면역블로팅에 의한 Xenopus 난모세포 및 배아의 단백질 최적화 분석

요약

이 기사에서는 면역블로팅을 통해 Xenopus 난모세포 및 배아의 단백질을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 수집 단계가 설명된 후 샘플 처리, SDS-PAGE, 전이, 항체 염색 및 이미징에 해당하는 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 내인성 항체 및 단백질 친화성 태그에 대한 항체를 사용한 번역 조절 단백질 복합체를 연구하는 것을 강조합니다.

초록

도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 단백질 분석과 면역블로팅(웨스턴 블로팅)은 분자 생물학자 툴킷의 중요한 부분입니다. 이 기술은 복잡한 단백질 혼합물을 분자량으로 분리한 다음 특정 항체를 사용하여 표적 단백질의 존재를 분석합니다. 면역블로팅은 다양한 용도로 사용됩니다. 예를 들면 단백질-단백질 상호작용자를 연구하기 위한 표적 접근법으로 사용하거나 단백질 표적의 발현 또는 고갈을 확인하기 위한 대조군으로 사용하는 것이 있습니다. 그러나 면역블로팅을 성공적으로 실행하려면 복잡한 다단계 실험이 필요합니다. 프로토콜은 각 유기체, 표적 단백질 및 응용 분야에 최적화되어야 합니다. 따라서 모델 개구리 Xenopus laevis를 포함한 많은 모델에서 면역 블롯 사용에 대한 지식 격차가 존재합니다.

X . laevis 난모세포와 배아는 크기가 크고 생화학적 실험을 위한 재료가 풍부하며 취급이 용이하기 때문에 번역 제어 원리를 연구하는 데 필수적이었습니다. 그러나 이 종에는 강력하고 일상적인 면역블로팅을 위한 특정 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 여러 Xenopus 발달 단계의 샘플에 최적화된 웨스턴 블로팅을 위한 심층적인 프로토콜을 제공합니다. 그런 다음 개발 전반에 걸쳐 중개 조절자를 분석합니다.

서론

세포 메커니즘을 이해하려면 특정 단백질 종을 모니터링해야 합니다. 일반적인 질문에는 공간적, 시간적으로 발현이 어떻게 변하는지, 어떤 단백질과 상호 작용하는지, 다양한 조건에 반응하여 변형되는지 여부가 포함됩니다. 구어체로 "웨스턴 블로팅"으로 알려진 면역블로팅은 이러한 문제를 해결하기 위한 핵심 방법론입니다. 면역블롯 실험은 복잡한 샘플(예: 전체 세포 용해물)에서 단백질을 분리하고 항체를 사용하여 식별합니다. 구체적으로, 단백질은 변성된 후 크기별로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리됩니다. 크기의 분획된 단백질은 니트로셀룰로오스 멤브레인과 같은 고체 지지체로 옮겨지고 관심 단백질은 항체 시약을 사용하여 식별됩니다. 면역블로팅은 분자 생물학자 툴킷의 표준 부분이 되었습니다. 이는 일반적으로 다양한 상황에서 단백질 발현을 모니터링하거나 면역침전 분석과 같은 실험의 종점으로 사용됩니다. 이러한 장점에도 불구하고 면역블로팅을 통한 정상 상태 단백질 수준의 분석은 분석이 각 단계 및 실험 상황에 맞게 최적화되어야 하기 때문에 어려운 것으로 판명되었습니다(그림 1).

한 가지 어려운 상황은 아프리카 발톱 개구리 Xenopus laevis의 물질을 분석하는 것입니다. X. laevis는 RNA-단백질 상호 작용을 연구하는 데 중요한 유기체입니다. 이 시스템에는 수많은 장점이 있는데, 그 중 가장 중요한 것은 X. laevis가 수백 개의 난모세포를 생산하고 이후에 한 번에 동시에 배아를 발달시킨다는 것입니다. 각 난모세포에는 ~25μg의 비난황자 단백질¹이 포함되어 있어 생화학적 실험을 위한 풍부한 물질을 제공합니다. 난모세포와 배아의 큰 크기(~1250μm)¹는 또한 mRNA 미세 주입을 용이하게 하여 스케일²에서 태그 또는 돌연변이 단백질을 외인성으로 발현합니다. 이러한 특성은 RNA 결합에 대한 단백질의 능력에 관계없이 mRNA에 대한 번역 조절 단백질의 영향을 분석할 수 있는 테더링 기능 분석과 같은 X. laevis에서 번역 제어를 분석하는 강력한 실험을 가능하게 합니다 3,4,5,6. 그러나 Xenopus 난모세포 및 배아의 면역블로팅은 이러한 초기 세포⁷에서 많은 양의 난황 혈소판의 간섭을 포함하여 어려움을 수반하며, 제거하지 않으면 결과가 모호해집니다.

여기에서는 번역 조절 단백질 검출에 중점을 두고 X. laevis 에서 효과적인 면역블로팅을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 최종 면역블롯을 이미징하기 위해 난모세포와 배아를 수집하고 처리하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 또한 최적의 단백질 로딩 및 이미징에 대한 자세한 지침과 샘플의 노른자 오염 방지가 포함되어 있습니다. 또한 Xenopus 단백질과 호환되는 항체를 찾기 위한 가능한 프로토콜 수정 및 전략에 대해 논의합니다. 우리는 연구자들에게 이 활용도가 낮은 모델 유기체에 대한 자체 실험의 일부로 면역블로팅을 쉽게 수행할 수 있는 지침을 제공하려고 합니다.

그림 1: Xenopus 시료 전처리 및 후속 면역블롯 분석을 위한 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 프로토콜에 표시된 동물(X. laevis)에 대한 모든 작업은 UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee를 준수하고 승인했습니다. 사용된 장비, 시약 및 사용된 항체 농도에 대한 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다. 일부 장비는 아래 그림 2에서 볼 수 있습니다.

