엔도좀은 세포내 분류 소기관의 집합체로, 세포 내세포막 수송 경로의 일부입니다. 자동 나노여과 장치를 사용하여 심장 조직에서 엔도좀을 분리하는 새로운 방법을 확립하고 엔도좀을 일차 심근 세포와 공동 배양하여 엔도좀의 세포 흡수를 조사했습니다.
방법 논문
엔도좀은 세포내 분류 소기관의 집합체로, 세포 내세포막 수송 경로의 일부입니다. 자동 나노여과 장치를 사용하여 심장 조직에서 엔도좀을 분리하는 새로운 방법을 확립하고 엔도좀을 일차 심근 세포와 공동 배양하여 엔도좀의 세포 흡수를 조사했습니다.
엔도좀은 세포 내 트래피킹, 신호 전달 및 막 재활용에 필수적인 역할을 하는 막 결합 소기관입니다. 심혈관 생물학에서 엔도좀의 기능이 인정받고 있지만 심장 조직에서 엔도좀을 효율적으로 분리하는 것은 여전히 중요한 기술적 과제로 남아 있습니다. 우리는 세포내 분획과 초고속 나노여과 분리 플랫폼을 결합하여 마우스 심장 조직에서 엔도좀을 분리하기 위한 신속하고 고수율 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법에는 소포의 순차적 원심분리, 나노여과 및 나노다공성 막 기반 회수가 포함됩니다. 분리된 엔도좀은 웨스턴 블로팅, 동적 광산란(DLS) 및 나노 유세포 분석(NanoFCM) 분석으로 특성화되었습니다. 생체 활성을 평가하기 위해 정제된 엔도좀을 일차 신생아 심근 세포와 공동 배양했습니다. 엔도좀 마커 EEA1 및 Rab7은 분리된 소포에서 매우 풍부했습니다. DLS 분석은 평균 소포 직경이 187.30 ± 23.42 nm이고 제타 전위가 -26.60 ± 5.79 mV(n = 12)인 것으로 나타났습니다. NanoFCM 정량화는 100mg의 심장 조직에서 약 1.07 ± 0.31 × 1012 입자/mL(n = 12)를 산출했습니다. 시험 관 내 공동 배양 후 심근 세포에 의한 엔도좀의 기능적 흡수가 관찰되었으며, 이는 소포 무결성 및 활성의 보존을 나타냅니다. 이 통합 분리 플랫폼은 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 추출하기 위한 재현 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 생화학적 및 기능 연구를 촉진하여 심혈관 생리학 및 질병에서 엔도좀의 역할을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
엔도좀은 엔도사이토시스, 화물 분류 및 신호 전달 경로를 조절하는 필수 세포내 소기관입니다 1,2. 활성화된 신호 전달 수용체 및 기타 하향 조절된 단백질은 처음에 초기 엔도좀(EE) 내의 내강내 소포(ILV)로 분류된 다음 다소포체(MVB) 또는 엔도좀 운반체 소포(ECV)로 성숙합니다. 이 소포는 이후 화물을 리소좀 분해 또는 대체 경로로 유도하기 위한 2차 분류 허브 역할을 하는 후기 엔도좀(LE)과 융합됩니다. ILV는 또한 원형질막과의 엔도좀 융합 후 엑소좀으로 분비될 수 있습니다 3,4 . 동시에, 자가포식 경로는 자가포식체를 통해 세포질 물질을 LE에 전달하며, 자가포식체는 후기 엔도사이틱 구획과 융합될 때 분해 능력을 획득합니다5. 엔도좀은 이제 뉴런 및 심근 세포와 같은 특수 세포와 특히 관련된 수용체 재활용6, 이온 채널 국소화7, 엑소좀 생합8 및 세포간 통신9 과정의 중요한 조절자로 인식되고 있습니다.
새로운 증거는 심혈관 기능에서 엔도좀 경로의 중추적인 역할을 강조했습니다. Eps15 상동성 도메인 단백질 3(EHD3)은 Na+/Ca2+ 교환체 및 L형 Ca2+ 채널을 포함한 주요 심장 이온 수송체의 엔도좀 재활용을 조절합니다. 마우스의 EHD3 결핍은 서맥, 전도 이상 및 Ca2+ 처리 변경으로 이어집니다10. 혈관 평활근 세포의 기능적 엔도좀-리소좀 트래피킹은 만성 신장 질환 및 죽상동맥경화증과 관련된 인산염 유발 내측 석회화를 예방합니다11. 그럼에도 불구하고 심혈관 질환에서 엔도좀의 기능적 역할과 치료 표적으로서의 잠재력은 아직 불완전하게 이해되어 추가 조사가 필요합니다.
여러 가지 방법을 통해 기능적으로 온전한 엔도좀의 생화학적 분리가 가능해졌습니다. Marsh와 동료들은 먼저 밀도-구배 원심분리와 자유 흐름 전기영동을 결합하여 초기 및 후기 엔도좀을 회수하여 산성화 및 구조적 무결성을 보존했습니다12. 자당 구배 접근법과 같은 최근 방법론은 다운스트림 단백질체 및 지질체 연구에 필수적인 초기 및 후기 엔도좀 집단을 분리하기 위한 표준화된 경로를 제공합니다13. 스핀 컬럼 기반 상용 키트는 처리량이 많은 응용 분야를 위해 개발되었습니다.
