방법 논문

자폐증과 관련된 손상된 신경 흥분성을 조사하기 위한 동적 클램프 방법

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DOI:

10.3791/69155

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2025년 10월 17일

 , 
1Department of Biology, Miami University

이 논문에서

요약

동적 클램프 전기생리학은 신경 발화 결함과 이온 채널 기능 장애 사이의 인과 관계를 확립할 수 있습니다. 우리는 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런의 동적 클램프 방법 및 프로토콜을 설명하고 유용한 리소스와 기술적 고려 사항을 언급합니다. 대표적인 연구에서 우리는 반복적인 발화를 구출하기 위해 Tsc1-/- Purkinje 뉴런에 모델링된 나트륨 전도도를 추가합니다.

초록

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 광범위한 유전적, 환경적 요인으로 인해 발생합니다. 수많은 ASD 관련 돌연변이가 시냅스 발달이나 가소성을 방해하는 반면, 점점 더 많은 돌연변이가 전압 개폐 이온 채널의 발현과 기능을 변경하여 신경 고유 흥분성의 결함을 초래하는 것으로 나타났습니다. 전체 세포 전압 클램프 기록은 ASD 관련 돌연변이가 이온 채널 기능에 미치는 영향을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 실험은 변경된 이온 전도도가 신경 활동 전위 발화에 어떤 영향을 미치는지 직접 평가하지 못합니다. 동적 클램프 전기생리학은 사용자가 정의한 이온 컨덕턴스를 살아있는 뉴런에 실시간으로 주입할 수 있도록 하여 이러한 격차를 해소합니다. 이를 통해 이온 채널 특성의 변화가 주어진 세포 유형의 전기적 활성에 어떤 영향을 미치는지에 대한 인과 테스트를 수행할 수 있습니다. 이 방법 기사에서는 급성하게 준비된 소뇌 절편에서 생리학적 조건에서 기록된 성인 마우스 푸르킨제 뉴런에서 동적 클램프 전기생리학을 구현하는 방법을 설명합니다. 푸르킨제 뉴런은 반복적인 고주파(20-100Hz) 활동 전위를 발화하는 본질적인 능력을 가지고 있고 ASD 관련 소뇌 회로 기능 장애와 일관되게 관련되어 있기 때문에 이 작업에 특히 관련된 모델입니다. 우리는 기능 상실 돌연변이가 ASD의 가장 흔한 단일 유전자 원인 중 하나인 유전자인 Tsc1에 초점을 맞춥니다. 마우스 푸르킨제 뉴런에서 Tsc1 결실은 또한 감소된 전압 개폐 나트륨(Nav) 채널 발현과 관련이 있습니다. 우리는 마르코프 운동 상태 모델을 활용하여 푸르킨제 뉴런 Nav 컨덕턴스 특성을 시뮬레이션 및 재현하고 동적 클램프를 사용하여 Nav 컨덕턴스의 변화가 온전한 소뇌 푸르킨제 뉴런의 고유 발화에 어떤 영향을 미치는지 직접 평가합니다. 우리는 이온 컨덕턴스 모델을 수정하고 조정하기 위한 지침과 리소스를 제공합니다. 이온 컨덕턴스 모델링, 동적 클램프 및 기존 패치 클램프 기술을 통합함으로써 이 접근 방식은 유전적 교란을 ASD 관련 뉴런의 생리학적 결과와 연결하기 위한 강력하고 유연한 프레임워크를 제공합니다.

서론

자폐 스펙트럼 장애(ASD)의 분자 및 세포 동인에 대한 이전 조사에서는 종종 시냅스 기능 장애를 장애의 병태생리학의 핵심으로 강조했습니다1,2. 수많은 연구에서 ASD 모델에서 흥분성 시냅스 밀도증가 2,3,4, 시냅스 가지치기 장애 5 및 시냅스 후 밀도 단백질 6,7의 변경이 입증되었습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 내인성 신경 흥분성의 변화도 ASD 병리의 동인입니다. 예를 들어, ASD 형질전환 마우스 모델 및 환자 유래 세포주는 소뇌 푸르킨제 8,9,10 및 피질 피라미드 뉴런11에서 손상된 활동 전위 생성뿐만 아니라 피질 피라미드 뉴런의 하위 클래스에서 약화된 수지상 흥분성 및 시냅스 통합을 밝혔습니다12. 전전압 개폐 나트륨(Nav) 채널 Nav1.2 기공 형성 α 서브유닛을 암호화하는 SCN2A의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 채널병증은 현재 ASD13의 잘 알려진 단일 유전자 원인이며 다양한 종류의 중추 뉴런의 내재적 흥분성에 결함을 유발하는 것으로 나타났습니다 14,15,16,17. 이러한 유형의 조사가 진행됨에 따라 이온 컨덕턴스의 병원성 변화와 이러한 변화가 뉴런 및 회로 기능에 미치는 영향 사이의 인과 관계를 확립하는 것이 중요합니다. 동적 클램프 전기생리학은 이 작업에 효과적인 접근 방식을 제공합니다. Sharp et al. (1992 및 1993)18,19, Robinson 및 Kawai (1993)20과 함께 전압 의존적 특성이 있거나 없는 시뮬레이션된 비선형 이온 컨덕턴스가 살아있는 뉴런에 주입/추가되는 동적 클램프 방법을 처음에 설명하여 연구자가 전압 개폐 이온 컨덕턴스의 특성 또는 추정 변화가 뉴런 발화에 미치는 영향을 실시간으로 평가할 수 있도록 합니다21, 22.

동적 클램프 실험의 구현은 RTXI23, QuB 24,25 및 StdpC26과 같은 무료로 사용 가능한 여러 소프트웨어 시스템에 의해 촉진되었습니다. 그러나 최근의 발전으로 단일 컴퓨터와 단일 소프트웨어 패키지 내에서 모델 컨캐턴스를 개발, 수정 및 적용할 수 있는 상용 플러그 앤 플레이 시스템을 통해 동적 클램프 구현이 단순화되었습니다. 여기에서, 우리는 Sutter dPatch 시스템27을 사용하여 동적 클램프를 수행하는 프로토콜을 제공하고 ASD28에 대한 널리 퍼진 돌연변이 유전자좌인 결절성 경화증 1(Tsc1)9의 표적 결실이 전압 개폐 나트륨 컨덕턴스의 발현 변화의 결과로 소뇌 푸르킨제 뉴런의 본질적인 발화에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 샘플 조사를 제공합니다8.

