방법 논문

질량분석법을 이용한 글리컴의 공간 분자 영상

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DOI:

10.3791/69154

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2025년 11월 28일

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 질량분석법 영상을 이용해 글리코겐과 N-결합 당류를 엄격하고 재현 가능하게 측정하기 위한 주요 단계를 상세히 설명합니다.

초록

글리컴의 조직 내 공간적 조직은 생리적 기능의 분자적 기초에 핵심적입니다. 다양하고 역동적인 글리컴은 대사, 신호 전달, 부착 등 기본 세포 과정에 매우 중요합니다. 공간 생물학의 혁신은 다양한 글리컴 클래스의 공간 분자 영상화에 새로운 길을 열어주었습니다. 여기서는 신선하게 냉동된 쥐 간 내 글리컴의 공간 생체분자 영상을 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 작업 흐름은 (1) 빠른 수확 및 냉동, (2) 최적의 두께와 위치에서의 냉동체 절단, (3) 탄수화물 활성 효소를 이용한 조직 준비 및 조직 내 효소 소화, (4) 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MSI)을 통한 매트릭스 적용 및 데이터 수집, (5) 생물학적 맥락에 맞는 데이터 처리 및 시각화로 구성됩니다. 이 접근법을 사용하면 N-결합 글리칸과 글리코겐의 상세한 공간 지도를 획득하여 주요 생리적·세포적 특징을 드러낼 수 있습니다. 이 데이터는 간 기능과 기능 장애와 관련된 주요 공간적 당당 이질성을 정의할 수 있게 합니다. 이 워크플로우는 마우스 간의 공간적 당체를 매우 재현 가능하고 민감한 상태로 만듭니다. 또한, 다른 조직이나 종에도 쉽게 적응할 수 있어 글리컴 생물학의 건강과 질병에 대한 새로운 공간적 통찰을 가능하게 합니다.

서론

공간생물학 분야는 빠르게 확장되어 살아있는 유기체의 역동적인 공간적 생체분자 복잡성에 대한 중요한 통찰을 제공하고 있습니다. 생물학적 맥락에서 서로 다른 생체분자를 연구하기 위해 다양한 접근법이 사용되고 있습니다. 일부는 매우 전문화된 기술이지만, 질량분석법(MS)은 세포, 조직 또는 생물체의 맥락에서 다양한 생체분자를 정량화하는 데 중요한 일반 기법으로 부상했습니다.

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석법(MALDI-MSI)은 다중체 공간 생체분자 이미징을 위한 신흥 일반 기법 중 하나입니다. 이 방법은 조직 슬라이스 내 단백질과 펩타이드의 시각화를 위해 처음 설립되었습니다. 그 이후로 다양한 생물학적 샘플과 분자로 확장되었습니다. 이 기법은 세포 샘플3, 오가노이드4, 모델 동물5, 환자샘플 6,7에 적용할 수 있습니다. 일부 분자 클래스는 MSI 기반 접근법으로 직접 측정할 수 있으며, 여기에는 많은 대사산물과 지질이 포함되며, 단백질과 글리칸과 같은 더 복잡한 생체분자는 MSI 기반 검출에 적합하기 위해 효소 또는 화학적 처리가 필요합니다 2,8.

MALDI-MSI는 또한 N-결합 당류와 글리코겐의 공간 분석에 적용되었으며, MSI 검출에 적합한 당당 조각 9,10,11,12,13,14,15를 생성하기 위해 효소 처리가 필요한 워크플로우를 활용합니다. N-글리칸은 PNGase F로 단백질의 아스파라진 잔기에서 절단되고, 글리코겐의 포도당 사슬은 아이소아밀라제로 절단됩니다. MALDI 글리코겐 분석의 주요 장점은 생물학적 샘플 내 글리코겐 분포의 공간적 정의, 상대적 정량화, 포도당 사슬의 분기 현상에 대한 정보를 제공한다는 점입니다. N-글리칸과 글리코겐 워크플로우 모두 MSI 분석을 위해 샘플의 효소 처리가 필요하므로, 글리컴 분석을 위한 통합 워크플로우로 통합되었습니다(그림 1A). 이 작업 흐름은 생물학적 샘플의 신중한 준비와 특정 처리를 통해 MS 분석을 가능하게 하고, 이후 데이터 수집 및 처리가 필요합니다. 워크플로우는 일련의 전문 단계를 필요로 하지만, 매우 재현성이 뛰어나고다양한 샘플 유형에 맞게 조정할 수 있는 풍부하고 고품질의 공간 글리컴 데이터를 생성합니다. 또한, 워크플로우는 모듈화되어 있어 샘플 처리 단계를 독립 연구소에서 수행한 후, MALDI-MSI 데이터 수집 및 분석의 후반 단계를 수행하는 전문 시설에 샘플을 제출할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 플로리다 대학교의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC) 지침을 준수하여 수행되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 간 채취