그림 2: 가공된 배아 추출물 및 면역블로팅용 장비. (A) 원심분리된 X. laevis VI기 난모세포 추출물. 지질과 지용성 단백질이 상단으로 올라가고 비텔로게닌(노른자)과 색소 파편이 펠릿을 형성합니다. (B) 분자량으로 단백질을 분리하는 SDS-PAGE용 장비. (i) 전원 공급 장치, (ii) 수직 전기영동 탱크, (iii) 전기영동 탱크 뚜껑, (iv) 전극 어셈블리, (v) 버퍼 댐, (vi) 프리캐스트 전기영동 젤; 녹색 빗(상단)과 파란색 스티커(하단)를 각각 제거해야 합니다. (C) 멤브레인 이송 장비. 수직 전기 영동 탱크와 뚜껑은 철저히 헹군 후 이송을 위해 재사용됩니다. (i) 기포를 제거하는 롤러, (ii) 전사 클립, (iii) 작은 교반 바, (iv) 두 장의 보호용 파란색 종이 사이에 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, (v) 셀룰로오스 크로마토그래피 여과지, (vi) 전사 스폰지 쿠션, (vii) 전사 조립용 유리 베이킹 접시, (viii) 아이스팩, (ix) 전사 코어. (D) 기타 장비. (i) 겔 이완기(젤 웰 사전 이송 트리밍용), (ii) 젤 카세트 개방 레버, (iii) 집게(멤브레인 취급용), (iv) 용기(멤브레인 고정용), (v) 용기 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. Xenopus 난모세포 및 배아 수집

1. 난자 준비
   1. 상업적 공급업체(Ecocyte Bio Science, Austin, Texas)로부터 제거된 X. laevis 난모세포를 얻^{거나 설명된} 대로 분리 및 제거 8.
   2. 분리된 난모세포를 변형된 바르스 용액(MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl₂, 0.33 mM Ca(NO₃)₂, 0.8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2.4 mM NaHCO₃, pH 7.4)에서 배양합니다.
2. 배아 준비
   1. X. laevis 알을 분리하고 설명된 대로 수정합니다 ^9,10.
   2. 0.25x Marc's Modified Ringer's solution¹¹ (MMR) (1x MMR: 0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES)에서 수정 배아를 배양합니다.
   3. NaOH를 사용하여 pH를 8.2로 조정한 0.1x MMR에 2% 시스테인 용액을 준비합니다.
   4. 수정에 사용되는 접시에서 0.25x MMR을 제거하고 배아를 시스테인 용액으로 덮어 젤리 코트¹²를 제거합니다. 배아가 고르게 노출되도록 용액을 부드럽게 혼합하십시오.
   5. 2배에서 25배 배율의 실체현미경으로 배아를 면밀히 모니터링합니다. 젤리 코트가 녹은 후(일반적으로 3-5분) 배아는 서로 밀접하게 뭉칩니다. 시스테인에 장기간 노출되지 않도록 하십시오.
   6. 시스테인 용액을 제거하고 0.25x MMR로 배아를 여러 번 헹구십시오.
   7. 원하는 성장 단계까지 0.25x MMR로 배양합니다.
3. 1.5mL 튜브에 원하는 수의 배아 또는 난모세포(샘플당 최소 5개 권장)를 수집합니다.
4. 세포가 손상되지 않도록 피펫터로 여분의 배지를 제거합니다.
5. 샘플을 즉시 사용하거나 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 난모세포와 배아는 몇 년 동안 보관할 수 있습니다.

2. 제노푸 스 추출물의 제조

1. 얼린 경우 얼음 위에서 샘플을 해동하십시오.
2. 배아/난모세포당 이중 탈이온수( 재료 표 참조)로 1x로 희석된 냉각된 10x 세포 용해 완충액 10μL를 첨가하고 얼음 위에 미세유봉으로 샘플을 균질화합니다.
3. 시료를 4°C에서 5000g 으로 벤치탑 원심분리기에서 10분 동안 회전시켜 노른자 및 불용성 색소를 포함한 파편을 펠릿화합니다.
4. 펠릿을 피하도록 주의하면서 별도의 1.5mL 튜브로 상청액을 제거합니다(그림 2A).
5. 상청액에 5% w/v 2-메르캅토에탄올이 보충된 동일한 부피의 2x Laemmli 시료 완충액을 첨가하고 95-100°C에서 10분 동안 끓여 시료 단백질을 변성시킵니다.
6. 샘플을 즉시 사용하거나 -20°C에서 몇 달에서 몇 년 동안 보관하십시오.

3. SDS-페이지

1. SDS 러닝 완충액 준비: 1x Tris-MOPS-SDS 완충액(Tris 염기 6.06g, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산[MOPS] 10.46g, SDS 1.0g, 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA] 0.3g, 이중 탈이온수 1000mL).
2. 포장에서 4-12% bis-tris SDS 프리캐스트 젤을 제거합니다. 젤 바닥의 스티커를 제거합니다.
3. 완충 댐 반대편에 있는 전극 어셈블리에 젤을 삽입합니다. 전극 어셈블리를 수직 전기영동 탱크에 넣습니다(그림 2B).
4. 전극 어셈블리와 전기영동 탱크 바닥에 1x Tris-MOPS-SDS 러닝 버퍼를 채웁니다.
5. 젤에서 겔 빗을 부드럽게 제거하고 필펫 실행 완충액을 웰로 넣어 기포를 제거하고 완충액을 평형을 맞춥니다.
6. 사전 염색된 단백질 표준물질 5 μL를 첫 번째 웰에 조심스럽게 로드하고 각 샘플의 10 μL를 추가 웰에 조심스럽게 로드합니다.
7. (선택 사항) 나머지 웰에 10μL의 1x Laemmli 샘플 완충액을 로드하여 겔이 더 고르게 실행되도록 합니다.
8. 전기영동 탱크에 뚜껑을 덮고 전원 공급 장치에 연결합니다. 200V를 적용합니다.
9. 샘플 완충액 염료 전면이 겔을 빠져나갈 때 전기영동을 중지합니다.