프로토콜

모든 동물 실험은 마이애미 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침(프로토콜 #1044)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험은 수컷 및 암컷 야생형 C57BL/6J 마우스와 C57BL/6J 균주 배경을 가진 형질전환 계통을 활용했습니다. 전기생리학적 실험을 위해 동물은 6-7주 동안 생령되었습니다. 모든 기록은 소뇌 진방의 소엽 5, 6 또는 7에 있는 푸르킨제 뉴런에서 가져왔습니다.

1. 푸르킨제 뉴런 패치 클램프 실험을 위한 설정 및 조직 준비

  1. pH 7.4(~300mOsM/L)에서 125mM NaCl, 2.5mM KCl, 1.25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, 2mM CaCl2, 1 mM MgCl2 및 25 mM 포도당을 포함하는 1 L의 인공 뇌척수액(ACSF)을 준비합니다. 또한 240 mM 자당, 2.5 mM KCl, 1.25 mMNaH2PO4, 0.5 mM CaCl2 및 7 mM MgCl2를 포함하는 250 mL의 '절단 용액'을 준비합니다. ACSF 및 카보겐(95% O2/ 5% CO2) 가스로 용액을 사용 전 최소 20분 동안 그리고 모든 실험 내내 지속적으로 살포합니다.
  2. 나중에 사용할 수 있도록 ACSF로 채워진 뇌 절편 보관 챔버를 준비합니다. 소뇌 절편(슬라이스 챔버에 추가됨)이 ACSF에 노출된 소뇌 절편의 양면과 함께 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 작업을 수행하면 물에 잠긴 단단히 늘어난 나일론 메쉬 위에 물에 잠긴 슬라이스를 놓습니다.
  3. 수술 스테이션을 준비합니다. 마취된 동물을 고정하는 데 사용할 테이프 4개를 준비합니다. 얼음을 채운 양동이나 얼음 팬에 페트리 접시의 아래쪽 절반을 벽이 아래를 향하고 페트리 접시 바닥이 위를 향하도록 얼음에 넣습니다. 페트리 접시 바닥에 여과지(≥ 3cm2)를 놓고 2-3mL의 절단 용액으로 포화시킵니다.
    참고: 설명된 실험을 위해 압축 비브라톰을 사용하여 350 μM 시상 주변 소뇌 슬라이스를 슬라이스합니다. 압축기를 사용하면 슬라이싱용 조직이 주변의 얇은 금속 튜브를 통과하는 플라스틱 표본 튜브에 접착됩니다. 슬라이싱하는 동안 시편 튜브는 고정된 상태로 유지되는 금속 튜브를 통해 밀려납니다. 조직을 표본 튜브에 접착한 후 조직을 따뜻한 2% 아가로스에 매립합니다. 압축기의 칼날은 진동기의 팔에 부착된 고정 홀더에 접착됩니다. 다른 유형의 진동 분토는 따뜻한 아가로스에 조직을 포획할 필요가 없지만 설명된 실험에서도 유사하게 잘 작동해야 합니다.
  4. 또한 얼음 속에 외쪽 면도날과 절단액으로 채워진 작은(10mL) 비커를 놓습니다. 따뜻하게 된 아가로스를 표본 튜브에 첨가한 후 빠르게 냉각하는 데 사용되는 냉각 블록과 얼음 위에서 식힌 절단 용액으로 채워진 30mL 주사기를 보관하십시오. 30mL 주사기가 Luer lock 암 베이스가 있는 바늘(≥ 26G)에 연결된(종단 끝에서) 정맥(IV) 튜브의 30-60cm 섹션(Luer lock 수 테이퍼를 통해)에 연결되어 있는지 확인합니다.
  5. 남은 절단 용액을 -80°C 냉동고에 넣습니다. 이 절단 용액이 슬러시 얼음 농도가 되면(20-25분) -80°C 냉동고에서 꺼내 얼음 위에 놓습니다.
  6. 5-8주 된 성인 마우스에게 1mL/kg 동물 체중의 케타민(10mg/mL)/자일라진(0.25mg/mL) 칵테일을 복강내 주사하여 마취합니다.
  7. 25mL의 절단 용액에 0.5g의 아가로스를 녹여 2% 아가로스 용액을 만듭니다. 동물이 마취된 후(발가락 꼬집음에 반응하지 않음) 2% 아가로스 용액을 가열하고(전자레인지에서 ~30초) 따뜻한 아가로스 용액을 40°C 수조로 옮깁니다.
