 특이적 및 전신적 변화로 나타납니다 ^1,2. 장기 특이적 연구가 귀중한 통찰을 제공했지만, 세포 노화가 시스템 전반에 걸쳐 어떻게 전체 유기체 감소에 기여하는지 이해하려면 더 넓은 시각이 필요합니다. 쥐와 같은 전임상 생체 모델에서의 다중 장기 분석은 연령 관련 질환과 생리적 회복력 상실에 기여하는 구조적, 세포적, 분자적 조정된 변화를 식별하는 데 필수적입니다 ^3,4.

실험실 쥐는 유전적 접근성, 짧은 수명, 보존된 노화 경로, 면역 기능 장애, 조직 섬유화, 대사 저하, 신생물증 증가 등 인간 노화의 주요 특징을 재현할 수 있는 능력 덕분에 노화 연구에서 필수적이고 잘 확립된 모델로 남아 있다 ^5,6,7. 그러나 효율적이고 표준화된 다기관 박리 프로토콜은 널리 사용되지 않고 있습니다. 이러한 프로토콜은 조직학적 비교를 최적화하고, 동물 사용을 줄이며, 동일 대상에서 온 조직 간 오믹스 데이터셋을 통합하는 데 필요합니다 ^8,9.

여기서는 마우스에서 다중 장기 관류, 해부 및 보존을 위한 재현 가능하고 시간 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 뇌, 눈, 흉선, 심장, 폐, 대동맥, 서혜부 림프절, 위장관(식도, 위, 소장, 대장), 간, 췌장, 비장, 신장, 방광, 지방 조직, 골격근, 뼈, 피부 등 주요 장기의 해부학적 해리 및 채취에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 조직학, 분자, 냉동절부 워크플로우와 호환되는 조직 보존에 관한 상세한 지침이 포함되어 있습니다. 이 표준화된 접근법은 연구자들이 동일한 실험 대상 내에서 장기 특이적 및 전신적 노화 징후를 평가할 수 있게 하며, 통합적이고 고품질의 노화 연구를 지원할 수 있게 합니다 4,10,11,12.

프로토콜

C57BL/6J 마우스는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스에서 관리되었습니다. 모든 동물 시술은 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며, 실험동물자원센터의 감독을 받았습니다. 쥐들은 12시간 동안 밝고 어두운 주기를 가졌으며, 한 우리당 5마리 미만의 성체 쥐가 있었습니다. 안락사는 미국 수의학회(AVMA)의 동물 안락사 지침¹³에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서는 어린 쥐는 3개월에, 나이 든 쥐는 22개월에 희생되었습니다. 해부 및 장기 채취를 진행하기 전에 준비 체크리스트(표 1)와 조직 채취 체크리스트(표 2)를 출력하여 완료하세요. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 경추 탈구

참고: 경추 탈구는 경추 구조에 과도한 외상을 최소화하기 위해 훈련된 전문가에 의해 시행됩니다.

1. 한 손으로 꼬리 밑부분을 단단히 잡아 쥐를 제압하세요.
2. 반대쪽 손의 엄지와 검지를 두개골 밑에 댔다.
3. 경추를 탈구시키기 위해 단단하고 빠른 압력을 가하세요. 두개골과 인접한 척추뼈 사이의 분리를 확인하기 위해 목을 촉진하세요.
4. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 호흡 정지와 유해 자극에 대한 반응이 없음을 확인하여 성공적인 안락사를 확인한 후 진행합니다.
5. 관류 및 조직 채취 전에 쥐의 체중을 기록하세요.

2. 흉강 절개 및 관류

참고: 관류는 선택 사항입니다. 파라포름알데히드(PFA)와 관련된 모든 시술을 실험실 가운, 니트릴 장갑, 안전안경 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 인증된 화학 연기 후드 안에서 수행하십시오. PFA 용액은 기관 화학 안전 지침에 따라 폐기해야 합니다. 모든 폐기물 PFA 및 오염 물질(예: 장갑, 휴지, 용기)을 명확하게 라벨이 붙은 유해 폐기물 용기에 수집하고, 지방, 주, 연방 규정을 준수하는 프로토콜에 따라 기관의 환경 보건 및 안전 사무소를 통해 처리합니다.