  1. 동물 안락사 및 해부
    1. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키기 위해 경추 탈구 및 참수를 시행합니다.
      참고: 이 예시에서는 6개월 된 야생형 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 이 나이의 쥐는 ~25-33g입니다. 이 분석에는 다양한 연령, 체격, 품종이 적합합니다.
    2. 즉시 동물을 흡수성 하부 패드 위에 올려놓고 멸균 메스로 복강을 노출하세요.
    3. 멸균 겸자와 가위를 사용하여 간을 최소한의 조작과 조직 손상으로 분리합니다.
      참고: 대사 변화는 빠르게 일어납니다. 가능하면 관류나 진정제를 피하고, 해부 단계는 가능한 한 신속하게 수행되도록 하세요17.
  2. 조직을 빠르게 세척하고 청소하세요.
    1. 간을 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 부드럽게 담가 혈액을 제거하세요.
    2. 조직을 탈이온(DI) 물에 두 번 담가.
    3. 깨끗한 작업 와이퍼에 부드럽게 대어 과분한 물을 닦아내세요.
      참고: 표준 현미경 슬라이드에 들어갈 수 있는 크기보다 큰 샘플은 냉동 전에 반드시 조각으로 잘라내야 합니다.
  3. 샘플 얼음
    1. 세척한 간을 액체 질소 위에 떠 있는 미리 냉각된 일회용 일회용 스티렌 무게 보트에 직접 넣으세요.
    2. 조직이 반짝이는 불투명색으로 변하면 약 3분 후, 조직을 미리 만들어진 라벨이 붙은 알루미늄 호일 봉지에 드라이아이스 위에 넣습니다.
    3. 샘플이 담긴 알루미늄 호일 봉지를 -80°C 냉동고에 보관하세요. 샘플은 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다.

2: 생물학적 샘플 준비

  1. 냉동절부 준비
    1. 크라이오스타트가 켜져 조직에 적합한 온도인 -16 °C에서 -20 °C 사이로 균형 잡혀 있는지 확인하세요. 정확한 온도는 조직의 종류에 따라 다릅니다. 간은 조직 찢어짐을 방지하기 위해 약 -16°C에서 -17°C의 약간 더 따뜻한 온도에서 절절해야 하며, 다른 조직은 -20°C에서 절절해야 합니다.
    2. 최소 두 개의 척, 두 개의 얇은 붓, 얇은 핀셋 한 쌍, 그리고 70mm 유리 인서트를 냉동 온도에서 준비하세요. 또한, 연필로 라벨을 슬라이드해 냉동체에 넣어 적응시키세요.
    3. 조직을 -80°C 냉동고에서 드라이아이스에 올려 냉동기로 옮깁니다.
    4. 조직이 최소 30분 이상 냉동 온도에 적응할 시간을 주세요.
    5. 유리 인서트 가장자리에 손상이 없고, 조직이 안티롤 가이드와 만나는 부분이 매끄럽게 이루어지는지 장갑 낀 손가락으로 가장자리를 따라 문지르세요.
    6. 유리 인서트를 안티롤 가이드에 넣으세요.
    7. 낮은 프로파일의 칼날을 조심스럽게 열린 칼날 홀더에 넣고 칼날 홀더를 닫으세요. 빨간 블레이드 가드를 칼날 위에 내려놓고 섹션 분할 때까지 두세요.
    8. MS와 호환되는 M1 마운팅 매체를 사용해 조직을 척에 장착하세요. 크라이오스탯 안에서 상온의 M1 마운팅 매개체를 척에 올려놓고, 척의 최소 두 개의 링을 덮어 조직이 고정되도록 하세요.
      참고: 최적 절단 온도(OCT) 화합물은 냉동절부에 자주 사용됩니다; 그러나 MS 응용에서는 이온 억제를 일으키므로 피해야 합니다. OCT를 사용해야 한다면, OCT를 최소화하거나 제거하기 위해 추가적인 다단계 프로토콜을 사용해야 합니다. 또한 일부 MS 자원 센터는 OCT에 내장된 샘플을 분석하지 않습니다.
    9. 차가운 핀셋을 꺼내 알루미늄 호일에서 조직을 떼어내세요. 핀셋을 사용해 조직을 원하는 방향으로 척 위에 위치시킵니다.
    10. 척을 크라이오스탯에 넣어 장착 매체가 약 2분 정도 얼도록 하세요. 얼리면 단단해져 불투명해 보입니다.
  2. 간 조직 냉동 절개
    1. 부착된 티슈가 있는 척을 척 홀더에 넣습니다. 척을 조직이 블레이드에 90° 각도로 절단되도록 위치시킵니다.
    2. 척 홀더를 조직이 칼날과 닿지 않을 때까지 당깁니다. 조직이 칼날에 바로 인접할 때까지 천천히 척을 넣어 조각 절단을 시작하세요.
    3. 원치 않는 조직을 제거하기 위해 30 μm 두께의 절단을 시작하세요.
    4. 롤 플레이트 깊이가 매끄러운 단면을 만들어내고, 조직이 롤 플레이트 위로 굴러가지 않도록 하세요. 그렇다면 롤 플레이트를 약간 느슨하게 하세요. 조직이 롤 플레이트를 움직이고 회전 리셋 시 두 번째로 부딪히면, 롤 플레이트를 약간 조이세요.
    5. 원하는 단면에 가까워지면, 슬라이스의 의도된 두께를 10 μm 또는 특정 용도에 적합한 다른 원하는 두께로 줄이세요.
    6. 척이 적절한 두께로 맞춰져 렉징과 불균형한 구간을 방지할 수 있도록 10회전을 완료하세요.
    7. 구획 준비를 위해 차가운 붓으로 스테이지를 정리하세요. 롤 플레이트를 칼날 위에 닫고 천천히 조직의 한 부분을 떼어내세요.
    8. 롤 플레이트를 들어 올리고 두 개의 차가운 페인트 붓으로 칼날에서 부드럽게 부분을 떼어내세요. 슬라이드에 장착하기 편하도록 무대 옆으로 섹션을 당겨 주세요.
    9. 냉동체에 있는 슬라이드 캐리어에서 차가운 슬라이드를 꺼내고, 조직이 위치할 곳과 반대편에 검지손가락을 10초 동안 올려놓습니다.
    10. 슬라이드를 부드럽게 조직 위에 올렸다가 다시 들어 올립니다. 세게 누르면 조직이 찢어질 수 있습니다. 조직이 슬라이드 위로 녹아 반투명해질 것입니다.
    11. 슬라이드를 건조기로 빠르게 옮겨 건조하세요. 슬라이드를 건조기에서 1시간 말립니다.
    12. 건조 후 슬라이드는 MS로 직접 가공하거나 진공 포장하여 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.