    참고: 1.8-1.18로 번호가 매겨진 단계는 따뜻하게 된 아가로스가 응고되기 전에 긴급하게 완료해야 합니다.
  8. 동물의 팔다리를 테이프로 수술대에 고정합니다. 가위를 사용하여 동물의 흉강을 열어 폐와 복부 장기가 절단되지 않도록 합니다. 잠금 겸자나 지혈제를 사용하여 흉곽을 열어 심장을 노출시킵니다. 이를 위해 흉골에 집게를 잠그고 동물의 앞쪽을 향해 조심스럽게 놓습니다(도구 손가락 구멍이 동물의 머리 옆에 있음).
  9. 30mL 주사기에 연결된 바늘을 좌심실에 삽입하고 겸자를 사용하여 바늘 주변의 조직을 압축하고 바늘을 좌심실실 내에 고정합니다. 수술용 가위를 사용하여 우심방에 작은 절개를 하고 25mL의 냉각된 절단 용액으로 동물을 빠르게 관류합니다.
    알림: 관류액이 좌심실로 들어가 우심방으로 나가 동물의 순환계에서 혈액을 제거하는지 확인하십시오.
  10. 관류가 완료되면 재빨리 동물의 목을 베고 머리의 정중선을 따라 머리 정중선을 따라 머리 돌개를 향해 절단하여 두개골 표면을 노출시킵니다.
  11. 가위를 사용하여 두개골 뒤쪽에서 결합 조직을 제거하고 과도한 척수 조직을 제거하여 척수가 대공에서 돌출되지 않도록 합니다.
  12. 가위 날 하나를 대공에 넣고 두개골의 둘레를 따라 양쪽 측두엽 측면에서 bregma를 향해 자르고 bregma에 약간의 두개골 조직을 남겨둡니다.
  13. 가위날 또는 가는 집게의 절반을 대구멍에 넣고 위쪽으로 들어 올려 두개골을 뇌에서 분리합니다. 두개골을 들어 올리는 동안 가위날이나 집게를 뇌에 밀어 넣지 않도록 주의하십시오.
  14. 주걱 수술 도구를 사용하여 뇌 아래(전방에서)를 퍼내고 뇌가 옮겨질 때 소뇌를 보호하기 위해 주의하면서 냉장 절단 용액이 들어 있는 10mL 비커에 뇌를 조심스럽게 제거합니다. 이 단계에서 깨끗한 장갑으로 갈아입으십시오.
  15. 주걱 도구를 사용하여 비커에서 뇌를 조심스럽게 제거하고 여과지(페트리 접시)에 놓습니다. 외날 칼날을 사용하여 정중선에서 몇 밀리미터 떨어진 시상 주위 축을 따라 절단합니다. 더 작은 시상 주위 절편 조직을 버립니다. 전뇌 중간(소뇌 앞쪽)에 두 번째 관상 절단을 합니다. 소뇌 앞쪽에 있는 관상으로 절단된 조직을 버립니다.
  16. 전뇌의 앞쪽 부분 아래로 단쪽 가장자리 칼날을 밀어 넣고 들어 올려 나머지 조직을 회전시켜 초기 시상 주위 절단의 측면이 아래를 향하고(여과지에서) 절단되지 않은 소뇌 반구가 위를 향하도록 합니다.
  17. 시편 튜브를 얼음 속에 똑바로 세우고 튜브 표면에 초강력 접착제(시아노아크릴레이트 접착제)를 얇게 추가합니다. 90° 구부러진 주걱 도구를 사용하여 조직 방향을 유지하면서 여과지에서 검체 튜브 표면으로 뇌 조직을 조심스럽게 옮깁니다. 절단되지 않은 소뇌 반구가 계속 위를 향하도록 합니다. 조직이 표본 튜브에 놓이거나 접착되면 금속 튜브를 위쪽으로 밀어 뇌 조직을 둘러싸도록 합니다.
  18. 전동식 10mL 피펫을 사용하여 검체 튜브에 따뜻한 아가로스(뇌 조직 포매)를 채웁니다. ~30초 동안 금속 튜브 주위에 냉각 블록을 고정하여 조직(현재 따뜻한 아가로스에 포매됨)을 빠르게 냉각합니다.
  19. 시편 튜브를 진동 조기 욕조 챔버에 넣고 슬러시 절단 용액으로 욕조를 채웁니다. 뇌 조직 절단 중에 절단 용액을 지속적으로 살포하되 소뇌 절편을 기포에 직접 노출시키지 마십시오.
  20. 300-350μm 시상 주위 슬라이스를 자르고 각 슬라이스를 살포된 실온 ACSF로 채워진 슬라이스 홀딩 챔버로 즉시 옮깁니다. 모든 슬라이스가 슬라이스 챔버에 있으면 슬라이스 챔버를 33°C 수조에서 25분 동안 배양합니다.
  21. 수조에서 25분 후, 슬라이스 챔버를 (다시) 실온에 놓고 소뇌 슬라이스에서 패치 기록을 시도하기 전에 최소 35분 더 기다립니다.

