마우스 심장 조직에서 엔도좀 분리 및 심근 세포와의 공동 배양의 혁신적인 방법

요약

엔도좀은 세포내 분류 소기관의 집합체로, 세포 내세포막 수송 경로의 일부입니다. 자동 나노여과 장치를 사용하여 심장 조직에서 엔도좀을 분리하는 새로운 방법을 확립하고 엔도좀을 일차 심근 세포와 공동 배양하여 엔도좀의 세포 흡수를 조사했습니다.

초록

엔도좀은 세포 내 트래피킹, 신호 전달 및 막 재활용에 필수적인 역할을 하는 막 결합 소기관입니다. 심혈관 생물학에서 엔도좀의 기능이 인정받고 있지만 심장 조직에서 엔도좀을 효율적으로 분리하는 것은 여전히 중요한 기술적 과제로 남아 있습니다. 우리는 세포내 분획과 초고속 나노여과 분리 플랫폼을 결합하여 마우스 심장 조직에서 엔도좀을 분리하기 위한 신속하고 고수율 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법에는 소포의 순차적 원심분리, 나노여과 및 나노다공성 막 기반 회수가 포함됩니다. 분리된 엔도좀은 웨스턴 블로팅, 동적 광산란(DLS) 및 나노 유세포 분석(NanoFCM) 분석으로 특성화되었습니다. 생체 활성을 평가하기 위해 정제된 엔도좀을 일차 신생아 심근 세포와 공동 배양했습니다. 엔도좀 마커 EEA1 및 Rab7은 분리된 소포에서 매우 풍부했습니다. DLS 분석은 평균 소포 직경이 187.30 ± 23.42 nm이고 제타 전위가 -26.60 ± 5.79 mV(n = 12)인 것으로 나타났습니다. NanoFCM 정량화는 100mg의 심장 조직에서 약 1.07 ± 0.31 × 10¹² 입자/mL(n = 12)를 산출했습니다. 시험 관 내 공동 배양 후 심근 세포에 의한 엔도좀의 기능적 흡수가 관찰되었으며, 이는 소포 무결성 및 활성의 보존을 나타냅니다. 이 통합 분리 플랫폼은 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 추출하기 위한 재현 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 생화학적 및 기능 연구를 촉진하여 심혈관 생리학 및 질병에서 엔도좀의 역할을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

엔도좀은 엔도사이토시스, 화물 분류 및 신호 전달 경로를 조절하는 필수 세포내 소기관입니다 ^1,2. 활성화된 신호 전달 수용체 및 기타 하향 조절된 단백질은 처음에 초기 엔도좀(EE) 내의 내강내 소포(ILV)로 분류된 다음 다소포체(MVB) 또는 엔도좀 운반체 소포(ECV)로 성숙합니다. 이 소포는 이후 화물을 리소좀 분해 또는 대체 경로로 유도하기 위한 2차 분류 허브 역할을 하는 후기 엔도좀(LE)과 융합됩니다. ILV는 또한 원형질막과의 엔도좀 융합 후 엑소좀으로 분비될 수 있습니다 ^3,4 . 동시에, 자가포식 경로는 자가포식체를 통해 세포질 물질을 LE에 전달하며, 자가포식체는 후기 엔도사이틱 구획과 융합될 때 분해 능력을 획득합니다⁵. 엔도좀은 이제 뉴런 및 심근 세포와 같은 특수 세포와 특히 관련된 수용체 재활용⁶, 이온 채널 국소화⁷, 엑소좀 생합⁸ 및 세포간 통신⁹ 과정의 중요한 조절자로 인식되고 있습니다.

새로운 증거는 심혈관 기능에서 엔도좀 경로의 중추적인 역할을 강조했습니다. Eps15 상동성 도메인 단백질 3(EHD3)은 Na⁺/Ca²⁺ 교환체 및 L형 Ca²⁺ 채널을 포함한 주요 심장 이온 수송체의 엔도좀 재활용을 조절합니다. 마우스의 EHD3 결핍은 서맥, 전도 이상 및 Ca²⁺ 처리 변경으로 이어집니다¹⁰. 혈관 평활근 세포의 기능적 엔도좀-리소좀 트래피킹은 만성 신장 질환 및 죽상동맥경화증과 관련된 인산염 유발 내측 석회화를 예방합니다¹¹. 그럼에도 불구하고 심혈관 질환에서 엔도좀의 기능적 역할과 치료 표적으로서의 잠재력은 아직 불완전하게 이해되어 추가 조사가 필요합니다.

여러 가지 방법을 통해 기능적으로 온전한 엔도좀의 생화학적 분리가 가능해졌습니다. Marsh와 동료들은 먼저 밀도-구배 원심분리와 자유 흐름 전기영동을 결합하여 초기 및 후기 엔도좀을 회수하여 산성화 및 구조적 무결성을 보존했습니다¹². 자당 구배 접근법과 같은 최근 방법론은 다운스트림 단백질체 및 지질체 연구에 필수적인 초기 및 후기 엔도좀 집단을 분리하기 위한 표준화된 경로를 제공합니다¹³. 스핀 컬럼 기반 상용 키트는 처리량이 많은 응용 분야를 위해 개발되었습니다.

