방법 논문

마우스 심장 조직에서 엔도좀 분리 및 심근 세포와의 공동 배양의 혁신적인 방법

DOI:

10.3791/69146

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2025년 10월 10일

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1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

이 논문에서

요약

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엔도좀은 세포내 분류 소기관의 집합체로, 세포 내세포막 수송 경로의 일부입니다. 자동 나노여과 장치를 사용하여 심장 조직에서 엔도좀을 분리하는 새로운 방법을 확립하고 엔도좀을 일차 심근 세포와 공동 배양하여 엔도좀의 세포 흡수를 조사했습니다.

초록

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엔도좀은 세포 내 트래피킹, 신호 전달 및 막 재활용에 필수적인 역할을 하는 막 결합 소기관입니다. 심혈관 생물학에서 엔도좀의 기능이 인정받고 있지만 심장 조직에서 엔도좀을 효율적으로 분리하는 것은 여전히 중요한 기술적 과제로 남아 있습니다. 우리는 세포내 분획과 초고속 나노여과 분리 플랫폼을 결합하여 마우스 심장 조직에서 엔도좀을 분리하기 위한 신속하고 고수율 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법에는 소포의 순차적 원심분리, 나노여과 및 나노다공성 막 기반 회수가 포함됩니다. 분리된 엔도좀은 웨스턴 블로팅, 동적 광산란(DLS) 및 나노 유세포 분석(NanoFCM) 분석으로 특성화되었습니다. 생체 활성을 평가하기 위해 정제된 엔도좀을 일차 신생아 심근 세포와 공동 배양했습니다. 엔도좀 마커 EEA1 및 Rab7은 분리된 소포에서 매우 풍부했습니다. DLS 분석은 평균 소포 직경이 187.30 ± 23.42 nm이고 제타 전위가 -26.60 ± 5.79 mV(n = 12)인 것으로 나타났습니다. NanoFCM 정량화는 100mg의 심장 조직에서 약 1.07 ± 0.31 × 1012 입자/mL(n = 12)를 산출했습니다. 시험 관 내 공동 배양 후 심근 세포에 의한 엔도좀의 기능적 흡수가 관찰되었으며, 이는 소포 무결성 및 활성의 보존을 나타냅니다. 이 통합 분리 플랫폼은 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 추출하기 위한 재현 가능하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 생화학적 및 기능 연구를 촉진하여 심혈관 생리학 및 질병에서 엔도좀의 역할을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

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엔도좀은 엔도사이토시스, 화물 분류 및 신호 전달 경로를 조절하는 필수 세포내 소기관입니다 1,2. 활성화된 신호 전달 수용체 및 기타 하향 조절된 단백질은 처음에 초기 엔도좀(EE) 내의 내강내 소포(ILV)로 분류된 다음 다소포체(MVB) 또는 엔도좀 운반체 소포(ECV)로 성숙합니다. 이 소포는 이후 화물을 리소좀 분해 또는 대체 경로로 유도하기 위한 2차 분류 허브 역할을 하는 후기 엔도좀(LE)과 융합됩니다. ILV는 또한 원형질막과의 엔도좀 융합 후 엑소좀으로 분비될 수 있습니다 3,4 . 동시에, 자가포식 경로는 자가포식체를 통해 세포질 물질을 LE에 전달하며, 자가포식체는 후기 엔도사이틱 구획과 융합될 때 분해 능력을 획득합니다5. 엔도좀은 이제 뉴런 및 심근 세포와 같은 특수 세포와 특히 관련된 수용체 재활용6, 이온 채널 국소화7, 엑소좀 생합8

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프로토콜

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모든 동물 실험은 실험 동물 사용에 관한 국립 보건원의 지침에 따라 휴스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

참고: 분리 절차를 시작하기 전에 필요한 모든 완충액이 새로 준비되고 4°C로 냉각되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 멸균된 기구, 조직 배양 플레이트 및 적절한 튜브는 지정된 워크스테이션에 배치해야 하며, 달리 명시되지 않는 한 모든 재료는 얼음 위 또는 4°C에서 유지되어야 합니다. 원심분리기와 로터는 사용하기 전에 최소 2-3시간 동안 4°C로 사전 평형을 유지해야 합니다. 분획 완충액은 실험일 전에 준비하여 4°C에서 보관해야 하며, 실험 중에는 필요할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 및 원심분리 단계는 4°C에서 수행되어야 합니다.

1. 심장 용해물 준비

  1. 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 소독한 다음 작업 표면에 멸균 흡수 패드를 놓고 그 위에 멸균된 수술 기구를 배치합니다.
  2. CO2 흡입(3-5분 동안 10-30% CO2 ) 또는 ....

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결과

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2.6단계와 3.6단계의 심장 조직 용해물, 핵 분획, 미토콘드리아 분획, 기타 세포내 소포, 2.5단계와 3.6단계의 엔도좀의 5개 그룹에서 초기 엔도좀, 후기 엔도좀, 리소좀 및 자가포식체에 대한 마커의 발현 수준을 조사했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 EEA1(초기 엔도좀 항원 1)이 엔도좀에서 가장 높은 발현 수준을 보였고 다른 그룹에서는 거의 발현되지 않았음을 보여주었습니다(그림 2A,B). Rab7은 또한 엔도좀에서 가장 높은 수준으로 발현되었으며(그림 2A,C), Lamp1 및 LC3는 다른 세포내 소포에서 가장 높은 수준으로 발현되었습니다(그림 2A,D,E). 이전의 여러 연구에서 EEA1이 주로 초기 엔도좀에 위치한다는 것이 확인되었습니다.......