2. 동적 클램프에서 마르코프 기반 컨덕턴스 모델 구성

참고: 동적 클램프는 모델링된 컨덕턴스를 살아있는 세포에 실시간으로 적용하는 것입니다. 멤브레인 전압은 날카로운 전극 또는 패치 전극을 통해 기록/샘플링되고 디지털화된 신호는 적용되는 이온 컨덕턴스 모델을 사용하여 샘플링된 전압에 대한 적절한 동적 클램프 전류 주입을 계산하는 동적 클램프 소프트웨어로 전송됩니다. 계산된 동적 클램프 전류 주입 신호는 증폭기와 헤드 스테이지로 전송되어 전극을 통해 셀에 주입됩니다. 멤브레인 전압의 빠른 과도 변화를 유도하는 활동 전위를 발사하는 셀에 모델링된 컨덕턴스를 적절하게 추가하려면 전압 샘플링 주파수가 충분히 높아야 하며 전압 샘플과 동적 클램프 전류 주입 사이의 지연(대기 시간이라고도 함)은 최소화되고 불변해야 합니다29.

  1. 동적 클램프 실험 전에 동적 클램프 실험에 사용할 이온 전도도에 대한 수학적 모델을 개발하거나 얻으십시오. 이러한 모델은 마르코프 운동 상태 모델, 호지킨-헉슬리(HH) 모델 또는 수동(선형) 컨덕턴스의 형태일 수 있습니다. 선택한 컨덕턴스 모델이 의도한 이온 컨덕턴스의 동역학 및 전압 의존적 특성을 정확하게 재현하는지 확인하십시오.
    참고: 실험자는 전압 클램프 시뮬레이션 연구에서 모델링된 컨도턴스(인실리코)를 테스트하여 동적 클램프 실험에 사용하기 전에 모델링된 이온 전도도의 특성을 확인할 수 있습니다. 마르코프 운동 상태 및 HH 컨덕턴스 모델의 중요한 특성과 고려 사항은 토론 섹션에 설명되어 있습니다. 아래 단계에서는 동적 클램프 소프트웨어에서 마르코프 컨덕턴스 모델을 설정하는 방법을 설명합니다.
  2. 동적 클램프 실험에 사용할 컨덕턴스 모델에 대한 마르코프 상태 전이 다이어그램을 생성하거나 얻습니다. 이 다이어그램을 사용하여 동적 클램프 소프트웨어(아래 설명) 내에서 마르코프 컨덕턴스 모델을 정확하게 조립합니다.
    참고: SutterPatch는 dPatch 증폭기 데이터 수집 소프트웨어입니다. 동적 클램프 실험은 소프트웨어 내에서 수행할 수 있으며, 이를 통해 전류 클램프 프로토콜 동안 전류 주입을 통해 모델링된 컨덕턴스를 조립하고 적용할 수 있습니다. 마우스 푸르킨제 뉴런의 Nav 전류 측정을 기반으로 모델링된 전압 개폐 나트륨 컨덕턴스에 대한 마르코프 상태 전이 다이어그램이 그림 1A에 나와 있습니다. 이 모델은 Ransdell et al., 202230 에 의해 개발되었으며 푸르킨제 뉴런 발화에서 지속적이고 부활하는 나트륨 전류 성분의 역할을 조사하는 데 사용되었습니다31. 게이팅 상태(C, IC, IF, IS 및 O)는 변수(예: S0, S3, S1, S4)로 표시되는 전이 속도 상수로 상호 연결됩니다. 이 모델은 대표적인 동적 클램프 실험에 사용되며 GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa 에서 다운로드할 수 있습니다.
  3. 데이터 수집 소프트웨어에서 SutterPatch 탭> Dynamic Clamp Editor에서 또는 Dashboard 창에서 해당 아이콘을 클릭하여 Dynamic Clamp Editor 창을 엽니다. 동적 클램프 편집기 창의 일부는 그림 1B에 나와 있습니다.
    참고: 동적 클램프 편집기 창에는 전류 클램프 기록 프로토콜 중에 모델링된 컨ダクト턴스를 적용하는 데 필요한 모든 설정이 포함되어 있습니다. 컨덕턴스 풀 인터페이스(그림 1B, 왼쪽 상단)를 통해 사용자는 모델 컨ダクト턴스 그룹을 구성하고 동시에 로드할 수 있습니다.
  4. 컨덕턴스 풀 인터페이스(그림 1B, 왼쪽 상단)에서 새로 만들기를 클릭하고 원하는 대로 이름을 지정하여 풀을 생성합니다. 컨덕턴스 풀을 선택하면 헤드스테이지 선택기 인터페이스(그림 1B, 왼쪽 하단)의 창 오른쪽에서 각 컨덕턴스 풀에 대한 모델 유형(모델-마르코프, 호지킨-헉슬리, 가변 컨덕턴스 등)과 루틴/프로토콜(활성 모드)과 같이 모델 컨덕턴스를 적용해야 하는 시기를 선택합니다. 헤드스테이지 선택기 인터페이스는 또한 동적 클램프 업데이트 속도(kHz) 및 전압 신호 소스(오른쪽 그림 1B 참조)를 선택할 수 있습니다. 전압 신호 소스의 경우 전압 신호를 기록하는 헤드스테이지를 선택합니다.
  5. 헤드스테이지 선택 패널의 예에 대해 예: 내비게이션 컨덕턴스 마르코프 모델(그림 1A)에서 모델에 대해 마르코프 모델, 활성 모드에 대해 스윕 중, 업데이트 속도에 대해 200kHz, 전압 신호 소스에 대해 헤드스테지 1을 선택합니다. AuxOUT1에 대한 적용 및 명령 신호를 확인하여 전압 신호에 대한 응답으로 모델 계산을 시작하고 각각 모든 전류 클램프 프로토콜에 동적 클램프 전류 주입을 추가합니다(그림 1B, 왼쪽 하단).
  6. 기본 Dynamic Clamp Editor 패널 아래에는 상태 매트릭스가 있습니다(그림 1C, 하단). 먼저 Headstage 선택기 인터페이스에서 Edit Model Parameters를 클릭하여 상태 행렬을 편집합니다(그림 1B, 왼쪽 하단). Dynamic Clamp Markov Model Parameters라는 새 창이 편집기와 함께 나타납니다. 이 패널에서 마르코프 모델 컨ダクト턴스를 나타내는 상태 행렬 방정식을 입력합니다.
  7. 채널 설정 패널(그림 1B, 오른쪽 상단)에서 적용해야 하는 저장된 컨덕턴스 모델을 선택합니다(동적 클램프에서). 또는 빈 채널을 선택하고 새 모델 컨덕턴스 생성을 시작합니다. 이 패널의 오른쪽에 V 반전(모델링된 컨덕턴스 이온 반전 전위)을 입력합니다. 나트륨 컨덕턴스를 활용하는 연구의 경우 ACSF 및 패치 전극 내부 용액을 기반으로 나트륨의 반전 전위를 반영하기 위해 55.0mV를 입력합니다.