자동 초고속 분리 시스템을 통한 엑소좀 분리는 혁신적인 초음파 나노여과 기술을 활용하며, 이는 주기적인 음압 진동 및 이중 결합 고조파 진동과 통합된 이중 멤브레인 나노여과 시스템을 사용하여 생체액에서 고순도 엑소좀을 분리할 수 있습니다¹⁴. 여기에서는 자동 초고속 분리 시스템을 사용하여 세포 내 분획과 엔도좀 분리를 결합하여 마우스 심장 조직에서 높은 수율 및 고순도로 신속한 엔도좀 분리를 위한 새로운 방법을 달성했습니다.

또한, 추출된 엔도좀을 시험관 내에서 일차 심근세포(CM)와 공동 배양한 결과, 외인성 엔도좀이 CM에 성공적으로 진입하는 것을 발견하였다. 엔도좀 국소 단백질 Numb가 mCherry 적색 형광 단백질^15,16과 융합된 엔도좀 리포터를 사용하여 점점 패턴으로 CM 내부에 국한된 mCherry 형광을 관찰했습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험 동물 사용에 관한 국립 보건원의 지침에 따라 휴스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

참고: 분리 절차를 시작하기 전에 필요한 모든 완충액이 새로 준비되고 4°C로 냉각되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 멸균된 기구, 조직 배양 플레이트 및 적절한 튜브는 지정된 워크스테이션에 배치해야 하며, 달리 명시되지 않는 한 모든 재료는 얼음 위 또는 4°C에서 유지되어야 합니다. 원심분리기와 로터는 사용하기 전에 최소 2-3시간 동안 4°C로 사전 평형을 유지해야 합니다. 분획 완충액은 실험일 전에 준비하여 4°C에서 보관해야 하며, 실험 중에는 필요할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 및 원심분리 단계는 4°C에서 수행되어야 합니다.

1. 심장 용해물 준비

1. 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 소독한 다음 작업 표면에 멸균 흡수 패드를 놓고 그 위에 멸균된 수술 기구를 배치합니다.
2. CO₂ 흡입(3-5분 동안 10-30% CO₂ ) 또는 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 대체 방법에 의해.
   주의 : 열린 공간에서 작동하고 누출을 방지하기 위해 CO₂ 실린더가 제 시간에 닫히는지 확인하십시오. 안락사 중에 쥐를 모니터링하여 의식 상실과 적절한 절차를 확인해야 합니다. 의식을 잃으면 자궁경부 탈구, 개흉술 또는 출혈과 같은 2차 방법을 사용하여 사망을 보장합니다.
3. 마우스를 바로 누운 자세로 놓고 70% 에탄올로 흉부 부위를 청소합니다.
   1. 가슴강을 빠르게 열어 심장을 채취하고 심장을 얼음 위에 놓인 60mm 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 행크 균형 소금 용액(HBSS)에 옮깁니다.
   2. 핀셋을 사용하여 심실에서 잔여 혈액을 부드럽게 제거하고 심실에 더 이상 혈액이 남지 않을 때까지 심장을 잘 씻습니다. 처리 내내 심장을 얼음 위에 두십시오.
      참고: 웨스턴 블롯(WB) 분석을 위해 50-100mg의 심장 조직을 양성 대조군으로 저장하십시오. 심장은 액체 질소에서 급속 냉동되어 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
4. 얼음 위의 50mL 튜브에 8mL의 분획 완충액(표 1)을 첨가합니다. 100-120mg의 신선 또는 냉동 마우스 심장 조직을 분획 완충액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.
   참고: 마우스 심장 조직의 모든 부분을 사용하여 엔도좀을 추출할 수 있습니다. 후속 분석을 위한 충분한 엔도좀을 생성하려면 최소 100mg의 심장 조직이 필요합니다. 실험 그룹 전반에 걸쳐 일관성을 보장하려면 분획 완충액에 추가하기 전에 조직의 무게를 정확하게 측정해야 합니다.
   주의 : 분획 완충액을 작동할 때 신체에 직접 닿지 않도록 적절한 PPE를 착용하십시오.
5. 항상 얼음 위의 분할 완충액에 미세 수술 가위를 사용하여 조직을 약 1mm³ 조각으로 다집니다.
6. 전기 균질화기로 중간 속도로 균질화, 40초 작업 30초 정지 주기. 5-7주기 동안 균질화합니다(그림 1A).
   참고: 철저한 균질화 과정이 필수적이며 엔도좀의 최종 농도를 높이는 데 도움이 됩니다.
7. 균질화된 심장 용해물을 초음파 수조로 얼음 물 수조에서 10분 동안 초음파 처리합니다(그림 1A).