4. 멤브레인에 단백질의 습식 전달

1. 샘플이 전기영동되는 동안 1L의 전사 완충액(Tris Base 3.0g, 비신 4.08g, 이중 탈이온수 900mL, 메탄올 100mL)을 준비합니다. 전사 완충액을 4°C에서 미리 식힙니다.
   주의: 농축된 메탄올 스톡은 연기만에서 취급하고 피부와의 접촉을 피하십시오. 메탄올은 에탄올로 대체될 수 있습니다.
2. 전기영동이 완료되기 전에 전사 클립에서 전사 "샌드위치"를 조립하기 시작합니다(그림 2C).
   1. 유리 베이킹 접시에 차갑게 식힌 전사 완충액을 채웁니다. 후속 샌드위치 조립 단계에서 재료가 이 버퍼에 잠겨 있는지 확인합니다.
   2. 검은색 반쪽을 접시 바닥에 대고 흰색 반쪽을 열고 위쪽을 향하게 하고 전사 클립을 왼쪽으로 열어 접시에 전사 클립을 놓습니다.
   3. 전사 클립의 검은색 절반에 하나 또는 두 개의 섬유 스펀지를 평평하게 놓습니다.
   4. 0.35mm 셀룰로오스 크로마토그래피 용지(여과지) 두 장을 크기에 맞게 자르고 스펀지 위에 하나를 놓습니다.
3. 전기영동이 완료되면 전기영동 탱크에서 젤을 제거합니다.
4. 겔 카세트 개방 레버를 사용하여 겔 플레이트를 조심스럽게 들어 올려 겔이 플레이트 중 하나에 부착된 상태로 유지되도록 합니다(그림 2D). 젤 이형제로 젤 상단에서 웰을 다듬습니다.
5. 플라스틱 카세트의 절반에 부착된 젤을 여과지 위에 놓습니다. 젤이 여과지에 남아 있도록 카세트 절반을 제거합니다.
6. 겔의 치수에 맞게 0.45μm 니트로셀룰로오스 멤브레인의 정사각형을 자릅니다. 보호지에서 멤브레인을 제거하고 전사 완충액에 잠시 적신 다음 젤 위에 놓습니다.
   알림: 멤브레인의 원치 않는 단백질 오염을 방지하기 위해 장갑이나 집게로 멤브레인의 모서리를 조심스럽게 다루십시오.
7. 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 두 번째 여과지를 놓습니다. 여과지 위에 롤러를 사용하여 기포를 부드럽지만 단단히 제거합니다.
8. 여과지 위에 섬유 스펀지를 1-2개 더 쌓습니다.
9. 전사 카세트를 닫고 단단히 닫아 '샌드위치'를 완성합니다.
10. 전사 클립이 위쪽을 향하고 전사 클립의 검은색 면이 코어의 검은색 면을 향하도록 전사 샌드위치를 전사 코어에 삽입합니다.
11. 전사 코어를 전기 영동 탱크에 넣습니다. 젓는 막대가 자유롭게 회전할 수 있도록 탱크에 아이스팩과 젓는 막대를 추가합니다.
    참고: 아이스팩 외에 또는 얼음팩 대신 4.13단계의 냉장실에서 이송을 실행할 수 있습니다.
12. 냉각된 전사 완충액으로 탱크를 채웁니다. 뚜껑을 위에 단단히 고정합니다.
13. 전송 장치를 전원 공급 장치에 연결하고 전극 색상을 정렬하십시오. 교반 막대가 회전하면서 4°C에서 1시간, 100V, 이송을 실행합니다.

5. 전사 후 멤브레인 처리

1. 10x Tris-완충 식염수(100mM Tris 염기, 1.5M NaCl)를 준비합니다. pH를 8로 조정하고 필터로 살균합니다.
2. 10x TBS 용액을 500mL 이중 탈이온수에 1:10으로 희석하고 500μL Tween-20을 첨가하여 Tween-20(TBSTw)을 함유한 1x Tris-Buffered Saline을 준비합니다.
3. 차단 완충액(500mL TBSTw, 무지방 분유 25g)을 준비합니다.
   참고: 탈지 우유는 차단 완충액에서 2-5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 대체될 수 있습니다. 우유에는 비오틴이 포함되어 있으므로 실험 응용 프로그램에 비오틴화된 단백질을 시각화하는 것이 포함되는 경우 BSA를 사용해야 합니다.
4. 이송이 완료되면 샌드위치를 조심스럽게 제거 및 분해하고 니트로셀룰로오스 멤브레인을 제거합니다. 멤브레인의 어느 쪽이 겔과 접촉하고 있는지 표시하고 후속 단계에서 이 면이 위로 향하도록 유지합니다.
5. 단백질 시각화를 위한 가역적 염색인 폰소 염색제(0.5% 폰소 S, 1% 아세트산) 50mL를 준비합니다.
   주의: 폰소 얼룩은 부식성이 있습니다. 피부와의 접촉을 피하십시오.
6. 멤브레인을 작은 용기( 그림 2D 참조)에 넣어 용기 바닥과 같은 높이가 되도록 합니다. 멤브레인을 퐁소 얼룩으로 덮어 담그고 로커 위에서 5-10분 동안 부드럽게 흔듭니다.
7. 퐁소 얼룩을 붓습니다.
   알림: 폰소 얼룩은 여러 번 재사용할 수 있습니다.
8. 과도한 폰소가 제거되고 레인의 단백질 밴드가 분해되기 시작할 때까지 이중 탈이온수로 반복적으로 세척하여 멤브레인을 헹굽니다.
9. 명확하게 해결된 밴드가 있는 직선적이고 균일한 차선의 존재로 전송 효율성을 확인하십시오.
10. 남은 액체를 붓고 블롯을 차단 완충액에 담가 다운스트림 단계에서 멤브레인에 비특이적 항체가 결합하는 것을 방지합니다.
11. 실온에서 30-60분 동안 로커를 부드럽게 흔듭니다.