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토론

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이 연구에서 우리는 세포 내 분획과 초고속 분리 플랫폼14를 결합하여 마우스 심장 조직에서 고순도 엔도좀을 분리하는 빠르고 재현 가능한 방법을 제시합니다. 밀도 구배 원심분리12 또는 면역 분리와 같은 엔도좀 분리를 위한 전통적인 접근법은 종종 시간과 노동 집약적이며 많은 양의 조직 또는 특수 항체가 필요합니다. 기계적 균질화 프로토콜을 나노여과 기술과 통합함으로써 엔도솜 소포의 물리화학적 및 분자적 무결성을 보존하면서 분리 공정을 크게 간소화했습니다.

이 절차의 성공에는 몇 가지 단계가 중요합니다. 초기 조직 균질화 및 온도 제어 원심분리는 소기관 무결성을 보존하고 소포 분획을 농축하는 데 필수적입니다. EXODUS 기반 분리 단계14, 특히 멤브레인 헹굼 및 소포 용출 중에 주의 깊게 취급.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 다음 보조금의 지원을 받았습니다: 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 보조금 2R01HL121700-06A1 및 R01HL172834-01 MW, 미국 심장 협회 24TPA1303770 및 25EIA1422015 보조금(MW US EPA84045701 XL).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
µ-슬라이드 8 웰 하이이비디80806-90
1.5 mL 눈금이 매겨진 미세 원심분리기 튜브미국 사이언티픽1615-5500
10x 트리스/글리신 완충액바이오 래드1610734
4x Laemmli 샘플 버퍼바이오 래드1610747
벤치탑 원심분리기에펜도르프Eppendorf 원심분리기 5810R
소 혈청 알부민 시그마A9418
셀 스트레이너코 닝CLS431750기공 크기 40  &무; m, 멸균
CELLSTAR 조직 배양 접시VWR82050-546폴리스티렌, 멸균, 60mm 및 급성; 15 밀리미터
ChemiDoc 이미징 시스템바이오 래드케미독 XRS+
세척액나노FCM17159
Pierce용 DMEM 1차 세포 분리 키트피셔 사이언티픽PI88287
DTT피셔 사이언티픽BP172
덜베코' 인산염 완충 식염수(PBS)써모 사이언티픽10010023
ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약바이오 래드1705061
EDTA시그마E4884
유럽 지역1세포 신호 전달3288 년대WB(1:1000)
에그타시그마E-4378-25
EID출애굽기MA03 EID
ERp72세포 신호 전달5033SWB(1:1000)
에탄올UH 리서치 스토어200 프루프, 5 갤런
엑소더스 H-600출애굽기H-600
GAPDH프로틴테크10494-1-AP백화당 (1:5000)
행크' 균형 염 용액(HBSS)써모 사이언티픽14175095
헴스시그마H3375
균질 화기피셔 사이언티픽15340167
케이클시그마P3911
램프1아브캠AB320851WB (1:2000)
LC3세포 신호 전달2775년대WB(1:1000)
Litesizer 500 안톤 파르라이트사이저 500Zetasizer(Malvern) 또는 DLS 와 같은 기타 장비; (와이어트) 사용 가능
엠체리비오르비트(Biorbyt)오브66657WB (1:500)
MgCl2피셔 사이언티픽BP214-500 시리즈
나크롬시그마S7653
나노FCM나노FCM유량 나노분석기
나노스피어 크기 표준써모 사이언티픽3020ᅡ
Nikon AXR 컨포칼 현미경니콘AXR
PBS의 파라포름알데히드 용액 4%산타크루즈 생명공학SC-281692
팔로이딘 라벨링 프로브인비트로젠A22284IF (1:500)
Pierce BCA 단백질 분석 키트써모 사이언티픽23227
Pierce 일차 심근 세포 분리 키트써모 사이언티픽88028
폴리에테르설폰 주사기 필터밀리포어SLHPR33RS기공 크기 0.45  &무; m, 멸균
프리캐스트 단백질 젤바이오 래드4561093
QC 비즈나노FCMQS2503 시리즈
랍7세포 신호 전달9367초WB(1:1000)
RIPA 용해 및 추출 완충액써모 사이언티픽89900
Roche PhosSTOP (PI 칵테일)로슈4906837001
실리카 나노스피어나노FCMS16M-엑소
자당시그마84097
스윙 버킷 로터베크만 쿨터SW55Ti
트랜스 블롯 터보 전사 시스템 RTA 전사 키트바이오 래드1704270
트윈 20바이오 래드1662404
초원심분리기베크만 쿨터옵티마 XE-90
초원심분리기 튜브 베크만 쿨터326819
초음파 세척 욕조브랜슨 초음파CPX952238R
VWR 튜브 센트 50mLVWR89039-656
VWR 튜브 원심분리기 15 mLVWR89039-666
제타 전위 참조 자료안톤 파르175108

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular car....

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