2. 세포하 분획

1. 50mL 원심분리 튜브 위에 40μm 세포 스트레이너를 놓고 스트레이너를 통해 균질화된 심장 용해물을 여과합니다(그림 1A).
2. 핵 펠릿의 경우: 심장 용해물을 1,000 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 옮기고 라벨이 붙은 새 튜브에 넣습니다.
   참고: 핵 분획인 펠릿을 수집하고 WB에 핵 분획이 필요한 경우 핵 펠릿을 200μL WB 용해 완충액에 재현탁합니다. RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay) 완충액으로 핵 펠릿을 위아래로 20회 부드럽게 피펫팅하고 10분 동안 초음파 처리합니다. 핵 용해물을 14,000 × g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 수집하여 추가 사용을 위해 -80°C에서 보관합니다. 2.2단계는 선택 사항입니다. 소포만 필요한 경우 건너뛸 수 있습니다.
3. 미토콘드리아 분획의 경우: 상청액을 10,000 × g에서 4°C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 펠릿에는 미토콘드리아 분획이 포함되어 있습니다. 상청액을 옮기고 신선한 초원심분리 튜브에 넣습니다.
   참고: WB에 대해 미토콘드리아 분획이 필요한 경우 이전 참고에 설명된 대로 펠릿을 2.2단계로 저장합니다.
4. 튜브의 균형을 조심스럽게 조정하십시오. 각 튜브의 무게를 측정하고 동일한 무게를 보장하기 위해 더 가벼운 튜브에 추가 냉간 분획 완충액을 추가합니다. 초원심분리기 로터와 어댑터를 4°C에서 2-3시간 동안 예식시킵니다. 상청액을 160,000 × g에서 4°C에서 30분 동안 초원심분리합니다.
   알림: 초원심분리 단계 동안 모든 초원심분리기 튜브가 적절하게 균형을 이루고 림 아래 약 0.5-1cm까지 완충액으로 채워져 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 부적절한 충전은 높은 원심력이 가해져 튜브가 변형되거나 붕괴될 수 있습니다.
5. 상청액을 새 튜브로 제거합니다. 상청액에는 엔도좀이 포함되어 있습니다. 50mL 원심분리 튜브 위에 0.45μm 주사기 필터에 부착된 10mL 주사기를 설치하고 상청액을 튜브에 걸러냅니다. 멸균된 PBS 완충액 5mL를 첨가하여 용액을 희석하고 필터가 막히지 않도록 합니다.
   참고: 필터링 단계는 분리 단계를 시작할 때 상청액의 모든 엔도좀이 <450nm가 되도록 합니다.
6. 2.4단계의 멸균된 PBS 완충액 5mL로 펠릿을 재현탁하고 펠릿을 잘 혼합하기 위해 위아래로 최소 20회 피펫팅합니다. 펠릿에는 다른 세포내 소포가 포함되어 있습니다. 50mL 원심분리 튜브 위에 0.45μm 주사기 필터에 부착된 10mL 주사기를 설치하고 펠릿 용액을 튜브에 걸러냅니다. 멸균된 PBS 완충액 5mL를 추가하여 용액을 희석하고 필터가 막히지 않도록 합니다.
   참고: 필터링 단계는 분리 단계를 시작할 때 펠릿의 모든 소포가 <450nm인지 확인합니다.