3. 당체학 MSI를 위한 슬라이드 준비

  1. 효소 제제
    참고: MS 준비 저염 동생 PNGase F를 구매하여 직접 사용할 수 있습니다.
    1. 이소아밀라아제는 MS 적용을 위해 과도한 염분을 제거하기 위해 투석이 필요합니다. 한 개 이상의 투석 컵을 HPLC 물에 15분간 담가서 준비하세요.
    2. 500 μL 투석컵을 14.3 mL HPLC 물에 2시간 동안 4°C에서 교반 없이 2시간 동안 200 μL 스톡 아이소아밀라아제를 이분해합니다. 14.3mL의 HPLC 물을 신선한 HPLC 물로 교체하고, 4°C에서 추가로 16시간(하룻밤) 다스릴링합니다. 14.3mL의 HPLC 물을 신선한 HPLC로 교체하고, 4°C에서 추가로 8시간 동안 다이아리레이션을 합니다.
    3. 피펫으로 컵에서 아이소아밀라아제를 부드럽게 제거하고 1.5 마이크로 원심분리관에 넣으세요. 투석 후 이소아밀라아제 용액의 총 부피(μL)를 측정합니다. 재고의 시작 활성(보통 200 단위/mL)과 최종 부피를 바탕으로 3단위 아이소아밀라아스에 필요한 총 부피를 계산합니다.
    4. 3단위 아이소아밀라아제를 얇은 벽의 PCR 튜브에 피펫 분리합니다. 액체 질소에 스냅 냉동 튜브를 넣으세요. -80°C에서 보관하세요. 각 분무 프로토콜마다 다이아리시즈 이소아밀라아제 용액 한 튜브를 사용할 수 있으며, 이는 네 번의 슬라이드에 충분합니다. 효소 활성을 유지하려면 냉동 해동 사이클을 피하세요.
  2. 고정 및 조직 세척
    1. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고, 10% 중성 완충 포르말린(NBF)이 채워진 유리 용기에 1시간 동안 담가둡니다.
    2. NBF에서 슬라이드를 제거하세요. 슬라이드를 70% 에탄올에 2시간 담가세요.
    3. 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올을 담은 코플린 병 4개를 준비하세요. 순차적으로 세척할 때 혼동을 피하려면 각 병에 명확하게 라벨을 붙이세요.
    4. 슬라이드를 순서대로 옮깁니다: 70% 에탄올 5분, 80% 에탄올 5분, 90% 에탄올 5분, 100% 에탄올 5분.
    5. 슬라이드를 신선한 100% 자일렌이 채워진 유리 페트리 접시에 옮기세요. 슬라이드가 완전히 잠겨 있는지 확인하세요. 조직의 지질 함량에 따라 70rpm으로 셰이커에 1시간 동안 슬라이드를 인큐베이팅하세요. 이 과정을 각 세척할 때마다 신선한 자일렌을 사용해 두 번 더 반복합니다.
      참고: 이 프로토콜은 지질이 이온 억제를 일으키고 최대 재현성을 위해 최대한의 탈지화를 가능하게 하도록 설계되었습니다. 하지만 이로 인해 신호가 비국지화되어 얻을 수 있는 해상도가 떨어집니다. 세척 단계를 줄이고 처리 시간을 제한하며 습도를 세심하게 조절하면 비국지화를 줄여 데이터 해상도를 향상시킬 수 있습니다.
    6. 슬라이드를 건조기에 넣어 하룻밤 동안 말리세요.
    7. 슬라이드를 70% 에탄올에 1분간 넣어 수분을 보충시키세요. 슬라이드를 DI 물에 3분간 넣으세요. DI 워터 세척을 신선한 DI 워터로 반복하세요.
    8. 슬라이드를 건조기에서 10분 또는 완전히 마를 때까지 건조하세요.
  3. 효소 적용을 위한 슬라이드 준비
    1. HTX 습도 챔버를 준비하세요. 금속 선반 아래에 DI 워터에 적신 종이 타월을 놓으세요. 챔버를 37°C 인큐베이터에 넣으세요.
    2. 음식 찜기를 준비하려면 물 저장소를 위까지 채우세요. 타이머를 60분으로 설정해 기기를 켜세요.
    3. 50mL 팔콘 튜브에 50mL의 HPLC 등급 물, 25 μL 의 시트라코닉 무수물, 2 μL 12 M HCl을 첨가하여 시트라코닉 완충제를 준비합니다. 용액을 10초 동안 완전히 섞도록 보텍스하세요. 50mL 원심분리기 튜브 하나당 시트라코닉 버퍼는 네 개의 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 용액의 pH가 3.0(허용 범위: 2.5-3.5)인지 확인하세요.