자동 초고속 분리 시스템을 통한 엑소좀 분리는 혁신적인 초음파 나노여과 기술을 활용하며, 이는 주기적인 음압 진동 및 이중 결합 고조파 진동과 통합된 이중 멤브레인 나노여과 시스템을 사용하여 생체액에서 고순도 엑소좀을 분리할 수 있습니다14. 여기에서는 자동 초고속 분리 시스템을 사용하여 세포 내 분획과 엔도좀 분리를 결합하여 마우스 심장 조직에서 높은 수율 및 고순도로 신속한 엔도좀 분리를 위한 새로운 방법을 달성했습니다.
또한, 추출된 엔도좀을 시험관 내에서 일차 심근세포(CM)와 공동 배양한 결과, 외인성 엔도좀이 CM에 성공적으로 진입하는 것을 발견하였다. 엔도좀 국소 단백질 Numb가 mCherry 적색 형광 단백질15,16과 융합된 엔도좀 리포터를 사용하여 점점 패턴으로 CM 내부에 국한된 mCherry 형광을 관찰했습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
모든 동물 실험은 실험 동물 사용에 관한 국립 보건원의 지침에 따라 휴스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.
참고: 분리 절차를 시작하기 전에 필요한 모든 완충액이 새로 준비되고 4°C로 냉각되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 멸균된 기구, 조직 배양 플레이트 및 적절한 튜브는 지정된 워크스테이션에 배치해야 하며, 달리 명시되지 않는 한 모든 재료는 얼음 위 또는 4°C에서 유지되어야 합니다. 원심분리기와 로터는 사용하기 전에 최소 2-3시간 동안 4°C로 사전 평형을 유지해야 합니다. 분획 완충액은 실험일 전에 준비하여 4°C에서 보관해야 하며, 실험 중에는 필요할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 및 원심분리 단계는 4°C에서 수행되어야 합니다.
1. 심장 용해물 준비
2. 세포하 분획
3. 엔도좀 및 기타 세포내 소포의 분리 과정
4. 엔도좀 단백질 정량 및 소포 특성화
5. 일차 심근 세포 배양
참고: 최대 50개의 신생아 마우스 또는 쥐 심장에서 심근세포를 분리하기 위한 충분한 시약을 제공하는 1차 심근세포 분리 키트를 사용하여 심근 세포를 분리합니다. 이 키트에는 일차 심근 세포 배양을 지원하는 데 적합한 구성 요소도 포함되어 있습니다. 모든 배지와 완충액은 세포를 방해하지 않도록 주의해서 제거해야 합니다. 1000μL 피펫 팁을 사용한 수동 피펫팅이 권장되며 진공 흡인은 피해야 합니다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)은 절차를 시작하기 전에 4°C로 미리 냉각해야 합니다.
6. 심근세포와 동계배양 엔도좀
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
2.6단계와 3.6단계의 심장 조직 용해물, 핵 분획, 미토콘드리아 분획, 기타 세포내 소포, 2.5단계와 3.6단계의 엔도좀의 5개 그룹에서 초기 엔도좀, 후기 엔도좀, 리소좀 및 자가포식체에 대한 마커의 발현 수준을 조사했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 EEA1(초기 엔도좀 항원 1)이 엔도좀에서 가장 높은 발현 수준을 보였고 다른 그룹에서는 거의 발현되지 않았음을 보여주었습니다(그림 2A,B). Rab7은 또한 엔도좀에서 가장 높은 수준으로 발현되었으며(그림 2A,C), Lamp1 및 LC3는 다른 세포내 소포에서 가장 높은 수준으로 발현되었습니다(그림 2A,D,E). 이전의 여러 연구에서 EEA1이 주로 초기 엔도좀에 위치한다는 것이 확인되었습니다...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 연구에서 우리는 세포 내 분획과 초고속 분리 플랫폼14를 결합하여 마우스 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 분리하는 빠르고 재현 가능한 방법을 제시합니다. 밀도 구배 원심분리12 또는 면역 분리와 같은 엔도좀 분리를 위한 전통적인 접근법은 종종 시간과 노동 집약적이며 많은 양의 조직 또는 특수 항체가 필요합니다. 기계적 균질화 프로토콜을 나노여과 기술과 통합함으로써 엔도솜 소포의 물리화학적 및 분자적 무결성을 보존하면서 분리 공정을 크게 간소화했습니다.
이 절차의 성공에는 몇 가지 단계가 중요합니다. 초기 조직 균질화 및 온도 제어 원심분리는 소기관 무결성을 보존하고 소포 분획을 농축하는 데 필수적입니다. EXODUS 기반 분리 단계14, 특히 멤브레인 헹굼 및 소포 용출 중에 주의 깊게 취급...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
저자는 공개할 것이 없습니다.