3. 엔도좀 및 기타 세포내 소포의 분리 과정

1. 2.5단계에서 여과된 상청액과 2.6단계에서 여과된 펠릿 용액을 멸균된 PBS 완충액으로 각각 50mL 튜브에 30mL의 최종 부피로 희석합니다. 샘플을 4°C에 보관합니다(그림 1A).
   참고: 샘플은 4°C에서 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 당일 다음 단계를 수행할 시간이 충분하지 않은 경우 4°C의 냉장고에 보관한 다음 다음날 기다렸다가 실험을 계속할 수 있습니다.
2. 기기를 켜고 일반적으로 20분이 소요되는 일일 청소 프로그램을 시작합니다.
3. 분리를 위해 Medium EXODUS 절연 장치(M EID)를 선택합니다. 50mL 튜브 어댑터를 설치하고 샘플이 담긴 50mL 튜브를 샘플 위치에 놓습니다. 화면에서 EID out을 누르고 M EID를 로드합니다.
   참고: Medium EID는 20-50mL 샘플용이며 30mL를 권장합니다.
4. 프로그램 설정:
   1. 샘플 이름과 샘플 볼륨을 입력합니다.
   2. 샘플 유형 선택: 플라즈마.
   3. 프로그램 선택: 플라즈마. 스트롱-매사추세츠. 답03.
   4. 원심분리기 튜브를 선택합니다: 50mL.
   5. 고순도 모드를 켭니다.
   6. 프로그램 옵션 3000을 선택합니다.
   7. 확인을 눌러 시작합니다.
      참고: 전체 격리 프로세스를 완료하는 데 1-2시간이 걸립니다. 샘플의 농도가 높을수록 시간이 더 오래 걸립니다.
5. 엔도좀 및 기타 세포내 소포 회복:
   1. EID를 검색하여 다음 단계를 위해 후드로 가져옵니다.
   2. 200μL 피펫을 사용하여 멸균된 PBS 완충액 200μL를 EID로 옮깁니다. 나노다공성 멤브레인의 양면을 각각 20회 헹굽니다.
   3. 엔도좀 또는 기타 세포내 소포를 수집하고 1.5mL 튜브에 200μL에 재현탁합니다. 24-48시간 동안 사용하는 경우 4°C에서 보관하고, 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 용출액은 엔도좀 또는 기타 세포내 소포를 포함하며 추가 분석 및 심근 세포와의 공동 배양에 사용됩니다. 엔도좀 샘플은 얻은 데이터를 기반으로 -80°C에서 5개월 동안 보관하면 안정적입니다.
6. WB에 대한 엔도좀 및 기타 세포내 소포를 용리합니다.
   1. EID를 검색합니다. 80μL의 WB 용해 완충액을 EID로 옮깁니다. 나노다공성 멤브레인의 양면을 각각 20회 헹굽니다.
   2. 완전한 가용화를 보장하기 위해 EID를 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 EID 내부에 피펫 완충액을 넣습니다. 엔도좀 또는 기타 세포내 소포 용해물을 1.5mL 튜브에 수집합니다. 4°C에서 14,000 × g에서 10분 동안 원심분리합니다. 장기 보관을 위해 상청액을 수집하여 -80°C에서 보관합니다. 튜브에 펠릿이 남아 있으면 펠릿을 버리십시오.