  8. 또한 채널 설정 패널에서 선택한 컨다턴스의 운동 상태 수를 제공합니다( 그림 1B, 오른쪽 상단의 빨간색 상자 참조). 여기에 모델링된 컨덕턴스의 9가지 운동 상태를 반영하기 위해 9를 입력합니다( 그림 1A 참조).
  9. 채널 설정 패널 아래에는 상태 방정식 패널이 있습니다. 상태 전이 속도 상수 방정식을 게이팅 상태 행렬에 적절하게 배치하여 마르코프 모델의 위상 배열을 반영합니다. 상태 방정식 패널에 방정식을 입력하고 "S0"에서 시작하는 ID를 제공합니다(그림 1B, 가운데).
    참고: 이러한 방정식이 입력되는 순서는 이러한 변수가 마르코프 모델의 토폴로지를 반영하기 위해 게이팅 상태 행렬 에 적절하게 채워지는 한 중요하지 않습니다.
  10. 게이팅 상태 행렬을 현재 정의된 속도 상수 변수로 채우려면 상태 방정식 패널의 오른쪽에 있는 상태 행렬 편집을 클릭합니다(그림 1B, 가운데). 각 운동 상태에는 0부터 시작하는 숫자가 부여됩니다. 예를 들어, 상태 X와 Y를 포함하는 2운동 상태 모델의 경우 이러한 상태를 "0" 및 "1"이라고 하며 두 개의 전이 속도 상수 a1 및 b1을 포함하며, 여기서 a1은 0에서 1로 전환되고 b1은 1에서 0으로 전환됩니다.
  11. 상태 행렬 편집기(그림 1B, 하단)를 사용하여 이러한 방정식을 적절하게 연결하려면 0부터 시작하는 번호가 매겨진 행과 열이 포함된 테이블에 속도 상수를 입력합니다(그림 1C의 예 참조).
    참고: 한 상태에서 다른 상태로의 이동은 이 테이블에서 "행에서 열로" 형식의 위치에 따라 결정됩니다. 예를 들어, 2.1단계의 2상태 모델 예에서 상태 0에서 상태 1로의 전환은 속도 상수 "a1"에 의존하며, 이 상수는 행 0, 열 1에 배치됩니다. 전환 속도 상수 "b1"은 상태 1에서 상태 0으로의 전환을 구동하므로 속도 상수는 행 1, 열 0에 배치되어야 합니다. 그림 1C에서 예제 게이팅 상태 행렬에는 그림 1A에 표시된 Nav 컨덕턴스 모델의 토폴로지를 반영하는 속도 상수가 있습니다. 예를 들어, "S0"은 IC1에서 IC2 운동 상태로의 전환을 정의하는 속도 상수입니다. 따라서 "S0"은 게이팅 상태 매트릭스 의 행 0, 열 1에 배치됩니다(그림 1C). 각 속도 상수의 변수를 정의하는 전이 속도 상수 방정식은 채워진 상태 행렬 을 채웁니다(그림 1C, 하단).
  12. 속도 상수 방정식이 상태 행렬 편집기 패널을 통해 연결되면 연결(해당 행과 열)이 방정식 옆의 연결 패널에 채워집니다(그림 1B, 오른쪽 가운데). 다음 단계에서 중요한 그림 1C의 행과 7열(상단, 빨간색 상자)에 추가된 대표적인 나트륨 컨도턴스 모델(그림 1A)의 개방/전도 상태를 기록해 둡니다.
  13. 그림 1B(오른쪽 아래)에서 컨덕턴스 방정식(nS) 패널을 사용하여 동적 클램프 중에 적용될 모델 컨덕턴스의 진폭을 정의합니다. 마르코프 모델에서 개방/전도 상태를 선택하고 컨덕턴스 값을 제공합니다(그림 1B, 하단, 빨간색 상자).
  14. 이 실험의 경우 "G7" 상자에 "400nS"를 입력하면 마우스 푸르킨제 뉴런에 대한 전압 클램프 연구에서 측정된 피크 Nav 전류와 유사한 피크 Nav 전류 값이 추가됩니다.
  15. 위의 단계가 완료되면 로드를 클릭하여 전류 클램프 루틴이 시작되면 동적 클램프 적용을 위해 모델을 준비합니다.
  16. 유사한 프로세스를 사용하여 HH 모델을 정렬합니다. 그러나 방정식을 추가하여 독립 게이팅 상태( 게이트 방정식에서)와 G 최대값 아래의 컨덕턴스를 정의합니다.
  17. 동적 클램프 컨덕턴스를 적용하려면 먼저 루틴 편집기를 사용하여 전류 클램프 루틴을 생성합니다(루틴 편집기> SutterPatch 탭 클릭). 전류 클램프 루틴을 만들려면 부모 출력 채널(이 예제에서는 StimOut1)을 선택합니다. 그러면 사용자가 루틴 중에 현재 명령 출력을 정의할 수 있는 패널이 열립니다. 루틴 편집기에서 레코딩 모드가 CC_Mode로 설정되어 있는지 확인합니다.
    참고: 대표적인 실험에서 이 프로토콜은 자발적으로 발사되는 셀과 함께 작동하기 때문에 전류 주입이 없는 갭 없는 전류 클램프 루틴/프로토콜이 사용됩니다.
  18. 루틴 편집기 입력 채널(그림 1D, 오른쪽 상단)에서 실험 중에 기록된 스코프 창을 채우는 입력 신호를 정의합니다. 이러한 입력에는 전압 신호가 포함되어야 하며 루틴의 명령 전류 주입과 각각 Current1 및 AuxIN1이라고 하는 동적 클램프 전류 주입도 포함되어야 합니다(그림 1D, 왼쪽 하단).
  19. 포지티브 및/또는 네거티브 전류 주입 명령을 포함하는 전류 클램프 루틴의 경우, 명령 전류 주입 신호는 동적 클램프 전류 신호와 자동으로 결합됩니다. 격리된 동적 클램프 전류 주입의 기록이 있도록 명령 전류 신호를 빼는 가상 범위 창을 만듭니다. 새 가상 범위 창을 만들려면 먼저 Virtual1 확인란을 선택하여 추가 입력 채널을 선택합니다.
  20. 루틴 편집기의 수학 유형에서 방정식을 선택하고 소스 채널 아래에서 전류 클램프 루틴의 명령 입력 신호(이 예에서는 Current1)를 선택합니다. 열린 필드에 방정식을 입력하여 동적 클램프 전류 주입 신호에서 전류 클램프 명령 신호를 뺍니다.
    참고: 이 예제 실험에서는 방정식 t[3]-t[2]를 사용하여 수행됩니다. 이제 Virtual1 스코프 창에 동적 클램프 전류 주입(전류 명령 신호에서 분리됨)이 표시됩니다. 사용자는 레이블 아래에서 두 번 클릭하여 입력 또는 출력 채널의 레이블을 사용자 지정할 수 있습니다.