6. 항체 배양

1. 1차 항체를 10mL의 신선한 차단 완충액에 원하는 농도로 희석합니다.
   참고: 최적의 농도는 각각의 새로운 항체에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 일반적인 시작점은 1:1000이거나 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
2. 차단 완충액을 제거하고 항체 혼합물로 교체합니다. 4°C에서 하룻밤(~16시간) 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
3. 1차 항체 용액을 붓고 막을 용액에 담그고 빠르게 부어 TBSTw로 헹구십시오.
   참고: 대부분의 항체 혼합물은 저장하고 2-3번 재사용할 수 있습니다. 이는 각 항체에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다.
4. 멤브레인을 TBSTw에 담그고 실온에서 5분 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다. 총 5분 동안 세 번 세탁합니다.
5. 2차 항체를 30mL의 TBSTw에 원하는 농도로 희석합니다.
   참고: 농도는 각 항체에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 일반적으로 1:30,000을 사용합니다.
6. TBSTw 세척액을 붓고 2차 항체 혼합물로 교체합니다. 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
7. TBSTw로 멤브레인을 한 번 빠르게 헹구고 5분 동안 TBSTw 세척을 세 번 합니다.

7. 필름 현상액에서 멤브레인 이미징

1. 암실에서 필름 현상액을 켜고 예열합니다.
2. 멤브레인을 감쌀 수 있을 만큼 큰 플라스틱 랩 두 개의 정사각형을 자릅니다. 집게를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플라스틱 랩의 첫 번째 사각형에 '앞면이 위로' 놓습니다.
3. 1.5mL 튜브에 동일한 양의 강화 화학발광(ECL) 루미놀 및 인핸서 시약을 혼합합니다. 1mL의 혼합 용액을 사용하면 대부분의 멤브레인을 덮어야 합니다.
4. ECL 시약을 멤브레인에 피펫팅하고 플라스틱 랩을 사용하여 멤브레인을 부드럽게 조작하여 완전히 덮습니다. 1분 동안 배양합니다.
5. 집게로 멤브레인을 잡고 액체를 부드럽게 털어내거나 멤브레인의 모서리를 종이 타월에 대고 액체를 흡수하여 과도한 ECL 시약을 제거합니다.
6. 멤브레인을 플라스틱 랩의 두 번째 사각형 위에 앞면이 위로 향하게 놓고 느슨하게 밀봉될 때까지 멤브레인 위에 플라스틱 랩을 접습니다. 포장된 멤브레인을 자가방사선 촬영 카세트에 단단히 테이프로 붙입니다.
7. 암실에서 테이프로 붙인 멤브레인을 덮는 카세트 안에 필름을 놓습니다. 카세트를 단단히 닫고 필름을 멤브레인에 1분 동안 노출시킵니다.
8. 노출된 필름이 멤브레인을 따라 끌리지 않도록 주의하면서 필름을 조심스럽게 제거합니다. 필름 현상액에 공급합니다.
9. 현상된 필름을 평가한 후 원하는 단백질 시각화가 달성될 때까지 후속 필름으로 노출 시간을 조정합니다. 단백질 시각화가 약한 신호를 제공하는 경우 보다 민감한 ECL 시약으로 ECL 시약 배양 단계를 반복하고 다시 이미징합니다.
10. 현상된 필름을 야광 마커에 맞추고 이 참조를 사용하여 멤브레인에 미리 염색된 단백질 표준물질의 위치를 필름에 표시합니다.
11. 이미징이 완료되면 플라스틱 랩에서 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 TBSTw에 담가 남은 ECL 시약을 씻어냅니다.

8. (선택 사항) 추가 항체 배양

참고: 면역블롯 스트리핑은 변성 용액(스트리핑 완충액)으로 초기 1차 및 2차 항체를 제거하여 블롯을 다른 항체로 다시 프로빙할 수 있도록 하는 것을 의미합니다. 재프로빙을 통해 동일한 면역블롯을 다른 단백질 표적의 발현에 대해 분석하고 알려지지 않은 단백질을 표준으로 기능하는 잘 특성화된 단백질과 비교할 수 있습니다. 비교적 약한 신호를 생성하는 항체로 먼저 프로브합니다. 이렇게 하면 후속 노출에서 불완전하게 벗겨진 항체로 인한 아티팩트를 방지하고 블롯의 반복적인 스트리핑으로 인한 단백질 손실의 영향을 최소화할 수 있습니다.

1. 멤브레인을 스트리핑 완충액에 담그고 5-10분 동안 부드럽게 흔들어 결합된 항체를 벗겨냅니다.
2. 스트리핑 완충액에서 멤브레인을 제거하고 TBSTw에서 잠시 헹구어 잔류 스트리핑 용액을 제거합니다.
3. 멤브레인을 차단 완충액에 담그고 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
4. 원하는 농도의 차단 완충액에 1차 항체의 새로운 용액을 만듭니다.
5. 새로운 1차 항체 희석액을 멤브레인에 첨가하고 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
6. 6.3단계부터 진행합니다. 멤브레인을 벗겨내고 최대 3번까지 추가로 다시 프로브할 수 있습니다.

결과

면역블로팅 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해 우리는 세 가지 유형의 X. laevis 샘플에서 친화성 태그 및 내인성 번역 제어 단백질을 분석했습니다: VI기 난모세포, 7기 배아(포배) 및 10.5기 배아(gastrula). 이 단계는 강력한 접합 전사의 시작을 표시하는 중간 포배 전이(단계 8.5)에 걸쳐 있기 때문에 선택되었습니다^13,14. 중간 포배 전이 이전의 발달은 전사가 없는 상태에서 발생하기 때문에 접합 전(즉, 모체 제어) 배아는 올바른 시간 및 공간 해상도에서 세포 운명 단백질을 발현하기 위해 번역 제어 메커니즘에 크게 의존합니다¹⁵. 따라서 중간 포배 전이는 RNA-단백질 상호 작용을 연구하는 데 중요한 맥락입니다.