4. 엔도좀 단백질 정량 및 소포 특성화

1. 웨스턴 블롯 분석
   1. 각 샘플에서 5μL를 절약하여 비신코닌산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다.
   2. 4× Laemmli 샘플 완충액에 샘플을 희석하고 와류하여 완전히 혼합합니다. 샘플을 95°C에서 10분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.
   3. 변성 샘플을 4°C에서 10분 동안 14,000 × g에서 원심분리하고 분석을 위해 생성된 상청액을 수집합니다.
   4. 전기영동 장치에 폴리아크릴아미드 겔을 조립하고 챔버를 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 실행 완충액으로 채웁니다.
   5. 분자량 마커와 준비된 단백질 샘플을 겔에 로드하고 표적 단백질의 분자량에 따라 적절한 아크릴아미드 비율을 선택합니다.
      참고: 일반적으로 심장 조직 용해물과 엔도좀 용해물 모두에 대해 웰당 20μg의 단백질이 로드됩니다.
   6. 약 120분 동안 또는 염료 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 겔을 6V에서 실행합니다.
   7. 웨스턴 블로팅 전사 시스템을 사용하여 겔에서 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전사합니다.
      알림: 습식 전사 방법도 잘 작동합니다.
   8. 0.05% Tween-20(TBST)을 함유한 Tris 완충 식염수로 PVDF 멤브레인을 잠시 헹굽니다.
   9. 실온에서 1시간 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 TBST로 멤브레인을 차단합니다.
   10. 부드러운 흔들림을 사용하여 선택된 엔도좀 마커에 특이적인 1차 항체(재료 표)와 함께 멤브레인을 4°C에서 밤새 배양합니다.
   11. 다음날 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하고, 각 세척은 로커에서 실온에서 10분 동안 지속됩니다.
       알림: 비특이적 배경을 줄이려면 적절한 세척이 필수적입니다. 멤브레인이 공정 전반에 걸쳐 완전히 수분을 공급받는지 확인하십시오.
   12. 멤브레인을 적절한 2차 항체(재료 표)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   13. 멤브레인을 TBST로 세 번 세척하고, 각 세척은 실온의 로커에서 10분 동안 지속됩니다.
   14. 항체 결합 단백질을 검출하기 위해 멤브레인에 화학발광 기질을 도포합니다.
   15. 겔 이미징 시스템을 사용하여 멤브레인을 노출시키고 단백질의 이미지를 촬영합니다.
2. 동적 광산란(DLS) 분석
   1. 엔도좀의 입자 크기와 제타 전위는 동적 광산란(DLS) 기술(DLS) 기술을 사용하여 측정됩니다¹⁷. Kalliope 소프트웨어 버전 2.10.4가 장착된 Litesizer 500(Anton Paar)을 사용합니다. DLS 측정은 25°C에서 90° 감지 각도를 갖는 658nm 레이저를 사용하여 3중으로 수행됩니다.
   2. 초순수에 "크기 표준 나노스피어"를 희석하고 일회용 큐벳에 1mL 부피를 첨가한 후 챔버에 넣습니다.
      참고: 알 수 없는 샘플의 예상 크기에 따라 표준 나노스피어(작거나 크다)를 사용하십시오.
   3. DLS 소프트웨어를 열고 새 측정 탭을 클릭합니다. 측정 모드에서 입자 크기를 선택합니다. 제목 없음 필드에 파일 이름을 지정하고 입력 매개변수(용매, 온도 등)를 입력한 다음 시작을 클릭합니다. 표준 입자의 크기를 결정한 후 챔버에서 큐벳을 꺼냅니다.
   4. 초순수에 "제타 전위 기준 물질"을 희석하여 제타 전위 오메가 큐벳에 넣고 큐벳 챔버에 넣습니다. 소프트웨어에서 새 측정 탭을 클릭합니다. 측정 모드에서 제타 전위를 선택합니다. Untitled 필드에 파일 이름을 지정하고 입력 매개변수(용매, 온도 등)를 입력한 다음 시작을 클릭합니다.
   5. 엔도좀의 입자 크기와 제타 전위를 측정하려면 엔도좀 샘플을 초순수로 희석하여 해당 큐벳에 넣고 큐벳 챔버에 넣습니다. 표준에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 측정하십시오.
      알림: 미지의 샘플을 희석하십시오.amp초순수에 대한 샘플의 농도에 따라.
3. NanoFCM 분석
   참고: 엔도좀 입자 농도는 Professional Suite V2.3 소프트웨어와 함께 NanoFCM Flow NanoAnalyzer를 사용하여 결정됩니다.¹⁸. 입자 신호 수집은 0.2% SS 감쇠로 20mW로 설정된 488nm 청색 레이저 및/또는 10% SS 감쇠로 8mW로 설정된 638nm 적색 레이저를 사용하여 공기 기반 압력 모듈에 의해 변조 및 유지되는 1.0kPa의 샘플링 압력에서 2분 동안 수행됩니다. 샘플은 중력 공급을 통해 초순수 물을 시스 유체로 사용하여 1.4μm에 초점을 맞춥니다. 최적의 레이저 정렬은 실리카 나노스피어 칵테일 QC 비드(S16M-Exo)를 사용하여 테스트 및 보정됩니다. 크기 보정 측정은 S16M-Exo 크기 표준 비드(알려진 농도가 2.17 × 10인 직경 68, 91, 113 및 155nm의 입자를 포함하는 실리카 나노입자 칵테일)을 사용하여 분석 전에 수행됩니다.¹⁰/mL)를 사용합니다.