주의: 고정을 위해 파라포름알데히드(PFA)를 사용할 경우, 포름알데히드 증기에 노출되지 않도록 훈기 후드 아래에서 모든 과정을 수행해야 합니다.

1. 흡수성 물질로 덮인 스티로폼 뚜껑을 덮어 관류에서 나온 체액을 수집 트레이에 담으세요. 쥐를 이 해리 표면에 누운 자세로 눕히고, 몸을 안정시키기 위해 핀으로 팔다리를 고정합니다: 앞다리는 흉강을 열기 위해 옆으로 위치시키고, 뒷다리는 옆쪽으로 뻗어 복벽에 부드러운 장력을 만듭니다.
   참고: 이 위치는 시야를 높이고 장애물을 최소화하며 장기 수집 작업 공간을 극대화합니다.
2. 가슴 부위에 70% 에탄올을 발라.
3. 날카로운 가위로 횡격막 높이에 횡절개를 하고, 두 개의 V자형 절개를 하여 갈비뼈를 노출시킵니다(그림 1A).
4. 둔탁한 겸자를 사용해 피부를 부드럽게 들어 올리고 남은 부착물을 조심스럽게 잘라 흉부 부위를 완전히 노출시킵니다.
5. 갈비뼈 양쪽에 약 2cm 길이의 V자형 절개 두 개를 하여 흉강을 열어줍니다.
6. 흉골을 위로 당겨서 머리 옆 어깨 위에 고정하세요.
7. 둔한 겸자를 사용해 심장을 조심스럽게 노출하세요. 관류 라인에 갇힌 기포를 제거한 후, 나비 바늘이나 캐뉼라를 좌심실 끝 약 3-4mm 깊이에 삽입합니다. 오른쪽 심방에 약 5mm 길이의 절개를 하여 투수액이 유출되도록 합니다(그림 1B).
8. 순환계를 깨끗하게 하기 위해 칼슘 및 마그네슘이 없는 생리적 용액(예: PBS, 식염수, HBSS)으로 관류를 시작하세요.
   참고: 관류는 20mL 주사기, 펌프 또는 중력 공급 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다. 혈관에서 혈액을 완전히 제거하려면 마우스 한 마리당 평균 15-20mL의 관류액이 필요합니다. 간과 폐가 빠르게 맑아지고(설얗게 변함), 입과 혀가 창백해 보이는 것으로 좋은 관류가 나타난다. 완전한 관류는 심장에서 맑고 혈액 없는 배출을 이끌어냅니다.
9. 원한다면, 바늘은 고정한 상태로 칼슘 및 마그네슘이 없는 생리용 용액(칼슘 및 마그네슘 프리 생리용액)에서 4% 파라포름알데히드(PFA)가 포함된 50mL 주사기로 바꿔 PFA 관류를 시작하세요. 라인에 기포가 들어가지 않도록 주의하세요. 4% PFA로 계속 관류를 하며, 원하는 고정 정도가 신체의 점진적인 경직 정도로 판단됩니다. 약 30mL의 고정제가 한 마리 마우스에 충분한 양입니다.

3. 장기 및 조직 채취

참고: 장기 채취 순서는 어린 쥐와 노령 쥐를 비교할 때 매우 중요합니다. 노령 동물의 장기는 연약하고 자가분해나 기계적 손상에 취약하기 때문에 신속하고 일관된 조직 취급이 필수적입니다. 수집 순서를 표준화하면 사후 변동성을 최소화하고, 취급 유물을 줄이며, 동물 간 고정 품질을 균일하게 보장합니다^14,15. 일관성은 연령과 관련된 미묘한 형태학적 변화를 감지하는 데 매우 중요하며, 지연되거나 일관성 없는 샘플링은 편향을 초래할 수 있습니다. PFA 관류가 이루어지지 않은 경우, 장기를 신속히 적출해야 합니다. 췌장, 위, 폐, 뇌는 즉시 처리되지 않으면 빠른 자가용해와 조직학적 손상에 특히 취약합니다. 노년의 쥐는 종종 신생물 병변이 발생하므로, 비장, 간, 림프절, 폐, 흉선 등을 꼼꼼히 검사하여 비대칭, 비대형, 결절 또는 변색이 있는지 확인하세요. 이 결과들을 전체 질병 부담의 일부로 기록하세요(표 2 참조).