면역블로팅을 통해 단백질 발현을 분석하기 위해 X. laevis 난모세포 및 배아에 X. laevis Bicaudal-C(Bicc1)의 C-말단 절반을 암호화하는 500pg의 mRNA를 3x 헤마글루티닌(HA) 친화성 태그에 주입했습니다. 우리는 Xenopus 생물학 및 단백질-RNA 상호 작용과의 관련성 때문에 Bicc1을 분석하기로 결정했습니다. Bicc1은 초기 배아에서 세포 운명 결정을 안내하는 mRNA 결합 단백질이자 번역 억제인자입니다 16,17,18. 발달 후반에는 좌우 패턴 19,20,21과 신장을 포함한 장기의 기능(22,23,24,25)에 영향을 미칩니다. Bicc1에는 번역 억제⁵ 및 특정 mRNA에 대한 결합을 매개하는 hnRNP K 상동성(KH) 도메인을 지시하는 영역이 포함되어 있습니다 5,26,27,28.

추출물은 5개의 HA-Bicc1 주입된 난모세포 또는 배아로부터 음성 대조군으로 상응하는 주입되지 않은 샘플과 함께 준비되었습니다. 각 추출물의 10분의 1을 4-12% 구배 bis-tris 겔에서 전기영동하고 니트로셀룰로오스 멤브레인에 습식 전사했습니다. 총 단백질을 검출하기 위한 멤브레인의 폰소 염색은 성공적인 전달을 확인했습니다(그림 3A). 연구의 일환으로 우리는 토끼에서 인간 Bicc1 단백질의 C 말단 절반을 인식하는 항체를 생성했습니다. 이 항체는 내인성 및 외인성 Xl-Bicc1 단백질을 검출하는 데 사용되었습니다(그림 3B). 이전 연구에서는 Bicc1 단백질이 X. laevis 난모세포에 없지만 접합 게놈이 활성화되기 전에 사전 MBT 배아에서 발현되는 것으로 나타났습니다¹⁶. 이것은 Bicc1 mRNA가 난자 형성 중에 축적되는 동안 번역 억제됨을 시사합니다. 이 이전 연구와 일치하여 내인성 Bicc1은 난모세포에서 검출되지 않았습니다. 대조적으로, 항체는 7기 및 10.5기 배아 모두에서 내인성 Bicc1(~MW 107kDa)을 인식했습니다. 종합하면, 이러한 결과는 항체가 내인성 Bicc1 단백질을 인식한다는 것을 검증합니다(그림 3B, 상단 패널, 빨간색 화살촉). Bicc1 항체는 mRNA 주입 샘플에서 준비된 추출물에서 약 70kDa의 더 작은 단백질을 인식했습니다(그림 3B, 상단 패널, 검은색 화살촉, 레인 2, 4 및 6을 레인 1, 3 및 5와 비교). Bicc1 항체의 특이성에 대한 대조군으로서, 멤브레인을 벗겨내고 HA 친화성 태그에 대한 항체로 다시 조사했습니다. HA 항체는 주입된 샘플에서 70kDa 단백질을 식별했지만 내인성 Bicc1은 인식하지 못했습니다(그림 3B, 두 번째 패널, 검은색 화살촉). HA-Bicc1 C-항의 검출은 다양한 세포 유형에서 주입된 mRNA의 단백질 발현 차이로 인해 단계에 따라 강도가 다릅니다.

다음으로, Bicc1과 상호 작용하는 내인성 번역 조절 단백질의 발현을 테스트하여 결과를 확장했습니다. 먼저, 우리는 큰 스캐폴드 단백질이자 Ccr4-Not 데데닐라제(CNOT) 복합체의 일부인 Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1(Cnot1)의 발현을 분석했습니다. 다중 서브유닛 CNOT 복합체는 주요 진핵생물 데데닐라제 중 하나이며 주로 분해의 전주곡으로 메신저 mRNA 말단의 폴리(A) 꼬리를 트리밍하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 이 복합체는 데데닐화를 넘어서는 번역 제어에서 다양한 역할을 합니다²⁹. 우리는 mRNA 조절에 대한 CNOT 복합체의 중요성과 Cnot1이 Bicc1^20,30과 상호 작용한다는 이전 관찰로 인해 Cnot1 발현을 분석하는 데 관심이 있었습니다. Cnot1 발현을 분석하기 위해 내인성 Cnot1 단백질을 인식하는 항체를 사용했습니다. 각 샘플에서 250kDa 및 270kDa에서 Cnot1의 예측 크기인 두 개의 단백질을 확인했습니다(그림 3B, 세 번째 패널). 따라서 이 프로토콜을 통해 규제 복합체의 중요한 구성 요소를 쉽게 식별할 수 있습니다. 또한 이 데이터는 고분자량 단백질을 성공적으로 식별하는 프로토콜의 능력을 뒷받침합니다.

이러한 결과의 일반화 가능성을 추가로 테스트하기 위해 다음으로 중역 억제에 관여하는 저명한 DEAD-box 헬리카제인 DEAD-box 헬리카제 6(Ddx6, 이전에 Xenopus에서는 xp54, 초파리에서는 me31b로 알려짐)의 존재에 대해 샘플을 분석했습니다. Ddx6는 리보핵단백질 과립의 중요한 구성 요소이며 mRNA 저장에 관여하며 Bicc1^및 Cnot1 ^6,31,32와 상호 작용합니다. 내인성 Ddx6를 인식하는 항체는 각 샘플에서 약 54kDa의 단백질을 확인했습니다(그림 3B, 네 번째 패널). 발현은 접합 배아에서 감소되었으며(그림 3B, 레인 5 및 6을 1-4로 비교), 이전에 보고된 바와 같이³³.