   1. 농도 표준 획득:
      1. nanoFCM의 유체학을 시작하고 초기화합니다. QC 비드(1:100)를 0.22μm의 멤브레인 여과된 초순수에 희석하고 0.5mL 튜브에 첨가한 다음 로딩 베이에 넣습니다. Sample Inf 드롭다운 메뉴에서 QC FL SiNP를 선택하고 QC 비드 샘플의 희석 계수를 입력합니다.
      2. Sample Flow 드롭다운 메뉴에서 부스팅을 선택하여 QC 샘플을 고속으로 도입하고 45초 동안 시스템에서 세척 용액을 제거합니다. 부스팅 중에 레이저 출력을 488nm 청색 레이저의 경우 20/50mV, 638nm 적색 레이저의 경우 20/100mW로 설정하고 SS 감쇠는 0.2%입니다.
      3. 샘플 흐름 드롭다운 메뉴에서 샘플링을 선택하고 큰 신호에 대한 임계값을 조정합니다. 샘플링 중에 신호 응축 렌즈 정렬을 수동으로 조정하고 필요한 경우 소프트웨어에서 레이저 포커싱 렌즈 정렬을 조정합니다. 큰 신호에 대한 자동 임계값 조정은 측면 산란 채널의 경우 50-120 사이, 두 형광 채널의 경우 75 미만으로 유지되어야 합니다.
      4. 기록 시간을 클릭하여 120초 동안 데이터를 수집합니다. 데이터를 수집할 때 관심 영역(ROI)이 1500-15000 사이인지 확인합니다. 결과 파일을 "nfa" 확장자로 팝업 폴더에 저장하고 샘플 튜브를 언로드합니다.
         알림: 각 샘플 실행 후 세척액(1x)을 사용하여 처리된 샘플을 제거amp45초 동안 부스트하여 튜브에서 샘플. 그런 다음 모세관 팁을 초순수에 담그고 다음 샘플을 로드하기 전에 모세관 외부에서 잔류 세척액을 제거합니다.
   2. 크기 표준 획득:
      1. "크기 표준 비드"(1:100)를 0.22μm의 멤브레인 여과된 유수에 희석하고 로딩 베이에 놓습니다. Sample Inf 드롭다운 메뉴에서 68-155 S16M-Exo를 선택하고 크기 표준 비드 샘플의 희석 계수를 입력합니다.
      2. Sample Flow 드롭다운 메뉴에서 boosting을 선택하여 표준 비드 크기를 도입하고 45초 동안 시스템에서 세척액을 제거합니다. 부스팅하는 동안 레이저 출력을 488nm 청색 레이저의 경우 8/50mV, 638nm 적색 레이저의 경우 20/100mW로 설정하고 SS 감쇠는 10%입니다.
      3. 샘플 흐름 드롭다운 메뉴에서 샘플링을 선택하고 작은 신호에 대한 임계값을 조정합니다. 4개의 뚜렷한 피크(68nm, 91nm, 113nm, 155nm)가 창에 표시되어야 합니다. 기록 시간을 클릭하여 120초 동안 데이터를 수집합니다. 결과 파일을 "nfa" 확장자로 팝업 폴더에 저장하고 샘플 튜브를 언로드합니다.
   3. 빈 표준 획득:
      1. 초순수 또는 (샘플의 완충액/희석제)를 사용하여 위에서 설명한 것과 동일한 프로세스로 측정을 수행하고, "nfa" 확장자가 있는 폴더에 "blank"라는 이름의 파일을 저장하고 샘플 튜브를 언로드합니다.
   4. 엔도좀의 입자 농도 측정
      1. 엔도좀 샘플을 초순수로 희석하고 로딩 베이에 넣습니다.
      2. 샘플을 부스팅하고 샘플링한 후 기록 시간을 클릭하여 측정을 시작합니다. 임계값이 측면 산란 채널의 50-120 범위 내에 있지 않거나 ROI가 15,000을 초과하는 경우 샘플을 희석하는 것이 좋습니다.
   5. 데이터 분석:
      1. 소프트웨어의 Acquisition 탭에서 Analysis 탭으로 전환하고 저장된 "nfa" 파일을 엽니다. FL SnNPs.nfa date__QC 저장된 QC 결과 파일을 열어 농도 표준을 설정하고, 임계값 설정 도구를 클릭하여 큰 신호에 대한 임계값을 설정합니다.
      2. 원형 게이팅 도구를 사용하여 입자 농도를 선택합니다. 창을 닫기 전에 Count STD(성병 계수)를 클릭하고 QC 비드의 농도(2.17 ×^{10 10}/mL)를 확인합니다.
      3. 크기 표준을 설정하려면 date_68-155 S16M-Exo.nfa 파일을 엽니다. 크기 도구를 클릭하여 표준 곡선 생성 창을 열고 임계값 설정 도구를 클릭하여 작은 신호에 대한 임계값을 설정합니다.
      4. 사용자 정의 드롭다운 메뉴에서 S16 exo 68-155 nm를 선택합니다. 피크 찾기를 클릭하여 4개 크기의 모집단의 피크 SS 강도를 식별합니다.
      5. 빈 파일을 선택하고 공백 설정을 클릭하여 샘플 제거에 대한 거짓 긍정의 수를 식별합니다. 엔도좀 농도를 분석하려면 먼저 샘플을 선택하고 임계값 설정 도구를 클릭하여 작은 신호에 대한 임계값을 설정합니다. 정량화된 데이터를 크기(nm) 및 농도(입자/mL) 보고서로 제시합니다.