1. 관류 또는 경추 탈구 후 동물을 엎드린 자세로 시작하여 흉강과 복강의 주요 장기를 채취합니다(그림 1C).
2. 핀 후에는 거즈나 스프레이 병으로 70% 에탄올을 부드럽게 바르면 털 오염을 최소화하고 민감한 부위의 조직 수분을 유지할 수 있습니다. 이 방법은 우리 손에서 털 이물질을 줄이고 해부 시 가시성을 개선하는 데 효과적이며, 완전 잠금의 단점을 피하는 데 효과적임이 입증되었습니다.
3. 가위와 둔한 겸자를 사용해 횡격막에서 골반까지 중앙선 절개를 한 뒤, 그림 1A의 빨간 선에 표시된 두 개의 측면 절개를 하여 복강을 조심스럽게 열어줍니다. 피부와 복벽을 들어 올려 내부 장기를 완전히 노출시키세요.
4. 위, 소장, 결장: 식도 접합부에서 위를 분리하되, 유문 끝은 소장과 연속적으로 유지합니다. 지지 인대를 절단하여 위장관을 부드럽게 풀고, 소장과 대장을 포함한 기관을 제거합니다. 직장 원위부에서 절단하세요.
   1. 내막 내용물을 제거하려면 십이지장공주 굴곡 근위부와 회경부 접합부에서 원위부를 절단하십시오. 결장은 맹장부에서 근위부를 절단하세요. 소장과 대장을 약 20mL의 생리적 용액으로 급식 주사기를 사용해 세척한 후, 손상을 방지하기 위해 얇은 겸자로 조직을 부드럽게 고정하세요.
5. 식도: 식도를 경추에서 위 접합부까지 분리합니다.
6. 비장과 췌장: 미세 해양을 통해 비장과 췌장을 주변 조직으로부터 분리하여 기계적 손상을 최소화합니다. 췌장을 비장에서 조심스럽게 분리하세요. 즉시 췌장을 해리하여 잘라내어 ≤5mm 크기로 절단한 후 안락사 5분 이내에 고정제에 담가 자가용해를 최소화하고 최적의 조직 형태를 유지하세요. 비장을 검사하여 크기, 색상, 형태, 눈에 띄는 이상 징후를 관찰하세요.
7. 간: 가는 팁 겸자를 사용해 간엽 사이의 중심 결합 조직을 잡고 부드럽게 위로 당겨 장력을 만듭니다. 해리 가위로 간과 인접 장기 사이의 모든 부착물을 조심스럽게 절단하세요. 간 색깔, 일관성, 결절이나 기타 이상 여부를 검사하세요.
8. 내장 지방: 내장 지방 저장소 샘플을 수집하세요.
   참고: 어린 동물은 일반적으로 내장 지방이 거의 없지만, 노령 동물은 특히 장, 신장, 생식선 부위에 지방이 더 많이 쌓이는 경향이 있습니다.
9. 신장과 방광: 양쪽 신장과 연결된 요관, 방광을 절제하세요. 신장을 주변 지방 조직과 결합 구조에서 조심스럽게 분리하여 가위나 둔한 겸자를 사용하세요. 요관을 따라 방광까지 이어지며, 남은 부착물을 절단하여 전체 요로를 분리합니다. 추가 처리 전에 신장과 방광의 크기, 색깔, 이상을 검사하세요.
10. 림프절: 복막에서 피부를 당겨 서혜부 부위를 노출시킵니다. 림프관을 따라 유선지방 패드 내 림프절을 확인하세요. 마디를 분리하여 미세한 겸자로 제거하여 주변 지방과 결합 조직의 손상을 최소화하세요.
11. 심장: 주요 혈관을 절단하여 심장을 조심스럽게 제거하세요.
12. 흉선: 흉선을 조심스럽게 절제하여 구조를 보존하세요. 흉선은 나이가 들면서 변형 현상을 겪으며, 나이 든 쥐에서는 흉선 조직이 거의 없거나 전혀 없을 수 있다는 점을 유의하세요.
13. 폐: 날카로운 가위와 가늘게 잘린 겸자를 사용해 폐와 연결된 기관을 한 조각으로 조심스럽게 제거하세요.
14. 대동맥: 대동맥과 척추 사이에 닫힌 겸자를 삽입하고 대동맥을 부드럽게 빼내어 등쪽 방향을 따라 분리합니다. 혈관이 찢어지지 않도록 조심하세요. 미세한 핀셋을 사용해 해리 현미경 아래에서 대동맥에서 주변 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하세요.
15. 골격근: 뒷다리 피부를 절제하여 대퇴골과 주변 근육을 노출시킵니다. 가는 가위를 사용해 주변 결합 조직에서 대퇴골에 붙은 근육을 분리하고 힘줄 삽입부에서 절단하여 섬유의 완전성을 유지합니다.
16. 뼈(경골): 해리 가위를 사용해 덮인 피부와 근육을 절제하여 경골을 노출시킵니다. 해리 가위와 둔한 겸자를 사용해 무릎과 발목 관절의 경골을 조심스럽게 분리하세요. 뼈를 손상시키지 않고 남아 있는 연조직을 제거하세요.
17. 눈: 큰 해부 가위를 사용해 쥐의 목을 베어라. 미세한 꼬자로 눈을 조심스럽게 제거하세요.
18. 뇌: 두피를 절제하여 앞두개골을 노출시켜. 날카로운 가위나 메스를 사용해 두개골 봉합선을 따라 뼈 조각을 들어 올려 뇌를 노출시킵니다(그림 1D). 후각 구근과 복측 부착물을 절단하세요. 두개골 내에서 뇌를 부드럽게 꺼내세요. 조직을 즉시 처리하여 형태를 유지합니다.
19. 피부: 후속 적용을 위해 제모가 필요하다면, 전기 트리머로 머리카락을 제거하세요. 무딘 겸자로 등쪽 피부 일부를 꼬집고, 가위로 절제한 뒤 조직을 수집해 추가 처리를 진행합니다.
20. 관심 있는 모든 장기를 제거한 후, 4% PFA가 미리 채워진 450mL 용기에 전체 쥐 시체를 보관하여 예상치 못한 발견이나 습식 고정 조직으로 다시 확인해야 할 심사위원들의 질문에 답변하기 위해 보관합니다.