이 작업은 다음 보조금의 지원을 받았습니다: 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 보조금 2R01HL121700-06A1 및 R01HL172834-01 MW, 미국 심장 협회 24TPA1303770 및 25EIA1422015 보조금(MW US EPA84045701 XL).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| µ-슬라이드 8 웰 하이 | 이비디 | 80806-90 | |
| 1.5 mL 눈금이 매겨진 미세 원심분리기 튜브 | 미국 사이언티픽 | 1615-5500 | |
| 10x 트리스/글리신 완충액 | 바이오 래드 | 1610734 | |
| 4x Laemmli 샘플 버퍼 | 바이오 래드 | 1610747 | |
| 벤치탑 원심분리기 | 에펜도르프 | Eppendorf 원심분리기 5810R | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A9418 | |
| 셀 스트레이너 | 코 닝 | CLS431750 | 기공 크기 40 &무; m, 멸균 |
| CELLSTAR 조직 배양 접시 | VWR | 82050-546 | 폴리스티렌, 멸균, 60mm 및 급성; 15 밀리미터 |
| ChemiDoc 이미징 시스템 | 바이오 래드 | 케미독 XRS+ | |
| 세척액 | 나노FCM | 17159 | |
| Pierce용 DMEM 1차 세포 분리 키트 | 피셔 사이언티픽 | PI88287 | |
| DTT | 피셔 사이언티픽 | BP172 | |
| 덜베코' 인산염 완충 식염수(PBS) | 써모 사이언티픽 | 10010023 | |
| ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약 | 바이오 래드 | 1705061 | |
| EDTA | 시그마 | E4884 | |
| 유럽 지역1 | 세포 신호 전달 | 3288 년대 | WB(1:1000) |
| 에그타 | 시그마 | E-4378-25 | |
| EID | 출애굽기 | MA03 EID | |
| ERp72 | 세포 신호 전달 | 5033S | WB(1:1000) |
| 에탄올 | UH 리서치 스토어 | 200 프루프, 5 갤런 | |
| 엑소더스 H-600 | 출애굽기 | H-600 | |
| GAPDH | 프로틴테크 | 10494-1-AP | 백화당 (1:5000) |
| 행크' 균형 염 용액(HBSS) | 써모 사이언티픽 | 14175095 | |
| 헴스 | 시그마 | H3375 | |
| 균질 화기 | 피셔 사이언티픽 | 15340167 | |
| 케이클 | 시그마 | P3911 | |
| 램프1 | 아브캠 | AB320851 | WB (1:2000) |
| LC3 | 세포 신호 전달 | 2775년대 | WB(1:1000) |
| Litesizer 500 | 안톤 파르 | 라이트사이저 500 | Zetasizer(Malvern) 또는 DLS 와 같은 기타 장비; (와이어트) 사용 가능 |
| 엠체리 | 비오르비트(Biorbyt) | 오브66657 | WB (1:500) |
| MgCl2 | 피셔 사이언티픽 | BP214-500 시리즈 | |
| 나크롬 | 시그마 | S7653 | |
| 나노FCM | 나노FCM | 유량 나노분석기 | |
| 나노스피어 크기 표준 | 써모 사이언티픽 | 3020ᅡ | |
| Nikon AXR 컨포칼 현미경 | 니콘 | AXR | |
| PBS의 파라포름알데히드 용액 4% | 산타크루즈 생명공학 | SC-281692 | |
| 팔로이딘 라벨링 프로브 | 인비트로젠 | A22284 | IF (1:500) |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | 써모 사이언티픽 | 23227 | |
| Pierce 일차 심근 세포 분리 키트 | 써모 사이언티픽 | 88028 | |
| 폴리에테르설폰 주사기 필터 | 밀리포어 | SLHPR33RS | 기공 크기 0.45 &무; m, 멸균 |
| 프리캐스트 단백질 젤 | 바이오 래드 | 4561093 | |
| QC 비즈 | 나노FCM | QS2503 시리즈 | |
| 랍7 | 세포 신호 전달 | 9367초 | WB(1:1000) |
| RIPA 용해 및 추출 완충액 | 써모 사이언티픽 | 89900 | |
| Roche PhosSTOP (PI 칵테일) | 로슈 | 4906837001 | |
| 실리카 나노스피어 | 나노FCM | S16M-엑소 | |
| 자당 | 시그마 | 84097 | |
| 스윙 버킷 로터 | 베크만 쿨터 | SW55Ti | |
| 트랜스 블롯 터보 전사 시스템 RTA 전사 키트 | 바이오 래드 | 1704270 | |
| 트윈 20 | 바이오 래드 | 1662404 | |
| 초원심분리기 | 베크만 쿨터 | 옵티마 XE-90 | |
| 초원심분리기 튜브 | 베크만 쿨터 | 326819 | |
| 초음파 세척 욕조 | 브랜슨 초음파 | CPX952238R | |
| VWR 튜브 센트 50mL | VWR | 89039-656 | |
| VWR 튜브 원심분리기 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| 제타 전위 참조 자료 | 안톤 파르 | 175108 |
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청
허가 요청