5. 일차 심근 세포 배양

참고: 최대 50개의 신생아 마우스 또는 쥐 심장에서 심근세포를 분리하기 위한 충분한 시약을 제공하는 1차 심근세포 분리 키트를 사용하여 심근 세포를 분리합니다. 이 키트에는 일차 심근 세포 배양을 지원하는 데 적합한 구성 요소도 포함되어 있습니다. 모든 배지와 완충액은 세포를 방해하지 않도록 주의해서 제거해야 합니다. 1000μL 피펫 팁을 사용한 수동 피펫팅이 권장되며 진공 흡인은 피해야 합니다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)은 절차를 시작하기 전에 4°C로 미리 냉각해야 합니다.

1. 키트에서 사용할 수 있는 심근세포 분리 효소 1(파파인 함유)을 2를 추가하여 재구성합니다. 냉각된 HBSS mL를 1개의 바이알에 담습니다. 약 5분 동안 또는 효소가 완전히 용해될 때까지 부드럽게 섞습니다. 시술 내내 효소 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
   참고: 재구성된 효소 1의 단일 바이알은 10개의 신생아 심장에서 심근 세포를 분리하는 데 충분합니다. -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있으며 두 번의 동결-해동 주기 동안 안정적입니다. 4°C에서 보관하는 경우 효소 활성을 보장하기 위해 용액을 1주일 이내에 사용해야 합니다.
2. 갓 해부된 신생아 심장을 개별 멸균 1에 넣습니다. mL 미세 원심분리기 튜브를 넣고 즉시 각 튜브에 얼음처럼 차가운 HBSS 500 μL를 추가합니다.
   참고: 수율과 재현성을 극대화하기 위해 튜브당 하나의 심장을 처리하는 것이 좋습니다.
3. 멸균 해부 가위를 사용하여 심장 조직을 1mm³ 조각으로 다집니다. 잔여 혈액을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 HBSS 500μL로 각 샘플을 두 번 세척합니다.
4. 각 튜브에 재구성된 심근세포 분리 효소 1(파파인) 200μL와 키트에서 사용할 수 있는 심근세포 분리 효소 2(열분해 포함) 10μL를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 37°C에서 30-35분 동안 배양합니다.
   참고: 심근세포 분리 효소 2는 HBSS에 현탁액으로 제공되며 사용하기 전에 얼음 위에서 해동해야 합니다. 샘플에 첨가하기 전에 균일한 현탁액을 보장하기 위해 위아래로 피펫팅하여 효소를 균질화합니다.
5. 효소 분해 후, 효소 용액을 조심스럽게 흡인하고 각 샘플을 얼음처럼 차가운 HBSS 500μL로 두 번 세척합니다.
6. 1차 세포 분리를 위해 mL의 완전 DMEM을 각 튜브에 추가합니다. 멸균 1.0mL 피펫 팁을 사용하여 위아래로 25-30회 피펫팅하여 조직을 부드럽게 분쇄합니다. 이 단계에서 기포 형성을 최소화하십시오.
   참고: 피펫팅으로 조직을 파괴하면 세포 수율이 향상됩니다. 그러나 과도한 피펫팅은 세포 손상을 초래할 수 있습니다.
7. 상청액을 300× g에서 5분 동안 원심분리합니다.
8. 피펫으로 Complete DMEM을 조심스럽게 제거합니다. 1mL의 신선한 Complete DMEM을 튜브에 넣고 멸균 1.0mL 피펫 팁을 사용하여 위아래로 25-30회 피펫팅합니다. 피펫팅할 때 기포를 피하십시오.
9. 조직이 주로 단일 세포 현탁액인 후, 1차 세포 분리를 위해 0.5mL의 완전 DMEM을 각 튜브에 추가하여 총 부피를 1.5mL로 만듭니다. 세포 농도 및 세포 생존율을 측정하기 위해 개별 세포 현탁액을 결합합니다.

6. 심근세포와 동계배양 엔도좀

1. 60mm 접시에 심근 세포를 시드하고 전체 부피에 Complete DMEM을 추가합니다.
   참고: 각 신생아 마우스 심장은 하나의 접시에 파종될 것으로 예상되며 각 웰의 총 부피는 5mL가 될 것으로 예상됩니다(그림 1B).
2. 60mm 접시를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 배지를 1000배 희석된 심근세포 성장 보충제를 함유한 1차 세포 분리용 신선한 완전 DMEM으로 대체합니다.
3. 3단계에서 생성된 엔도좀 용출액을 -80°C에서 -20°C로 1시간 동안 옮깁니다. 그런 다음 엔도좀을 얼음 위에 놓고 점차적으로 해동합니다.
   참고: 얼음 위에서 점진적으로 해동하면 엔도좀의 막을 더 온전하게 만들고 분해를 줄일 수 있습니다.
4. 48시간 후, 엔도좀 용출액 100μL마다 신선한 완전 DMEM 5mL와 혼합하고 각 접시에서 기존 배지를 교체합니다. 24시간 동안 심근 세포와 엔도좀을 공동 배양합니다.
5. 심근 세포를 2mL의 저온 멸균 PBS로 세척합니다. 80-100μL 용해 완충액으로 각 접시에 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 추가합니다. 차가운 플라스틱 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 세포를 1.5mL 튜브에 모으십시오.
6. 4.1단계에서 설명한 WB 프로토콜을 수행합니다.
7. 면역염색(IF)의 경우 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 8웰 챔버 슬라이드에서 심근세포를 시드합니다. 완성된 DMEM으로 단일 세포 현탁액을 1.5mL에서 3mL로 희석합니다.
   2. 각 챔버에 현탁액 300μL를 시드합니다. 6.2-6.4단계를 반복합니다.
   3. 심근세포를 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 20분 동안 고정하고 200μL의 멸균 PBS로 3회 세척합니다. 8웰 챔버 슬라이드는 IF에 사용할 준비가 되었습니다.
      주의: 4% PFA를 취급할 때는 적절한 PPE를 착용하십시오. 사용 후에는 4% PFA를 적절한 용기에 버리십시오.

결과

2.6단계와 3.6단계의 심장 조직 용해물, 핵 분획, 미토콘드리아 분획, 기타 세포내 소포, 2.5단계와 3.6단계의 엔도좀의 5개 그룹에서 초기 엔도좀, 후기 엔도좀, 리소좀 및 자가포식체에 대한 마커의 발현 수준을 조사했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 EEA1(초기 엔도좀 항원 1)이 엔도좀에서 가장 높은 발현 수준을 보였고 다른 그룹에서는 거의 발현되지 않았음을 보여주었습니다(그림 2A,B). Rab7은 또한 엔도좀에서 가장 높은 수준으로 발현되었으며(그림 2A,C), Lamp1 및 LC3는 다른 세포내 소포에서 가장 높은 수준으로 발현되었습니다(그림 2A,D,E). 이전의 여러 연구에서 EEA1이 주로 초기 엔도좀에 위치한다는 것이 확인되었습니다...