    4. 각 메일러에 준비된 치트라코닉 버퍼를 채우세요. 슬라이드를 조직이 안쪽을 향하게 하여 조직이 옆면에 닿지 않도록 하여 효과적인 항원 회취를 가능하게 합니다. 메일러당 두 개의 슬라이드를 사용할 수 있으며, 두 가지 가장자리 위치를 모두 안쪽을 향하게 하여 휴지가 있습니다.
    5. 음식 스티머에서 증기가 나오는지 확인하세요. 우편물을 음식 스티머에 넣고 30분간 부화시키세요.
    6. 우편물을 DI 물에 5분간 옮겨 보세요. 메일러의 시트라코닉 버퍼 절반을 DI 물로 교체하고 5분 더 두세요. 이 희석을 두 번 더 반복하세요.
    7. 모든 용제를 제거하고 슬라이드 메일러에 100% DI수를 넣고 DI수를 제거하여 슬라이드를 세척하세요. 실험실 물티슈를 사용해 조직이 발견되지 않은 부위 주변을 반소 건조시키세요.
    8. 각 슬라이드 뒷면에 원과 삼각형을 그려 내부 표준 위치를 표시하세요. 슬라이드 앞면에 1 μL 1 mg/mL 고추냉이 과산화효소(HRP; 원)와 10 mg/mL 토끼 간 글리코겐(삼각형) 1 μL 바르세요.
    9. 슬라이드를 건조기에 15분간 넣어 완전히 말리세요.
  4. 효소 분사 및 소화
    1. 100 μg 동간 건조 PNGase F 튜브 1개(500 단위/μg)와 3 단위 아이소아밀라아제 튜브 1개를 제거하고 10분간 해동합니다. 마이크로 원심분리관 안에서 ~2000 x g 압력으로 5초 동안 튜브를 돌립니다. 이 효소는 4개의 슬라이드를 분사하기에 충분합니다.
    2. 각 동성식품 PNGase F관에 50 μL DI물을 피펫팅하고, 10초간 부드럽게 소용돌이로 돌리고, 마이크로퓨지에서 ~2000 x g 의 압력으로 5초간 돌립니다. 50 μL PNGase F 용액을 직접 아이소아밀라제 튜브에 피펫 주입합니다. 최종 부피 1mL에 HPLC를 추가합니다.
    3. 이중 효소 마이크로 원심분리관을 10초에 돌리고, 5초 동안 ~2000 x g 로 회전합니다.
    4. HTX M5 분무기를 켜고 HTX M5 소프트웨어를 열어보세요. 시스템 탭에서 트레이 유형이 Ambient로 설정되어 있는지 확인하세요.
    5. Knauer 펌프를 끄려면 앞 오른쪽에 있는 정지 버튼을 눌러 끄세요. 외부 주사기 펌프 뒷면에 있는 스위치로 전원을 켜세요.
    6. HTX 소프트웨어의 '방법' 탭에서 이중 효소 분무에 적합한 방법을 선택하세요. 파라미터는 노즐 온도 45 °C, 15회 패스, 유량 0.025 mL/min, 속도 1200 mm/min, 트랙 간격 3 mm, CC 패턴, 압력 10 psi, 가스 유량 3 L/min, 노즐 높이 40 mm로 설정되어야 합니다.
    7. 온도 탭으로 이동해 스프레이 노즐 온도를 45 °C로 설정하세요. 렌치를 사용해 스프레이어 라인을 상단 커넥터로 옮기세요.
    8. 초고순도 질소 가스 밸브를 열고 분사 압력이 10 psi인지 확인하세요. 주사기 펌프에서 유량을 95 μL/min으로 설정하세요.
    9. 새 주사기와 바늘을 사용해 4mL HPLC 물을 채우세요. 모든 기포를 제거하세요. 분무기 라인의 ~6인치 구간을 통해 2mL의 물을 폐기물 비커에 넣으세요.
    10. 주사기를 분무기 라인에 연결하고, 95 μL/min에서 5분간 주사기 펌프를 통해 물을 돌립니다.
    11. 주사기 펌프를 플러싱할 때, 금속 정렬 가이드를 사용해 슬라이드를 가열된 트레이의 왼쪽 하단 모서리에 테이프로 붙여 조직이 분사 영역 내에 있는지 확인하세요. 샘플 탭에서 스프레이 영역의 X와 Y 파라미터를 정의하여 약간의 오버스프레이를 허용하여 슬라이드 완전 커버리지를 보장합니다.
    12. 5분 후에 펌프를 멈추고 주사기를 분리한 뒤 공기를 들여 넣은 뒤, 스프레이어 라인을 통해 공기를 밀어 남은 물을 배출하세요. 필요하면 반복하세요.
    13. 듀얼 효소 용액을 새 주사기에 주입하고 펌프에 연결하여 기포가 남지 않도록 하세요.
    14. 주사기를 분무기 라인에 연결하세요. 주사기 펌프에서는 유량을 분당 25 μL로 조절하세요.
    15. 분사 노즐이 45 °C에 도달하면 사이클 탭 아래의 시작 버튼을 누르세요. Knauer 펌프를 켜라는 안내 메시지에 '아니오'를 클릭하세요. 주사기 펌프의 시작 버튼을 누르면 분사가 시작됩니다.