3. 시상 주위 소뇌 절편에서 마우스 Purkinje 뉴런으로부터 전류 클램프 기록 획득

  1. 전기생리학 장비에 생리학적 온도(34-36°C)에 가까운 ACSF로 관류된 (중력) 조직 슬라이스 챔버를 장착합니다. 시상주위 소뇌 슬라이스를 슬라이스 챔버에 조심스럽게 넣고 슬라이스 하프를 사용하여 소뇌 슬라이스를 물에 잠기고 고정된 위치에 유지합니다. 염화물 접지 전극과 온도 프로브도 소뇌 슬라이스 챔버 내에 잠겨 있고 안정적인지 확인하십시오.
  2. 40x 침지 대물 렌즈를 사용하여 Purkinje 뉴런층을 찾습니다. 푸르킨제 뉴런은 크고 눈물방울 모양입니다. 건강한 푸르킨제 세포의 원형질막은 일반적으로 매끄럽게 보이며 핵은 보이지 않습니다.
  3. 건강한 푸르킨제 뉴런이 식별되고 패치 클램프 기록의 대상이 되면 현미경 대물 렌즈를 위쪽으로 조정합니다. 전극 홀더와 헤드스테이지에 부착된 유리 미세 전극의 끝을 배치하고 초점을 맞춥니다. 3축 로봇 마이크로 매니퓰레이터로 헤드스테이지/미세 전극을 제어합니다.
    참고: 이러한 실험의 경우 미세 전극의 저항 값이 2-4MΩ이고 적절한 전류 클램프 내부 용액으로 채워져 있는지 확인하십시오. 대표적인 실험에 사용된 내부 용액에는 144mM K-글루코네이트, 0.2mM EGTA, 3mM MgCl2, 10mM HEPES, 8mM NaCl, 4mM Mg-ATP 및 0.5mM Na-GTP가 포함되어 있습니다.
  4. 표적 푸르킨제 뉴런에 접근하기 전에 전극 홀더 압력 포트에 2-3mL의 양압을 추가합니다.
  5. 증폭기 제어판에서 VC 모드로 전환하고 전극 보상 및 전극 전압 오프셋 기능을 적용합니다. 이 예에서는 전극 보상 및 전압 오프셋 옵션 옆에 있는 자동 을 클릭하여 이 작업을 수행합니다.
  6. 연속 멤브레인 씰 테스트 프로토콜을 시작합니다( 멤브레인 테스트 클릭). 멤브레인 테스트 파라미터를 5mV 또는 10mV 단계로 5ms 스윕(또는 그 근처)으로 설정합니다. 유지 전위(V-유지)를 0mV로 설정합니다.
  7. 미세 전극을 표적 셀 쪽으로 이동하고 초점면을 조정하여 전극 끝 또는 약간 아래에 초점을 유지합니다. 표적 세포의 원형질막 약간 위에 전극을 배치합니다. 마이크로 매니퓰레이터와 전극 팁의 양압을 사용하여 표적 세포 체막에서 세포외 파편을 밀어내어 표면막을 '청소'합니다.
  8. 표적 세포에 세포외 파편이 제거된 후, 축삭이 세포체에서 확장되는 푸르킨제 뉴런 체막의 넓은 끝에 있는 막 표면 근처에 전극을 천천히 배치합니다. 전극 팁이 멤브레인으로 내려가면 멤브레인 표면에 보조개가 보일 수 있습니다(전극의 양압으로 인해). 이때 양압을 풀고 입 흡입을 이용하여 소량의 음압을 가합니다.
  9. 앰프 제어판에서 V-유지 전위를 -80mV(0mV에서)로 변경합니다. 멤브레인 씰 테스트를 모니터링하면 피펫 저항이 1GΩ≥ 도달하면 음압을 높이고 멤브레인 씰 테스트 패널의 Zap 기능을 클릭하여 멤브레인을 파열하고 전체 셀 패치 클램프 구성을 달성합니다.
  10. 증폭기 제어판을 통해 전류 클램프 모드로 전환하기 전에 간단한 전압 클램프 프로토콜을 사용하여 멤브레인 수동 특성(정전 용량 및 입력 저항 값)을 측정합니다.
  11. 전류 클램프 모드로 전환한 후 브리지 밸런스 보상을 적용하여 70%≥합니다.
  12. 패치 전극으로 동적 클램프 컨도턴스를 적용하기 전에 접합 전위 오류(전극 내부 및 ACSF 솔루션의 구성을 기반으로 계산됨)를 수정합니다. 대표적인 실험의 해의 경우 17.5mV의 접합 전위 보정을 적용합니다. 동적 클램프 연구에서는 정확한 접합 전위 보정이 중요하므로 컨도턴스 모델에서 정확한 전압 신호를 사용하여 동적 클램프 전류 주입을 계산합니다.

4. 동적 클램프 컨덕턴스 적용

  1. 푸르킨제 뉴런은 반복적인 활동 전위를 자발적으로 발사하기 때문에 모델링된 이온 전도도를 추가(또는 빼기)하기 전에 발화 특성을 기록하여 세포 건강을 테스트하고 막 흥분성의 기본 특성을 측정합니다. 동적 클램프 설정 창에서 로드를 클릭하여 모델링된 컨덕턴스를 적용합니다. 이제 작은 DynC 레이블이 dPatch 컨트롤러에 CC를 오버레이하여 볼 수 있습니다(그림 1D, 빨간색 상자 참조).
  2. 동적 클램프가 켜지거나 로드된 후 전류 클램프 루틴/프로토콜이 활성화되는 동안 동적 클램프 컨덕턴스가 자동으로 적용됩니다. AuxIN1 선택한 입력 신호에 해당하는 스코프 창에서 동적 클램프 전류 주입을 봅니다.
    참고: 동적 클램프 매개 컨ダクト턴스를 적용하거나 적용하지 않는 자발적 발화의 교대 기록은 적용된 모델 컨ダ턴스가 흥분성에 미치는 영향을 결정하고 흥분성의 기준선 수준이 실험 전반에 걸쳐 안정적/일관성이 있는지 결정하는 데 중요합니다.