4. 조직 보존 및 처리

참고: 조직의 완전성을 유지하려면 해부와 보존 사이의 시간을 최소화하세요. 지연은 조직 형태와 분자 질을 손상시킬 수 있으며; 조직 채취 및 보존의 중요한 시기에 대한 추가 세부 사항은 표 2에 나와 있습니다.

주의: 고정을 위해 파라포름알데히드(PFA)를 사용할 경우, 포름알데히드 증기에 노출되지 않도록 연기 후드 내에서 모든 과정을 반드시 수행해야 합니다.

1. 조직을 해부 직후 처리하며, 의도된 하위 적용에 따라 적절한 프로토콜(4.1, 4.2, 4.3 단계)을 선택합니다.
   1. 파라포름알데히드(PFA) 고정: 조직학적 분석용 조직을 4% PFA에 4°C에서 12-24시간 동안 넣습니다. 고정 후에는 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 조직을 철저히 세척하여 잔류 고정제를 제거한 후, 70% 에탄올로 옮겨 파라핀 박동 및 절편 절단 작업을 기다리며 보관합니다.
2. 최적 절단 온도(OCT) 화합물 임베딩: 신선한 조직을 OCT 화합물에 삽입합니다. 조직을 OCT 화합물이 채워진 몰드에 넣어 기포를 제거하고, 실온에서 5분간 배양한 후 액체 질소의 증기상 상태로 얼립니다. 알루미늄 호일로 밀봉하고 OCT 블록은 −80°C에서 보관하다가 절단 작업을 합니다.
3. 액체 질소 증기상 스냅 얼음: 액체 질소의 증기상 중 RNA, 단백질 또는 대사물 분석을 위해 얼음 결정 형성을 최소화하기 위해 설계된 스냅 프리즈 조직입니다. 조직을 라벨이 붙은 냉동관에 넣고 액체 질소 위에 매달아 빠르게 냉동하세요. 완전히 냉동되면 샘플을 −80 °C 저장으로 옮깁니다.