마지막으로, 샘플 간에 관찰된 차이가 발현 차이로 인한 것인지 확인하기 위해 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(Gapdh) 효소를 인식하는 항체로 면역블롯을 제거하고 다시 조사했습니다. Gapdh는 유비쿼터스하게 표현되는 "로딩 제어" 역할을 합니다. 동등한 수준의 Gapdh 발현은 Ponceau 염색을 확인합니다: 샘플 전반에 걸쳐 동일한 양의 총 단백질이 분석되고 있습니다(그림 3B, 다섯 번째 패널).

함께 이러한 결과는 이 면역블롯 방법의 효능을 확인합니다. 우리는 RNA-단백질 상호작용 연구와 관련된 여러 X. laevis 발달 단계에 걸쳐 외인성 및 내인성 Bicc1을 식별할 수 있었습니다: 모체가 침착한 mRNA만 포함하는 난모세포 및 pre-MBT 배아, 그리고 결합적으로 전사된 mRNA도 포함하는 post-MBT 배아. 우리는 다양한 분자량(Bicc1, Cnot1 및 Ddx6)과 로딩 대조군(Gapdh)에서 다중 번역 대조 단백질의 발현을 분석하여 이러한 결과를 일반화할 수 있었습니다. 우리는 또한 이 프로토콜이 X. tropicalis 배아에 더 작은 크기를 설명하기 위해 사용되는 재료의 양을 늘리기 위해 수정하여 사용할 수 있음을 보여줍니다(보충 그림 1).

그림 3: X. laevis에서 면역블로팅을 통한 번역 조절 단백질의 수준 확인. (A) X. laevis VI기 난모세포, 7기 배아 및 10.5기 배아에서 총 단백질을 식별하기 위한 면역블롯의 폰소 염색. 각 레인은 추출물(0.5개의 난모세포 또는 배아)에서 준비된 단백질의 10%를 나타냅니다. (B) VI기 난모세포, 7기 배아 및 10.5기 배아에서 선택된 X. laevis 번역 조절 단백질의 면역블롯 분석. 레인 2, 4 및 6은 분석 전에 HA-Bicc1 mRNA를 미세 주입한 샘플에 해당하며, 레인 1, 3 및 5는 음성(주입되지 않은) 대조군 역할을 합니다. α-Bicc1 항체를 사용하여 단계 전반에 걸쳐 내인성 Bicc1의 발현을 분석했습니다(상단 패널). 이후 블롯을 벗겨내고 α-Bicc1 항체 특이성에 대한 대조군으로 HA 친화성 태그에 대한 항체로 다시 조사했습니다(두 번째 패널). 블롯을 제거하고 α-Cnot1(세 번째 패널) 및 α-Ddx6(네 번째 패널)을 사용하여 추가 조절 단백질에 대해 다시 조사했습니다. α-Gapdh(하단 패널)는 동일한 단백질 로딩을 위한 대조군 역할을 했습니다. 빨간색 화살촉은 내인성 Bicc1의 위치를 표시하고, 검은색 화살촉은 외인성 발현 HA-Bicc1 C-term의 위치를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: Xenopus laevis 대 Xenopus tropicalis에서 Bicc1 단백질의 면역블롯 분석. α-Bicc1 항체를 사용하여 서로 다른 양의 X. laevis 및 X. tropicalis 배아 추출물에 걸쳐 내인성 및 외인성 Bicc1의 발현을 분석했습니다. 레인 1: 0.5 주사되지 않은 X. laevis 배아. 레인 2: 0.5 HA-Bicc1 주입된 X. laevis 배아. 레인 3: 주사되지 않은 X. tropicalis 배아 3개. 레인 4: 주사되지 않은 X. tropicalis 배아 1개. 레인 5: 0.5 주사되지 않은 X. tropicalis 배아. 내인성 Bicc1을 인식하는 두 가지 항체를 사용했습니다: 하나는 인간 Bicc1에 대해 제기된 항체(상단 패널)와 다른 하나는 X. laevis Bicc1에 대해 제기된 항체(중간 패널). α-Gapdh(하단 패널)를 사용하여 동일한 단백질 로딩을 제어했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

개념은 간단하지만 면역블로팅은 며칠에 걸친 여러 단계로 인해 실제로 어렵습니다. 따라서 일관되고 고품질의 결과를 얻는 것은 종종 어려운 일입니다. 그럼에도 불구하고 면역블로팅은 현대 생물학의 필수적이고 유비쿼터스 구성 요소입니다. 예를 들어, 면역블로팅은 X. laevis 난모세포 및 배아에서 미세 주입된 mRNA의 성공적인 번역 및 발현을 확인하는 데 중요하며, 이는 X. laevis 연구에 대한 중요성을 강조합니다. 또한, 면역침전 실험은 면역블로팅을 활용하여 생체 내 단백질-단백질 상호 작용을 분석합니다. 특정 단백질의 효율적인 검출은 단백질의 풍부함과 항체 검출 시약의 품질에 크게 좌우됩니다. 이 연구에서 우리가 분석한 내인성 단백질의 추정 농도는 Xenopus 알에서 거의 500배에 달하지만 (Bicc1: 37.22 nM, Cnot1: 115.08 nM, Ddx6: 980.55 nM, Gapdh: 17,907.26 nM)³⁴, 그러나 모두 쉽게 검출되었습니다. 이 범위 이하에서는 필요한 경우 검출의 정확성과 효율성을 향상시키기 위해 샘플 수집에서 이미징에 이르기까지 면역블롯의 본질적으로 모든 단계에서 워크플로우를 수정할 수 있습니다.