결과

제시된 실험에서 우리는 동적 클램프를 사용하여 모델링된 전압 개폐 나트륨(Nav) 전도도를 시상 주변 소뇌 절편 준비에서 급격하게 분리된 성인(6-7주령) 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런에 적용합니다. 이 연구는 야생형(대조군) 마우스와 형질전환 마우스를 대상으로 수행되며, Cre-loxP 재조합을 사용하여 소뇌 푸르킨제 뉴런에서 결절성 경화증 1(Tsc1)을 선택적으로 제거합니다. 결절성 경화증 복합체(TSC)는 TSC1 또는 TSC2의 기능 상실 돌연변이로 인해 발생하는 다기관 장애입니다 32,28,33. TSC가 있는 개인은 일반적으로 간질 장애, 인지 장애 및 자폐 스펙트럼 장애로 진단됩니다34,35. 여기서는 Tsc1mut/mut이라고 하는 푸르킨제 뉴런 특이적 Tsc1 결실이 있는 마우스는 운동 기능, 사회적 상호 작용 행동 및 발성의 장애뿐만 아니라 과장된 반복 행동을 포함하여 여러 ASD 관련 행동 표현형을 나타냅니다 9,36. Tsc1음소거/음소거 푸르킨제 뉴런은 또한 활동 전위 발화를 감쇠시키는 것으로 나타났으며(그림 2A,B), 이는 현저하게 감소된 Nav 전류 진폭(그림 2C) 및 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런의 축삭 초기 세그먼트에서 Nav 채널 발현과 관련이 있습니다8. Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런의 Nav 전류는 야생형 Purkinje 뉴런과 유사한 동역학 및 전압 의존적 특성을 갖습니다8. 이 형질전환 Tsc1mut/mut 마우스 모델에서 동적 클램프를 사용하여 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런에 Nav 컨ダクト턴스를 추가하면 반복적인 발화를 구출할 수 있는지 테스트했습니다. 우리는 계속해서 야생형 푸르킨제 뉴런에서 Nav 컨덕턴스를 빼면 Tsc1mut/mut 푸르킨제 뉴런에서 측정된 푸르킨제 뉴런 발화에서 유사한 감쇠를 유발하는지 테스트합니다(그림 2B). 기본적으로 표현된 Nav 컨덕턴스를 빼기 위해 동적 클램프를 사용하여 Nav 컨덕턴스를 적용했습니다. 그러나 컨덕턴스의 극성은 반전됩니다.

푸르킨제 뉴런 Nav 컨ダ도턴스를 시뮬레이션하는 데 사용되는 마르코프 운동 상태 모델(그림 1A)에는 9개의 운동 상태가 포함되어 있으며, 그 중 8개는 비전도성이며 폐쇄(C1, C2 및 C3), 비활성화-폐쇄(IC1 및 IC2), 빠른 비활성화(IF1 및 IF2) 및 느린 비활성화(IS)로 표시됩니다. 하나의 개방/전도(O) 운동 상태(30,31)가 있다. 레이블이 지정된 운동 상태 사이에 표시된 전이 속도 상수(그림 1A)는 각 운동 상태를 차지하는 시뮬레이션된 채널/컨덕턴스의 비율을 결정합니다. 멤브레인 전압은 각 모델의 속도 상수에 영향을 미칩니다. 시뮬레이션된 전압 클램프 실험에서 이 모델(인실리코)에 의해 생성된 시뮬레이션된 Nav 전류는 검은색으로 표시된 급격하게 분리된 Purkinje 뉴런에서 측정된 Nav 전류의 오른쪽에 빨간색으로 표시됩니다(그림 1A, 하단). 이러한 시뮬레이션된(빨간색) 및 푸르킨제 뉴런(검은색) 탐색 전류를 유발하는 전압 명령은 전류 트레이스 위에 검은색으로 표시됩니다. 전압 명령에서 초기 탈분극 단계(0mV까지)는 빠른 과도 내부 나트륨 전류를 생성하며, 이는 시뮬레이션된 트레이스에서 비전도성 폐쇄 상태에서 개방 운동 상태로 전환되는 채널을 반영하여 개방 상태 채널이 빠른 비활성화(IF1 및 IF2) 운동 상태로 축적되기 전에 짧은 내부 전류를 허용합니다. 이 탈분극 전압 단계는 짧고(5ms) 멤브레인 전위는 이후 -45mV의 중간 재분극 전압으로 단계적으로 올라가며, 여기서 전위는 80ms 동안 유지됩니다(그림 1A, 하단). 이 재분극 전압 단계 동안 부활 나트륨 전류(INaR)라고 하는 전류 성분인 내부 나트륨 전류가 다시 부활한다는 점은 주목할 만합니다. -45mV까지 80ms 단계 동안 INaR은 진폭에서 느리게(INaT에 비해) 감쇠를 나타내며 결국 지속 Nav 전류 성분(INaP)인 내부 전류의 정상 상태에 도달합니다. 멤브레인 재분극 중 모델링된 INaR(그림 1A, 하단, 빨간색)의 활성화는 빠르게 비활성화된(IF1 + IF2) 동역학 상태에서 개방/전도 상태로 회복되는 시뮬레이션된 채널을 반영합니다. 시간이 지남에 따라(-45mV에서 유지), 개방 상태를 차지하는 시뮬레이션된 채널의 일부는 INaR 붕괴로 반사되는 흡수 느린 비활성화(IS) 동역 상태로 축적되며, 이러한 채널의 일부는 정상 상태 INaP 전류 성분30,31로 반영되는 개방/전도 상태로 유지된다.