결과

부검 과정에서 노년 쥐는 종종 신생물 병변을 보이며, 병리학적 소견을 기록하기 위해 신중한 검사가 필요합니다 13,14,16,17,18. 그림 2A는 관류 후 누운 상태의 22개월 된 수컷 C57BL/6 마우스를 보여줍니다. 폐를 완전히 백화하면 효과적인 관류가 확인되며, 간은 부분적인 백색만 나타납니다. 간 정밀 검사 결과 여러 악성 결절(그림 2B), 커진 정낭(그림 2A)과 비장대(그림 2C)가 함께 발견되었습니다. 이러한 결과는 노년 쥐에서 흔히 나타나며, 전체 질병 부담의 일부로 문서화되어야 합니다¹⁸.

그림 3 은 해부와 관류 후 수집된 거시적으로 정상 장기를 보여주어 해부학적 완전성과 관류 효율을 평가할 수 있게 합니다. 소화된 내용물을 제거하기 위해 생리학적 용액으로 위, 대장, 소장이 깨끗하고 투명한 모습으로 변했습니다(그림 3A). 식도, 췌장, 비장, 내장 지방 저장소, 방광이 있는 신장, 림프절, 심장, 흉선 등 추가 구조물도 명확히 식별 가능했으며, 이후 분석을 위해 온전한 상태로 분리할 수 있었습니다(그림 3B, C, E-I).

관류 품질은 혈관이 풍부한 조직에서 백질을 검사하여 평가하였다. 그림 3D와 그림3J에서 보듯, 간과 폐는 관류되지 않은 상태, 잘 관류된 상태, 부분 관류 상태 간에 뚜렷한 차이를 보였습니다. 완전한 백질 검사는 성공적인 관류를 확인했으며, 불완전한 백질 검사는 기술적 변이나 기저 이상을 나타냈습니다. 대동맥, 골격근, 경골, 뇌, 눈, 피부 등 다른 조직들은 형태학이 보존된 채 분리되어 추가적인 조직학, 분자학적 또는 영상 응용에 적합했습니다(그림 3K-P). 이 표준화된 해부 절차는 온전하고 잘 보존된 조직과 장기의 일관된 회수를 제공하며, 다양한 후속 분석을 지원하는 대략적인 해부학적 평가를 가능하게 합니다. 해부 및 장기 채취는 동물당 약 40-60분이 소요되었으며, 이는 운영자의 경험과 병리학적 소견 여부에 따라 달랐습니다.

그림 4는 파라핀 삽입, 절절, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 후 수집된 장기의 노화 관련 변화를 보여줍니다. 노령 쥐의 피부 절편에서는 젊은 대조군과 비교해 상피 얇아짐과 모낭 손실이 관찰되었습니다(그림 4A). 신장 절제에서는 보우먼 캡슐의 확대와 섬유화 및 괴사성 변화, 그리고 림프종과 일치하는 부위가 드러났다(그림 4B). 췌장 절개에서는 노령 동물에서 세포자사체¹⁹ 와 림프종 부위의 증가가 관찰되었으며, 이는 나이가 들면서 조직 완전성이 손상되었음을 나타낸다(그림 4C). 비장 절편은 노령 동물의 아밀로이드 침착물과 림프종 부위를 나타내며, 연령 관련 병리의 추가 특징을 반영합니다(그림 4D).

이 결과들은 여러 조직에서 노화의 대표적인 조직병리학적 특징을 강조하며, 이 프로토콜이 연령 관련 쇠퇴의 구조적 징후를 감지하는 데 유용함을 보여줍니다.