    16. 스프레이 노즐 아래에 빈 슬라이드를 놓아 눈에 띄는 효소 분사 침착을 확인하세요. 관찰이 완료되면 소프트웨어에서 '계속' 을 클릭하고, 유리 덮개를 분무기에 올려놓은 뒤, 분사가 균일하게 적실 수 있도록 고르게 도포되는지 모니터링하세요.
    17. 분사 사이클이 완료되면 펌프 정지 버튼을 누르고 질소 가스를 차단한 후 밸브 부하 확인을 클릭하세요. 분무기의 라인과 단계를 청소하고 분무기를 끄서 Knauer 펌프가 다시 작동하는지 확인하세요.
    18. 슬라이드를 HTX 습도 챔버에서 37°C에서 2시간 동안 인큐베이팅하고, 슬라이드는 위를 향하게 놓습니다. 완성되면 슬라이드를 건조기에 15분간 넣어두세요. 슬라이드는 건조기 안에 하룻밤 동안 남을 수도 있고, 프로토콜을 계속 진행할 수도 있습니다.
  5. MALDI 행렬 준비 및 적용
    1. 매트릭스 적용 전에 스캐너를 사용해 슬라이드의 광학 이미지를 캡처합니다.
    2. 15mL 원뿔형 튜브에 고형 CHCA 40mg을 무게로 담으세요. CHCA 분말을 0.1% 트리플루오로아세트산과 50% 아세토니트릴(ACN) 용액에 7mg/mL 농도로 용해합니다.
    3. 매트릭스 용액을 10분간 초음파 처리하며, 90초 켜고 30초 꺼짐 사이클을 사용하세요. 이 과정을 5번 반복하여 완전한 해체와 균일성을 확보하세요.
    4. HTX M5 분무기를 켜고 HTX M5 소프트웨어를 열어보세요. 질소 가스 밸브를 열고 시스템 압력을 10 psi로 설정하세요.
    5. HTX 소프트웨어의 방법 탭에서 CHCA 매트릭스 분무에 적합한 방법을 선택하세요. 노즐 온도 79 °C, 10회 통과, 유속 0.1 mL/min, 속도 1300 mm/min, 트랙 간격 3 mm, CC 패턴, 압력 10 psi, 가스 유량 3 L/min, 노즐 높이 40 mm로 설정.
    6. 온도 탭으로 이동해 분사 노즐 온도를 79°C로 설정하세요. 펌프 탭에서 유량을 100 μL/min으로 설정하세요.
    7. 금속 가이드를 사용해 가열된 트레이의 왼쪽 하단 모서리에 슬라이드를 테이프로 고정하여 스프레이 부위가 제대로 정렬되도록 하세요. 샘플 탭에서 스프레이 영역의 X와 Y 파라미터를 정의하여 약간의 오버스프레이를 허용하여 슬라이드 완전 커버리지를 보장합니다.
    8. 일회용 주사기와 바늘을 사용해 50% ACN 5.5mL를 뽑아내세요(기포 제거).
    9. 스프레이어를 LOAD 모드로 설정하세요. ACN 주사기를 삽입하고 주사하세요. ACN 주사기를 제거하고 즉시 5.5mL 여과된 CHCA 용액이 들어간 새 주사기로 교체하세요. 주사할 때 기포를 피하세요. 스프레이어를 SPRAY 모드로 설정하세요.
    10. 분사 노즐이 79 °C에 도달하면 사이클 탭 아래의 시작 버튼을 누르세요. 안내 버튼에 '예'를 클릭하세요.
    11. 빈 테스트 슬라이드를 사용해 분무기 노즐 아래에 놓으세요. 가시적 매트릭스 분사 증착을 확인하기 위해 슬라이드에 노란색 매트릭스 증착물이 표시됩니다. 관찰이 완료되면 ' 계속'을 클릭하고, 유리 덮개를 기기에 덮은 뒤 분사 상태를 모니터링하세요. 일정한 분사는 균일한 불투명도를 가진 슬라이드를 만듭니다.
    12. 분사 사이클이 완료되면 분무기를 LOAD 모드로 설정하고 Valve load confirm을 클릭하세요.
    13. 펌프를 300 psi로 설정하고 온도를 30 °C로 낮춰 스프레이를 청소하세요. 50% 아세토니트릴을 5mL를 두 번, 50% 메탄올 5mL를 두 번 흡입하고 라인에 밀어넣습니다. 무대를 100% 메탄올로 깨끗이 닦아. 온도가 30°C에 도달하면 LOAD로 전환하고, 가스를 끄며, 분무기를 끄고 Knauer 펌프가 다시 켜졌는지 확인하세요.
    14. 매트릭스가 완전히 마를 때까지 슬라이드를 건조기에 15분간 넣습니다. 슬라이드는 살포 후 가능한 한 빨리, 최대 14일 이내에 작동하여 적절한 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 신뢰할 수 있는 데이터 수집을 보장해야 합니다.