토론

이 연구에서 우리는 세포 내 분획과 초고속 분리 플랫폼¹⁴를 결합하여 마우스 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 분리하는 빠르고 재현 가능한 방법을 제시합니다. 밀도 구배 원심분리¹² 또는 면역 분리와 같은 엔도좀 분리를 위한 전통적인 접근법은 종종 시간과 노동 집약적이며 많은 양의 조직 또는 특수 항체가 필요합니다. 기계적 균질화 프로토콜을 나노여과 기술과 통합함으로써 엔도솜 소포의 물리화학적 및 분자적 무결성을 보존하면서 분리 공정을 크게 간소화했습니다.

이 절차의 성공에는 몇 가지 단계가 중요합니다. 초기 조직 균질화 및 온도 제어 원심분리는 소기관 무결성을 보존하고 소포 분획을 농축하는 데 필수적입니다. EXODUS 기반 분리 단계¹⁴, 특히 멤브레인 헹굼 및 소포 용출 중에 주의 깊게 취급...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
µ-슬라이드 8 웰 하이	이비디	80806-90
1.5 mL 눈금이 매겨진 미세 원심분리기 튜브	미국 사이언티픽	1615-5500
10x 트리스/글리신 완충액	바이오 래드	1610734
4x Laemmli 샘플 버퍼	바이오 래드	1610747
벤치탑 원심분리기	에펜도르프	Eppendorf 원심분리기 5810R
소 혈청 알부민	시그마	A9418
셀 스트레이너	코 닝	CLS431750	기공 크기 40  &무; m, 멸균
CELLSTAR 조직 배양 접시	VWR	82050-546	폴리스티렌, 멸균, 60mm 및 급성; 15 밀리미터
ChemiDoc 이미징 시스템	바이오 래드	케미독 XRS+
세척액	나노FCM	17159
Pierce용 DMEM 1차 세포 분리 키트	피셔 사이언티픽	PI88287
DTT	피셔 사이언티픽	BP172
덜베코' 인산염 완충 식염수(PBS)	써모 사이언티픽	10010023
ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약	바이오 래드	1705061
EDTA	시그마	E4884
유럽 지역1	세포 신호 전달	3288 년대	WB(1:1000)
에그타	시그마	E-4378-25
EID	출애굽기	MA03 EID
ERp72	세포 신호 전달	5033S	WB(1:1000)
에탄올	UH 리서치 스토어		200 프루프, 5 갤런
엑소더스 H-600	출애굽기	H-600
GAPDH	프로틴테크	10494-1-AP	백화당 (1:5000)
행크' 균형 염 용액(HBSS)	써모 사이언티픽	14175095
헴스	시그마	H3375
균질 화기	피셔 사이언티픽	15340167
케이클	시그마	P3911
램프1	아브캠	AB320851	WB (1:2000)
LC3	세포 신호 전달	2775년대	WB(1:1000)
Litesizer 500	안톤 파르	라이트사이저 500	Zetasizer(Malvern) 또는 DLS 와 같은 기타 장비; (와이어트) 사용 가능
엠체리	비오르비트(Biorbyt)	오브66657	WB (1:500)
MgCl2	피셔 사이언티픽	BP214-500 시리즈
나크롬	시그마	S7653
나노FCM	나노FCM	유량 나노분석기
나노스피어 크기 표준	써모 사이언티픽	3020ᅡ
Nikon AXR 컨포칼 현미경	니콘	AXR
PBS의 파라포름알데히드 용액 4%	산타크루즈 생명공학	SC-281692
팔로이딘 라벨링 프로브	인비트로젠	A22284	IF (1:500)
Pierce BCA 단백질 분석 키트	써모 사이언티픽	23227
Pierce 일차 심근 세포 분리 키트	써모 사이언티픽	88028
폴리에테르설폰 주사기 필터	밀리포어	SLHPR33RS	기공 크기 0.45  &무; m, 멸균
프리캐스트 단백질 젤	바이오 래드	4561093
QC 비즈	나노FCM	QS2503 시리즈
랍7	세포 신호 전달	9367초	WB(1:1000)
RIPA 용해 및 추출 완충액	써모 사이언티픽	89900
Roche PhosSTOP (PI 칵테일)	로슈	4906837001
실리카 나노스피어	나노FCM	S16M-엑소
자당	시그마	84097
스윙 버킷 로터	베크만 쿨터	SW55Ti
트랜스 블롯 터보 전사 시스템 RTA 전사 키트	바이오 래드	1704270
트윈 20	바이오 래드	1662404
초원심분리기	베크만 쿨터	옵티마 XE-90
초원심분리기 튜브	베크만 쿨터	326819
초음파 세척 욕조	브랜슨 초음파	CPX952238R
VWR 튜브 센트 50mL	VWR	89039-656
VWR 튜브 원심분리기 15 mL	VWR	89039-666
제타 전위 참조 자료	안톤 파르	175108