그림 1: 쥐 해리 및 장기 노출 절차의 개요. (A) 흉강과 복강을 개방하기 위한 절개 부위(빨간 선), 횡격막 높이의 횡절개, 양쪽 갈비뼈를 따라 V자형 절개를 하여 흉강을 열고, 횡격막에서 골반까지 양측 절개를 하여 복강을 완전히 노출시키는 중간 절개 부위. (B) 좌심실에 나비 바늘을 삽입하고 효과적인 혈액 배출을 위해 우심방을 절개하는 관류 장치. (C) 공강 노출 후 주요 흉부 및 복부 장기의 해부학적 배치. (D) 두피 제거 및 두개골 개골을 두개골 봉합선을 따라 개개하여 뇌를 노출시키는 두부 해리 단계. 빨간 선은 절개 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 노년 마우스에서 신생물 병변 확인. (A) 4% PFA 관류 후 누운 자세의 대표적인 22개월 된 수컷 C57BL/6 마우스. 폐를 완전히 백화하면 효과적인 관류가 확인되며, 간(녹색 화살촉)은 부분적인 백색만 나타납니다. 파란색 화살촉은 커진 정낭을 나타냅니다. (B) 간 상세 시경에서 여러 악성 결절(검은 화살촉)이 드러난다. (C) 노령 C57BL/6 쥐의 비장이 비판 비장(오른쪽)과 어린 동물의 정상 비장(왼쪽)과 비교됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 해부 및 관류 후 주요 마우스 장기와 조직 완전성 개요. (A) 소화 내용물을 제거하기 위해 생리적 용액으로 세척하기 전후의 위, 소장, 대장. (B) 식도. (C) 비장이 붙은 췌장. (D) 관류 없이 간 상태, 효과적인 관류 후 완전 백질, 부분 백질은 불완전 관류 또는 기저 병리를 나타내는 경우. (E) 내장 지방 조직. (여성) 방광이 붙은 신장. (G) 서혜 림프절. (H) 심장. (I) 티머스. (J) 관류 없이 폐, 효과적인 관류 후 완전 데치, 부분 탈출 상태. (K) 대동맥. (왼쪽) 뒷다리에서 분리된 골격근. (남성) 뼈 구조가 보존된 경골. (N) 뇌. (O) 눈. (P) 피부. 스케일 바: A, C, D, E, F, J, L, N, P 5mm; 다른 모든 패널에는 1mm 두께입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 이용한 주요 장기의 조직학적 분석. (A) 3개월 된 (어린 쥐)와 22개월(노년) 쥐의 피부 절편. 노령 동물의 절편은 상피 얇아짐과 모낭 손실을 보여줍니다. (B) 보우먼의 캡슐을 강조하는 신장 절편. 노령 동물의 절편에서는 구낭 확대, 섬유화 및 괴사 변화, 림프종(주황색 화살촉)이 나타납니다. (C) 젊은 동물과 노령동물의 췌장 절편 검사 중 노령 동물은 세포자멸사 체(파란색 화살촉)와 림프종 부위(주황색 화살촉)가 증가하는 경우. (D) 3개월 된 (어린 쥐) 및 22개월 된 노년의 쥐의 비장 절편 채취. 노령 동물의 절편에서는 아밀로이드 침착물(라임-그린 화살촉)과 림프종 부위가 나타납니다. 스케일 바 (A-C) 100 μm. 스케일 바 (D) 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