4. MALDI-MSI 당학 데이터 수집

  1. 데이터 수집 준비
    1. 슬라이드를 슬라이드 어댑터로 MALDI 기기의 샘플 홀더에 고정하세요. 샘플 홀더를 MS에 삽입하고 영상 촬영을 위해 제대로 장착되었는지 확인하세요.
    2. flexImaging 소프트웨어를 열고 이전에 녹화한 광학 슬라이드 이미지를 불러오세요. 자세한 내용은 3.4.1 단계를 참조하세요. 필요하다면 영상 정렬을 기기 단계와 보정하여 조직 절편과 표준 부위가 영역 선택에 적합한 올바른 위치에 있도록 하십시오.
    3. 조직 절편의 영상 영역, HRP 표준, 글리코겐 표준, 대조 행렬을 소프트웨어에서 정의하세요. 각 지역을 별도의 영역으로 개요로 설정하세요.
    4. 래스터 스텝 크기를 50 μm으로 설정하면 픽셀 해상도가 50 × 50 μm가 됩니다.
    5. 계측기 제어 소프트웨어에서 양이온 MS 모드를 선택하고 m /z 500 - 4000 으로 스캐 범위를 설정하며, 저질량 컷오프는 700.00 m/z로 설정합니다.
    6. 기기 제어 소프트웨어에서 미리 최적화된 MALDI 영상 튜닝 매개변수를 불러오거나(필요 시 값을 수동으로 입력하세요). 소스 및 이온 광 전압이 지정된 값으로 설정되어 있는지 확인하세요: MALDI 플레이트 오프셋 50.0 V; 편향 1 델타 70.0 V; 깔때기 1 RF 500.0 Vpp; 깔때기 2 RF 500.0 Vpp; 다중극 RF 500.0 Vpp; 이온 에너지 5.0 eV. 충돌 셀과 TOF 타이밍 설정을 확인하세요: 충돌 에너지 10.0 eV; 충돌 RF 4000.0 Vpp; 전송 시간 180.0 μs; 프리펄스 저장 25.0 μs.
    7. 레이저 탭에서 레이저 설정을 확인하세요. 애플리케이션 기본값으로 50 μm을 선택 하세요.
    8. 튠 믹스와 같은 외부 캘리브런트 혼합물을 사용하여 질량 분석기를 보정합니다. 캘리브랜트를 도입하고 계측기의 캘리브레이션 루틴을 실행하세요. 보정을 조정하여 질량 정확도 오차가 0.001% 이내이고 보정 정확도 점수가 100%가 되도록 합니다.
    9. 획득 시 10,000 Hz 주파수에서 320회의 레이저 발사를 연속 촬영하도록 설정했습니다. 신호 강도를 최적의 동적 범위 내에서 유지하기 위해 레이저 감쇠를 37%로 조정해야 합니다. 필요에 따라 레이저 샷과 감쇠를 조정하세요.
    10. 기기의 자동 빔 정렬 기능, 목표 프로파일 조정, 초점 조정을 사용하여 레이저가 시료에 적절히 초점을 맞추도록 하세요. 조직에서 벗어난 영역에서 제어 소프트웨어의 레이저 탭에서 자동 빔 조정을 실행하여 레이저를 이온 광학과 정렬하세요. 이렇게 하면 레이저와 스테이지가 최적의 데이터 수집을 위해 조정됩니다. 마지막으로, 샘플 캐리어 탭에서 타겟 프로파일 생성과 초점 조정을 실행하세요.
    11. 내부 표준 스팟이 예상 이온 피크를 생성하는지 확인하여 데이터 수집 준비가 되었음을 나타냅니다. HRP는 1211.42에서 당당 피크가 두드러져야 합니다. 글리코겐은 1013.32, 1175.37, 1337.43에서 가장 높은 강도의 봉크를 규칙적으로 배치해야 합니다.
      참고: 강도에 문제가 발견되면 레이저 구성을 다시 검토하세요. 질량 정확도에 문제가 발견되면 보정을 다시 점검하세요.
  2. MALDI-MSI 데이터 수집
    1. 정의된 영역에 대해 MALDI-MS 영상 획득을 시작하려면 영상 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하세요. 기기는 각 정의된 영역에 50 μm 간격으로 자동으로 레이저를 래스터하며, 각 픽셀에서 양이온 MS1 스펙트럼(m/z 500-4000)을 획득합니다. 이 해상도에서 간 절제의 일반적인 데이터 수집 시간은 135분입니다.
      참고: 실행 후 기기는 획득한 픽셀마다 자동으로 스펙트럼을 저장하여 원시 데이터가 담긴 .d 폴더를 생성합니다.

5. MALDI-MSI 데이터 분석

  1. 데이터 가져오기 및 내보내기
    1. 데이터셋을 SCiLS Lab 또는 동등한 MSI 분석 소프트웨어로 가져오면 조직 절편 전체에 걸친 글리컴의 이온 강도 맵을 시각화할 수 있습니다.
    2. SCiLS 연구소를 열어보세요. 새로 선택하세요. MALDI 실행에서 .mis 파일을 선택하세요.
    3. .mis 파일이 SCiLS에서 열리면 다음을 클릭하세요. m/z 거리는 자동 범위 선택. Axis Parameters의 자동 축 을 선택하세요. 절대 빈 크기를 선택하세요. 다음 을 클릭한 후 가져오기를 선택하세요. 파일이 저장될 폴더를 선택하세요.
    4. 가져오기가 끝나면 새 .slx 파일을 열어보세요.
    5. 파일을 클릭해 가져오기 후 파일 기능 목록을 선택하세요. 글리컴 주석을 가져오고 이온 이미지를 생성하려면 기능 목록 창에 들어가 올바른 목록을 선택한 후 '이온 이미지 생성' 버튼을 클릭하세요.
      참고: N-글리칸16, 18, 19, 글리코겐13에 대한 견고한 특징 목록이 제공됩니다.
    6. 적절히 데이터를 정규화하세요. 총 이온 수(TIC)는 가장 일반적으로 사용되는 정규화법입니다.
    7. 이온 이미지가 로드된 후에는 특징 목록을 살펴보고 피크 통합이 제대로 이루어졌는지 확인하고, 피크가 완전히 통합되지 않은 특징은 수동으로 조정하세요. 조정하려면 Shift 키를 누른 채 피크를 왼쪽으로 클릭하세요. 피크가 통합되면 키보드의 컨트롤과 스페이스바를 누르세요. 이렇게 하면 조정된 피크에 대한 새로운 이온 이미지가 생성됩니다.
    8. 기능 목록의 나머지 부분을 반복한 후, ion 이미지 패널에서 기능 저장 목록을 선택하고 목록을 명명한 후 저장을 클릭하세요.
    9. 파일, 특징 테이블로 가서 방금 저장한 기능 목록 테이블을 열어보세요. m/z로 정렬하세요. 조정된 특징들은 이름 열에 빈 셀로 표시됩니다. 조정된 피크의 이름을 복사해서 붙여넣고, 피처 테이블 상단 중앙에 위치한 '선택된 행 제거' 버튼을 선택해 원래 피크를 제거하여 이름을 변경합니다.
    10. 모든 이름을 조정한 후 최종 주석이 달린 피크 리스트가 얻습니다. 삭제 버튼 근처에 있는 강도 추가 버튼을 클릭하세요. 여기서 관심 있는 샘플을 선택하여 각 영상 영역별 주석이 달린 특징의 평균 강도를 내보내세요.
    11. 정규화를 위해 피크 영역 간격 처리 모드와 총 이온 수를 선택하세요. 확인을 클릭하세요. 해당 데이터가 포함된 새로운 열이 나타납니다. 데이터를 내보내려면 바깥쪽 방향 화살표를 선택하고 .csv 저장하세요.