어떤 유형의 SDS-PAGE 겔과 멤브레인을 사용할지는 모든 면역블로팅 실험의 주요 고려 사항입니다. 우리의 경험에 따르면 프리캐스트 젤은 사내에서 생산된 젤보다 더 쉽고 재현 가능합니다. 프리캐스트 겔은 겔이 위에서 아래로 폴리아크릴아미드 농도가 점차적으로 증가하는 그라데이션 형식으로 제공된다는 추가 이점이 있습니다. 그래디언트 겔을 통해 연구자들은 분자량이 크게 다른 광범위한 단백질을 분해하고 분석할 수 있습니다. 이렇게 하면 고분자량 단백질을 분해하는 낮은 아크릴아마이드 비율 겔(<7%)과 저분자량 단백질을 더 잘 분해하는 높은 비율 겔(>12%)을 선택하는 것 사이의 일반적인 절충안을 피할 수 있습니다. 단백질 전달을 위해 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 사용할지 여부를 고려하는 것도 중요합니다. 각 멤브레인 유형의 메커니즘과 장점은 광범위하게 논의되었습니다^35,36. 요컨대, PVDF는 니트로셀룰로오스 멤브레인보다 단백질 결합 능력이 높고(따라서 감도가 높음) 반복 사용에 더 내구성이 있습니다. 그러나 PVDF는 메탄올 배양에 의한 활성화 형태의 추가 처리가 필요하며 더 비쌉니다. 두 멤브레인 모두 대부분의 응용 분야에 적합하다는 것을 알았지만 비용 고려 사항으로 인해 일상적으로 니트로셀룰로오스를 사용합니다.

면역블롯을 이미징하는 것은 프로토콜의 중요한 구성 요소입니다. 이 단계에서 연구자는 필요한 모든 정보를 전달하면서도 배경 소음을 최소화하는 면역 블롯의 이미지를 캡처하기 위해 판단을 내려야 합니다. 표준 HRP 접합 항체에는 X선 필름 또는 디지털 이미징 시스템의 두 가지 주요 이미징 방법이 있습니다. 우리의 경험에 따르면 X선 필름으로 이미지를 캡처하면 많은 이점이 있습니다. X선 필름은 일반적으로 디지털 이미징 시스템보다 훨씬 더 민감하여 저농도 단백질의 검출을 용이하게 합니다. X선 필름은 또한 고해상도로 주석을 달고 디지털화할 수 있는 실험의 물리적 기록을 생성합니다. 그러나 디지털 이미징 시스템은 필름 현상액보다 훨씬 우수한 선형 범위(신호 강도와 이미지 강도 사이의 관계)를 갖습니다. 감도로 인해 X선 필름은 빠르게 과다 노출되어 정량적 정보를 잃을 수 있습니다. 따라서 결과의 정확한 정량화를 원하는 연구자는 디지털 이미징 시스템을 사용하거나 X선 필름으로 현상 면역얼룩을 과다 노출하지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다.

이미징 시 희미하거나 "흐릿한" 밴드와 같이 설명한 프로토콜을 따른 후 면역블로팅 결과가 만족스럽지 않은 경우 결과를 개선하기 위해 여러 가지 조정을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 분석된 Xenopus 단백질 혼합물의 양을 조정할 수 있습니다. 배아의 5분의 1에 불과한 총 단백질은 강력한 결과를 생성할 수 있지만 젤 레인당 최대 2개의 배아 또는 난모세포를 로드할 수 있습니다. 너무 많은 단백질을 로드하면 이미징 중에 인공물 또는 가짜 높은 배경 신호가 발생할 수 있습니다. 또한 더 긴 실행 시간을 위해 더 낮은 전압(100V)에서 전기영동하면 일반적으로 더 날카로운 단백질 밴드가 생성됩니다. 유사하게, 100V에서 한 시간 대신 저전압(30V)에서 4°C에서 밤새 단백질 전달을 수행하면 특히 고분자량 종의 경우 단백질 검출이 향상될 수 있습니다. 마지막으로, 일부 1차 항체 배양은 밤새 4°C가 아닌 실온에서 1시간의 배양을 사용하여 표적을 보다 강력하게 검출합니다. 이 프로토콜 수정은 각 1차 항체에 대해 테스트해야 합니다.

내인성 단백질을 검출하기 위한 항체를 식별하는 것은 상업적으로 이용 가능한 Xenopus 특이적 항체가 상대적으로 적기 때문에 Xenopus에서 면역블로팅에 큰 도전이 됩니다. 연구자들은 Xenbase³⁷(https://www.xenbase.org/xenbase/), Developmental Studies Hybridoma Bank(https://dshb.biology.uiowa.edu/) 및 European Xenopus Resource Center(https://xenopusresource.org/)와 같은 Xenopus 항체의 비상업적 공급원의 혜택을 누릴 수 있습니다. 대안적으로, 인간 또는 마우스 단백질을 인식하기 위해 생성된 항체는 항체 생산에 사용되는 영역의 보존에 따라 상동 Xenopus 단백질을 검출하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 이 프로토콜에 제시된 Bicc1 항체는 인간 Bicc1 단백질에 대해 제기되었습니다. 이러한 시약의 경우 Xenopus 단백질과 교차 반응하는 능력은 경험적으로 결정되어야 합니다. 회사가 항체를 만드는 데 사용하는 정확한 에피토프는 일반적으로 독점적이지만 많은 회사가 요청 시 에피토프에 대한 아미노산 범위를 제공합니다. 그런 다음 이 영역은 상동 Xenopus 단백질의 해당 영역과 정렬될 수 있습니다. 성공이 보장되지는 않지만, 표적 종에서 항체 생산에 사용되는 에피토프가 Xenopus의 유사한 서열 확장과 최소 75% 이상의 유사성을 나타낼 때 일반적으로 성공했습니다. 비-Xenopus 단백질에 대해 생성된 항체는 항체의 부적절한 검증이 재현 불가능한 연구의 주요 원인이므로 광범위하게 사용하기 전에 검증되어야 합니다^38,39. 이것은 mRNA 미세 주입⁴⁰을 통해 배아에서 관심 있는 태그된 Xenopus 단백질을 발현함으로써 수행될 수 있다. 그런 다음 친화성 태그에 대한 항체로 동일한 샘플을 분석하여 내인성 단백질에 대한 항체와 태그가 지정된 단백질에 대한 항체가 모두 동일한 개체를 인식하는지 확인합니다(그림 3B 참조).