표 1: 준비 체크리스트. 튜브 및 몰드 라벨링, 완충제 및 고정제 준비, 냉동 삽입 준비, 해부 도구 멸균, 작업대 배치, 문서 작성 계획 등 쥐 조직 해부 및 보존을 위한 필수 준비 단계별 목록입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 조직 채취 체크리스트. 테이블을 이용해 수집한 조직을 기록하세요. 채취 시간과 상태 또는 이상 사항에 대한 기록을 추가하세요. 연구에 중요한 조직을 우선순위로 삼으세요; 조직 자가용해/분해를 방지하기 위해 권장 기간 내에 가장 관련 있는 장기를 수집하세요. *장기 변색, 결절, 악성 성장, 비정상적인 장기 크기 등 모든 이상 사항을 주의하세요. **보존 방법(PFA 고정, OCT 삽입, 스냅 냉동 포함)을 문서화하는 것을 고려하세요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 젊은 쥐와 노령 쥐에서 다중 장기 시스템을 체계적으로 수집하는 재현 가능한 전략을 제공하여 해부학적, 조직학적, 분자 분석을 가능하게 합니다. 여러 기술적 고려사항이 결과 품질에 영향을 미치고 설명된 방법의 한계를 해결할 수 있습니다. 첫째, 관류 품질의 변동성은 중요한 고려 요소입니다. 불완전한 관류는 조직학, 면역조직화학, 분자 분석에 영향을 미치는 잔류 혈액을 남길 수 있습니다. 경추 탈구 후 관류는 경추 조직에 외상을 일으키고 폐에 혈액 오염을 일으킬 수 있습니다. 따라서 경추 탈구는 훈련된 인력에 의해서만 시행해야 합니다. 최적의 결과를 위해서는 IACUC 및 AVMA 지침¹³에 따라 말기 마취 하에 관류를 수행해야 합니다. 둘째, 고정은 조직 완전성의 중요한 결정 요인입니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)는 널리 사용되지만, 크거나 밀집된 장기에 충분히 침투하지 못해 조직학과 항원 보존이 좋지 않을 수 있습니다. 이 한계는 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 사용하거나 조직을 ≤5mm 단위로 절단하여 침^{투력을 개선}함으로써 완화할 수 있습니다. 셋째, 췌장, 위, 뇌 등 일부 조직은 급속한 자가용해를 겪어 안락사 후 5-10분 이내에 고정 또는 냉동 상태가 필요하며, 사전^{냉각 해부} 도구 사용이 필요합니다. 노령 쥐에서는 신생물이 해부학을 더욱 왜곡하고 해부를 복잡하게 만들 수 있습니다. 고정 부피 부족이나 동결로 인해 추가 인공물이 발생할 수 있으며, 이는 수축과 가장자리 효과를 초래합니다; 이러한 현상은 고정액과 조직 비율을 최소 10:1로 유지하고, 과밀을 피하며, 삽입 전에 OCT 몰드를 미리 냉각함으로써 최소화할 수 있습니다. 마지막으로, PFA와 포르말린 사용은 안전성과 폐기상의 우려를 낳습니다; 글리옥살 기반 고정제는 독성이 적은 대안을 제공합니다. 따라서 표준화된 취급, 최적화된 고정, 그리고 신중한 타이밍이 재현성, 조직 품질, 그리고 하위 분석의 신뢰성을 극대화하는 데 필수적입니다²⁴.

동일한 동물 내 15개 이상의 장기에서 조직을 채취함으로써 이 워크플로우는 피험자당 생물학적 수확량을 극대화하고 동물 사용을 줄이기 위한 윤리적 지침에 부합합니다. 체계적인 절차는 연령 관련 생리학적 저하와 장기 특이적 병리를 조사하는 중간 처리량 연구로 쉽게 확장할 수 있다²⁵.

자가해리 취약성 조직의 신속한 처리는 조직학적 완전성을 유지하는 데 필수적입니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 생리적 용액과 4% PFA를 사용하면 장기 구조를 안정적으로 보존하고 췌장과 소화계 같은 민감한 조직에서 자가용해를 최소화합니다. 단일 장기나 질병 모델에 초점을 맞춘 프로토콜과 달리, 이 접근법은 여러 장기를 빠르고 일관되게 수집할 수 있게 하여 변동성을 줄이고 처리량을 향상시킵니다. 관류부터 최종 조직 절제까지 전체 해부는 동물당 60분 이내에 완료할 수 있어 대규모 또는 시간에 민감한 연구에 적합합니다 ^3,11,26. 정확한 관류-고정 시퀀스를 준수하면 인공물을 최소화하고 재현 가능한 결과를 가능하게 합니다.