결과

야생형 쥐의 간을 신중하게 처리하여 전체 횡단면을 절단하는 것을 통해 MALDI-MSI에 의해 글리컴을 정의할 수 있었으며, 다양한 글리코겐 유래 올리고당과 N-결합 당류가 m/z에 걸쳐 분포되어 있습니다(그림 1B). 글리코겐은 간 간세포 전반에 넓게 국한되어 있었으며, 관문 기관의 혈관과 결합 조직에는 결핍되어 있었다(그림 1C,D). 중요하게도, MALDI-MSI 데이터는 글리코겐의 공간적 분포와 정상 대사 및 질병 상태에서 글리코겐의 핵심 특징인 사슬 길이 분포를 모두 측정할 수 있게 했습니다(그림 1D). 또한, 다양한 N-연관 글리칸은 다양한 조직을 보입니다. 관찰된 공간적 분포는 간세포 내 광범위한 분포(그림 1E)부터 간의 사인파 조직과 일치하는 지역 초점(그림 1F), 그리고 문맥 경로 요소의 특정 표지(그림 1G-I)까지 다양합니다.

figure-results-1
그림 1: 마우스 간의 MALDI-MSI 글리컴 분석. (A) 시료 준비, 데이터 수집 및 분석에서 중요한 방법들의 회로도. (B) 접근법에서 도출된 샘플 질량 스펙트럼. 빨간색 화살표는 글리코겐에서 유래한 일정 간격의 올리고당류를 나타내며, 포도당 단당이 한 점 차이가 납니다. 파란색 화살표는 N-글리칸을 나타내며, 이는 스펙트럼 전반에 분포해 있습니다. 간에서는 글리코겐 피크가 일반적으로 더 두드러지며, 특히 m/z 값이 높을 때 더욱 그렇습니다. (C) 간 내 글리코겐에서 유래한 말토헥사오스(DP6)의 공간적 분포. (D) 간 내 글리코겐 사슬 길이의 분포. (E-G) 간 내 다양한 N-결합 당당 종의 공간적 분포. (H) 중심부에 초점을 맞춘 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색, 그리고 해부학적 주석. (I) 문맥 회로 요소에서 추가적인 N-결합 당원(Hex5dHex1HexNAc5)의 공간적 위치를 보여주는 해당 초점 삽입. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

토론

MALDI-MSI는 글리컴 공간 생물학을 위한 신흥 도구입니다. 중요한 점은, 이 프로토콜이 특정 하드웨어를 이용한 데이터 수집에 중점을 두지만, 여러 벤더의 MALDI-MSI 플랫폼에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 샘플 처리는 방법 4까지는 동일하지만, 일부 공급업체는 특수 슬라이드를 요구할 수 있습니다. MALDI-MSI 플랫폼에 특화된 매개변수를 사용하여 데이터 수집을 수정함으로써 이 프로토콜의 신속한 적응이 가능합니다. 5단계에서 설명한 대로 벤더별 데이터 처리용 소프트웨어를 사용할 수 있으며, 또는 엄격하고 재현 가능한 MALDI-MSI 데이터 처리를 위한 플랫폼을 사용할 수도있습니다.

MALDI-MSI는 생물학을 이해하는 데 특히 유용한 도구인데, 각 기관, 조직, 세포마다 당종의 패턴이 다르기 때문입니다. 간은 글리코겐 농도가 높고 다양한 N-결합 당류를 가지고 있어 글리컴 분석에 적합합니다. 다른 기관들은 N-결합 당류의 수치와 다양성이 더 높고, 글리코겐13의 수치는 낮습니다. 중요한 점은, 글리컴은 대사와 질병 상태에 따라 다양한 기관에서 변하기 때문에, 글리컴은 풍부한 생물학적 정보원이 된다는 점이다 5,14,15,20. MALDI-MSI 분석을 위한 독특한 탄수화물 활성 효소의 지속적인 개발은 글리컴 분석을 글리컴 내 추가적인 직교 생체분자까지 확장할 것으로 기대됩니다.

많은 장점이 있지만, MALDI-MSI는 현재 공간 생물학에서 사용되는 다른 도구들에 비해 해상도가 제한적입니다. 이 프로토콜은 50 μm 해상도의 데이터 수집을 활용했습니다. 생리학적 분석에는 훌륭하지만, 단일 세포 해상도의 데이터는 필드21의 발전을 크게 이끌 것입니다. 특히, 염소 분포 및 습윤 조건에서의 배양을 활용하는 방법론에서 비국소화는 해상도 향상에 중요한 장애물이 될 수 있습니다. 최근 샘플 처리 하드웨어, 샘플 처리 방법론, 데이터 수집 하드웨어, 선택적 라벨링 사용, 데이터 처리 기술의 발전으로 MALDI-MSI 데이터 수집은 셀룰러 해상도에 근접할 수 있게 되었습니다. 그러나 해상도와 신호 대 잡음 비율 사이에는 균형이 있으며, MALDI의 현재 샘플 준비 방법에 따른 고유한 한계가 존재하여 고려해야 합니다. 매우 구체적인 응용 분야에서는 샘플 처리24와 새로운 알고리즘의 혁신을 통해 단일 세포 해석 MALDI-MSI 목표를 달성하고 있으며, 이러한 문제에 대한 일반적인 해결책이 달성 가능함을 시사합니다25, 26, 27.