RNA 결합 단백질, 특히 Bicc1과 같은 조절 기능을 가진 단백질의 분석은 시약이 부족하고 일반적으로 강력한 조절 분자의 발현이 낮기 때문에 어려울 수 있습니다. 이 문제는 각 시약을 개별적으로 최적화해야 하는 면역블로팅에서 더욱 분명해지며, 충분한 특이성과 민감도를 가진 항체를 찾는 것이 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 우리의 의도는 Xenopus 에서 면역블로팅의 특정 한계를 해결하고 연구자가 RNA 결합 단백질 분석의 어려움을 극복할 수 있도록 다른 시스템에 적용할 수 있는 단계를 자세히 설명하는 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100평방피트 헤비 듀티 프리미엄 랩	사란	2570000130
10배 세포 용해 버퍼	세포 신호 전달 기술	#9803
2-머캅토에탄올	시그마-올드리치	M3148
2쿼트 타원형 베이킹/서빙 접시	파이렉스	71160010116
2x Laemmli 샘플 버퍼	바이오-래드	#1610737
항-HA 고친화성 항체	로슈	11867423001	지시대로 1:10,000 희석으로 조제하고 사용.
항토끼 IgG, HRP 연결 항체	세포 신호 전달 기술	7074S	1:30,000 희석 시에 사용되었습니다.
자동방사선 촬영 카세트, 5 x 7인치	리서치 프로덕츠 인터내셔널	420057	디지털 영상 시스템을 사용할 경우에는 필요하지 않습니다.
벨아트 일회용 공약	밀리포어 시그마	BAF199230001
Bicaudal-C (인간) 토끼 항체	엔비고 바이오프로덕츠 (현재 아이노티브)	해당 없음	맞춤 주문 주문이에요. 1:20,000 희석 비율로 사용.
Bicaudal-C (Xenopus) 토끼 항체	엔비고 바이오프로덕츠 (현재 아이노티브)	해당 없음	맞춤 주문 주문이에요. 1:20,000 희석 비율로 사용. 참고문헌: Park 외, 2016
소 혈청 알부민	시그마-올드리치	A3294	블로킹 버퍼로 무지방 우유를 대체하는 재료입니다.
원심분리기 5425	에펜도르프	13-864-456
CL-X포슈어 필름	서모피셔 사이언티픽	34091	디지털 영상 시스템을 사용할 경우에는 필요하지 않습니다.
CNOT1 (D5M1K) 토끼 단클론 항체	세포 신호 전달 기술	#44613	1:2,000 희석 비율로 사용.
DDX6/RCK (D26C11) 토끼 단클론 항체	세포 신호 전달 기술	#8988	1:5,000 희석 비율로 사용했습니다.
E-Z 스토어 및 포어 현상기	MXR 이미징	103633	디지털 영상 시스템을 사용할 경우에는 필요하지 않습니다.
E-Z 스토어 및 포어 픽서	MXR 이미징	114511	디지털 영상 시스템을 사용할 경우에는 필요하지 않습니다.
GAPDH 단일클론 항체	프로틴테크	60004-1-Ig	1:40,000 희석 시에 사용.
젤 릴리버	바이오-래드	#1653320
염소 항생쥐 IgG (H+L) 2차 항체, HRP	인비트로젠	A16066	지시대로 조제하여 1:40,000 희석 비율로 사용.
아이스팩, 8온스, 5 x 3 x 1"	울린	S-18256
L-시스테인	시그마-올드리치	C7352
의료 필름 현상	코니카 미놀타	SRX-101A	디지털 영상 시스템을 사용할 경우에는 필요하지 않습니다.
미니-프로티안  카세트 개폐 레버	바이오-래드	#4560000
미니-프로티안  테트라 수직 전기영동 셀	바이오-래드	#1658004
MSE PRO 700ml 웨스턴 블롯 전기영동 탱크	MSE 서플라이	BB2369
니트로셀룰로오스 멤브레인, 0.45 및 마이크로; m	바이오-래드	#1620115
무지방 건조 우유	사날락	1570000180
페르옥시다제 아피니퓨어 염소 항쥐 IgG (H+L)	잭슨 면역연구소	112-035-003	지시에 따라 1:100,000 희석 비율로 조제하고 사용.
폴리소르베이트 (트윈) 20	피셔 바이오리에이전트	BP337-500
폰소 S	VWR 생명과학	K793-500ML	0.5% 폰소 S, 1% 아세트산으로 근사적으로 측정할 수 있습니다
파워팩 기본 전원 공급 장치	바이오-래드	1645050
PR1MA 가변 속도 2D 로커	중과학	R2D-30
프리시전 플러스 단백질 듀얼 컬러 스탠다드 래더	바이오-래드	#1610374	원하는 단백질 사다리는 어떤 것도 사용할 수 있습니다.
순수 셀룰로오스 크로마토그래피 필터 페이퍼, 0.35 mm	피셔 사이언티브	05-714-4
서부 블롯 제거 버퍼 복원	서모피셔 사이언티픽	#21059
소금	피셔 케미컬	S640-10
저장 상자 300 mL	로스티 메팔	RST46608	니트로셀룰로오스 막 차단, 항체 배양 및 세척을 위해
SuperSignal West 펨토 최대 감도 기판	서모피셔 사이언티픽	#34094	루미놀과 증강제의 두 성분을 포함하는 향상된 화학발광(ECL) 기판입니다. 이 ECL 시약은 펨토그램 감도가 낮습니다.
슈퍼시그널 웨스트 피코 PLUS 화학발광 기판	서모피셔 사이언티픽	#34580	루미놀과 증강제의 두 성분을 포함하는 향상된 화학발광(ECL) 기판입니다. 이 ECL 시약은 피코그램에서 펨토그램 사이의 감도를 가지고 있습니다.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4– 12%, 10웰 폴리아크릴아마이드 젤	젠스크립트	M00652
트랜스퍼 버퍼 파우더	젠스크립트	M00652
트리스 베이스 울트라퓨어	USBilogical(생전학)	77-86-1
Tris-MOPS-SDS 러닝 버퍼 파우더	젠스크립트	M00138