조직 채취, 절단, 삽입의 일관성은 특히 종단적 또는 다기관 연구에서 정확한 조직병리학적 평가에 필수적입니다. 조직 처리 방식의 변동성은 인공물을 유발하거나, 병리학적 소견을 불분명하게 하거나, 질병 부담의 오해를 초래할 수 있습니다. 쥐와 생쥐의 장기 샘플링 및 절단을 위한 개정 가이드, 예를 들어 RENI 트리밍 가이드는 이러한 불일치를 최소화하기 위한 상세하고 표준화된 프로토콜을 제공합니다²². 이러한 조화로운 방법의 채택은 연구 및 기관 간 데이터 비교성을 높이고, 재현성을 강화하며, 노화 연구에서 병리학 기반 결과의 신뢰성을 높인다 ^4,9.

다양한 장기를 수집하는 것은 노화 연구에서 특히 중요하며, 장기계가 어떻게 상호작용하는지 이해하는 것이 나이에 따라 전신 생리적 쇠퇴를 일으키는 과정을 밝혀내는 데 필수적입니다. 이 접근법은 다양한 연구 질문에도 도움이 될 수 있지만, 이 프로토콜의 초점은 연령 관련 변화가 여러 장기계에 동시에 영향을 미칠 수 있는 노화 연구를 지원하는 데 있습니다. 그러나 섬유증, 재생, 노화에 초점을 맞춘 연구, 특히 전사체학 통합이나 다조직 바이오마커 발견에 적용할 수 있습니다 ^9,27,28.

조직학적 평가 결과, 여러 조직에서 연령과 관련된 특징적인 변화가 나타났다(그림 4). 피부에서는 노령 동물이 상피 얇아지고 모낭이 소실되는 현상이 나타났습니다. 신장에서는 노년의 마우스 절편에서 보우먼 캡슐 확대와 함께 섬유화, 괴사, 림프성 변화가 나타났다. 노령 동물의 췌장 조직에서는 세포자멸시체와 림프종이 축적되었고, 비장 절제에서는 아밀로이드 침착물과 추가 림프종 부위가 발견되었습니다. 이 관찰은 확립된 쥐 노화 표현형과 일치하며, 노화 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34의 대표적인 조직병리학적 표지자를 검출하는 데 이 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 전임상 노화 모델에서 조직을 수집하고 보존하기 위한 신뢰할 수 있고 확장 가능한 프레임워크를 제공합니다. 탐색적 연구와 가설 기반 연구 모두에서 노화, 퇴행, 회복력의 조직 특이적 및 전신적 메커니즘을 밝히기 위해 채택될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
흡수 패드
C57BL/6J 마우스 및 nbsp;	잭슨 연구소 & nbsp;	#000664
수집 트레이
무선 트리머	브라브미니+	CLP-41590	제모를 위해
에탄올 스프레이 70%	피셔 사이언티브	50-163-3592
엑스트라 겸자 5 INOX	듀몽	F6521-1EA	림프절용 엑스트라 미세 팁 겸자
겸자	밀리포어 시그마	XX6200006P	둔한 끝 겸자
5차 겸자 INOX	듀몽	F6521-1EA	가는 팁 겸자
행크스 밸런스 소금 용액(HBSS) 1개 500 mL	깁코	14025092
마이크로 해부 가위 (직선, 날카로움/날카로움, 25mm)	로보즈 서지컬	RS-5668	표준 마이크로 가위, 스테인리스 스틸, 25mm 블레이드 (M-37)
미세 절단 가위 (직선, 날카로움/날카로운, 가는 칼날)	로보즈 서지컬	RS-5918	미세 해부 가위, 길이 4.5인치 (H-327)
NBF	시그마	HT501128	고정을 위해
생리식염수 용액	시티바	76081-514
최적 절단 온도(OCT)	피셔 사이언티브	23730571
파라포름알데히드 (PFA) 4%	전자현미경 과학	15710	고정을 위해
페트리 접시 100 mL x 15 mL	밀리포어 시그마	P5856-500EA
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코	10010023
핀	아이스코 연구소	DISPINS1	해부 중에 쥐를 고정하기 위해
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젊은 C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소 & nbsp;	#000664