데이터 수집 후에는 조직학적 주석을 위해 H&E 로 슬라이드를 염색할 수 있습니다. 그러나 MALDI-MSI 데이터 수집에는 세포 및 조직 손상이 연관되어 있어 이 전략은 세포 주석의 범위를 제한합니다. 또는 순차적인 조직 절편을 H&E에 사용할 수 있습니다. 이 전략은 고품질 데이터를 제공하지만, 이산 샘플 컷의 정렬과 통합이 필요합니다.

특히, 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 조직은 샘플 준비 프로토콜에 약간의 변경만 있으면 MALDI-MSI의 글리컴 분석에 매우적합합니다. 그러나 FFPE 조직은 대사체학 및 유사 분석에 효과적으로 활용될 수 없으므로, 여기서 자세히 설명한 대로 다중체학 접근법28에는 신선한 냉동 샘플이 선호됩니다. 샘플 준비는 불안정한 생체분자 MSI 파이프라인에서 매우 중요한 구성 요소로, 샘플17, 29, 30의 수확 및 취급을 위한 특별한 접근법이 필요합니다.

MALDI-MSI 기반 접근법의 일반성과 광범위한 활용을 확대하기 위한 방법론은 하드웨어와 소프트웨어의 극적인 발전과 함께 빠르게 발전하고 있습니다. 또한, 최근의 최첨단 멀티옴28 및 멀티모달21 접근법이 머신러닝과 인공지능과 결합되어 이러한 매우 복잡한 데이터셋 처리에 특히 유망합니다31.

공개 사항

R.C.S., M.S.G., C.W.V.K.는 플로리다 대학교 고등공간분자연구센터(CASBR)의 공동 소장이며, Sugar3 LLC의 공동 창립자입니다. R.C.S.는 Maze Therapeutics로부터 연구 지원 및/또는 컨설팅 수수료를 받았습니다. M.S.G.는 Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics, Aro Biotherapeutics로부터 연구 지원, 연구 화합물 또는 컨설팅 수수료를 받았습니다. M.S.G.는 첼시의 희망, 글루트1결핍증 증후군 재단, 성인 폴리글루코산 신체질환재단의 과학 자문위원회 위원입니다.

감사의 글

Vander Kooi, Sun, Gentry 연구실의 유익한 토론에 감사드립니다. 이 연구는 국립보건원(NI P30CA177558 H)이 D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 R.C.S., R35NS116824 M.S.G., R01DC019054 C.W.V.K., 플로리다 대학교 의과대학 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 언더패드덴빌 사이언티픽B1623
아세토니트릴 (ACN)시그마-올드리치34851-4X4L
알루미늄 호일피셔 사이언티픽  15078292
항산성 무수물시그마-올드리치125318
원뿔관 (15mL)알칼리 사이언티픽CW5600
코플린 자르DWK 생명과학900570
크라이오스터트 라이카CM1860
크라이오스탯 척라이카14041926491
건조기벨 아르트F424004131
투석 컵써모피셔88400
에탄올피셔 사이언티픽  22032601
푸드 스티머라이벌 CKRVSTLM21  그리고 nbsp;
유리 인서트 (70 mm)젤 컴퍼니LGI50
글리코겐시그마-올드리치G8876표준
고추냉이 과산화효소(HRP)시그마-올드리치P8125표준
HPLC 물시그마-올드리치270733-4X4L
HTX 분무기HTX 테크놀로지스M5
염산피셔 사이언티픽  A144-500
아이소아밀라제메가자임이-이사미
크나우어 펌프크나우어P 4.1 S
저프로파일 블레이드전자현미경 과학63059-01
M1 마운팅 미디어에프레디아1310
질량분석기브루커 달토닉스timsTOF fleX
마이크로퓨지 튜브 (1.5mL)알칼리 사이언티픽CN3016
바늘BD305109
중성 완충 포르말린 NBF밀리포어 시그마HT501128-4L
질소 가스에어가스NIUHP300
PBS피셔 사이언티픽  SH30256. FS
PCR 튜브메드서플라이 파트너62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA 불독 소개NZPULT10LY
SCiLS 연구소브루커 달토닉스1889000
셰이커써모 사이언티픽88882007
슬라이드  그리고 nbsp;전자현미경 과학71873-02
슬라이드 메일러RPI 제품212620A
소니케이터 (바이오럽터 피코)디아게노드B01080010
멸균 겸자DR 인스트루먼츠S08098
멸균 메스WPIWPI-500240
스테릴레스 가위파인 사이언스 툴즈14084-08
주사기  그리고 nbsp;그레인저19G342
주사기 펌프뉴 에라NE-300
테이프피셔 사이언티픽  15-901-R
얇은 붓아니네주스#00
트리플루오로아세트산시그마-올드리치T6508-1L
튠 믹스, ESI 저농도애질런트G1969-85000
웨이트 보트시그마-올드리치HS120882
자일렌시그마-올드리치534056
&알파-시아노-4-하이드록시시나믹산 (CHCA)케이맨 케미컬 컴퍼니15254

참고문헌

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