대표적인 실험/결과에서 Nav Markov 컨덕턴스 모델(그림 1A)을 급격하게 분리된 소뇌 절편의 성인 Purkinje 뉴런에 추가했습니다. 이 실험 설정에 대한 만화 묘사는 그림 3A에 나와 있습니다. 동적 클램프 전류 주입을 통해 모델링된 Nav 컨덕턴스를 적용하기 위해 아날로그-디지털(A/D) 및 디지털-아날로그(D/A) 변환이 완전히 통합된 dPatch 증폭기 시스템( 그림 3B 참조)을 사용했습니다. 이 시스템은 또한 통합 ARM 코어 프로세서(PC 외부)를 통해 신호 변환을 처리하며 전류 주입 전극(27)에 대한 입력 신호 및 피드백(출력 신호 전송)을 거의 즉각적으로 처리할 수 있는 통합 FPGA(필드 프로그래밍 가능 어레이) 회로를 갖추고 있습니다. 여기서의 실험에는 복잡한 마르코프 컨덕턴스 모델의 적용(동적 클램프)이 포함되었으며, 이를 최대 500kHz의 전류 주입 업데이트 속도로 적용할 수 있었습니다.

갭 없는 전류 클램프 기록 중에 시뮬레이션된 Nav 컨덕턴스(400nS)를 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런에 추가하면 세포의 반복 발화 빈도가 명확하게 증가했으며(그림 3C1, D1), Tsc1mut/mut에서 보고된 결핍의 전체 레퍼토리를 조사하지는 않았지만 이러한 세포에 Nav 전도도를 추가하는 것이 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런 흥분성의 결핍을 구하기에 충분할 수 있음을 나타냅니다 푸르킨제 뉴런 흥분성8. 그림 3C2(위)에 표시된 대표적인 흔적에서 분명한 바와 같이, 야생형 푸르킨제 뉴런은 고주파에서 반복적인 활동 전위를 발사하는 본질적인 능력을 가지고 있습니다. 동적 클램프를 사용하여 모델링된 Nav 컨덕턴스를 역(음수) 극성(-400nS)으로 적용하여 야생형 Purkinje 뉴런에서 모델링된 Nav 컨덕턴스를 뺍니다. 모델링된 Nav 컨덕턴스를 빼면 반복적인 발화가 즉각적이고 명백하게 감소했으며(그림 3C2, 하단), 이는 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런에서 측정된 감소된 Nav 전류가 이러한 세포에서 측정된 감쇠된 발화 특성에 기여한다는 가설과도 일치합니다8. 여러 Tsc1mut/mut 또는 야생형 푸르킨제 뉴런에 걸쳐 Nav 컨덕턴스를 각각 더하거나 뺍 이러한 동적 클램프 실험은 발화 빈도에 일관된 영향을 미쳤습니다. Nav 컨덕턴스를 유의하게 추가하면(P = 0.029) Tsc1mut/mut 푸르킨제 뉴런 발화 빈도가 증가했고(그림 3D1), 야생형 푸르킨제 뉴런에서 Nav 컨덕턴스를 빼면 발화 빈도가 유의하게 감소했습니다(P = 0.031) 발화 빈도(그림 3D2)(스튜던트의 대응 t-테스트).

figure-results-1
그림 1: 동적 클램프 소프트웨어에서 마르코프 모델 설정. (A) 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런에서 측정된 Nav 컨덕턴스 특성을 재현하는 모델에 대한 마르코프 상태 전이 다이어그램이 나와 있다(30). 이 모델에는 9개의 운동 상태가 포함되어 있습니다. 이 중 8개는 비전도성 상태입니다: 3개의 폐쇄(C), 2개의 비활성화-폐쇄(IC), 2개의 빠른 비활성화(IF) 및 1개의 느린 비활성화(IS). 이 모델에는 전도되는 하나의 개방(O) 운동 상태가 포함됩니다. 인접한 운동 상태 사이에서 시간이 지남에 따라 전환되는 연결/상태 점유는 S0-S15로 표시된 전이 속도 상수로 정의됩니다. 각 운동 상태에는 숫자 값(빨간색)도 할당되어 사용자가 게이팅 상태 행렬 (아래 설명된 패널 C에 표시됨)에서 마르코프 모델과 운동 상태 토폴로지를 정의할 수 있습니다. (B) 사용자가 SutterPatch 동적 클램프 편집기에서 작업하는 패널/그래픽 인터페이스가 제공됩니다. 이러한 동적 클램프 편집기 패널의 배열은 동적 클램프 소프트웨어 내에 나타나는 배열과 일치하지 않습니다. 또한 동적 클램프 편집기와 연관된 모든 패널이 표시되는 것은 아닙니다. (C) (상단 패널) 게이팅 상태 행렬의 예는 패널 A에 표시된 상태 전이 다이어그램의 토폴로지에 해당하는 변수가 입력된 상태로 표시됩니다 . 게이팅 상태 행렬의 빨간색 상자는 모델의 개방(O) 운동 상태에 해당하는 행과 열 7을 강조 표시합니다. 열 7 내에는 개방(O) 운동 상태로의 전이를 정의하는 모든 속도 상수가 나열되고, 행 7 내에는 개방(O) 운동 상태를 종료하는 전이를 정의하는 모든 속도 상수가 나열됩니다. 이 구성을 통해 게이팅 상태 행렬은 모델의 운동 상태 수, 속도 상수 변수 및 토폴로지(운동 상태 간의 상호 연결)를 설명합니다. (D)에는 현재 클램프 루틴 생성과 관련된 인터페이스와 함께 동적 클램프 컨덕턴스 모델 로드와 관련된 SutterPatch 패널/사용자 인터페이스가 나와 있습니다. 이러한 모델과의 사용자 상호 작용은 프로토콜 단계 2.17-2.20에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: Tsc1mut/mut 푸르킨제 뉴런은 야생형 대조군에 비해 막 흥분성이 약화되었습니다. (A) 야생형(위쪽, 검은색) 및 Tsc1mut/mut (아래쪽, 파란색) 푸르킨제 뉴런의 전체 세포 전류 클램프 기록은 Tsc1 돌연변이 세포에서 감쇠된 발화를 보여줍니다. (B) 야생형 대조군과 비교하여 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런에서 감소된 발화 빈도는 세포 전체에서 일관됩니다. Tsc1mut/mutPurkinje 뉴런 의 평균(±± SEM) 자발 발화 빈도는 야생형 세포에 비해 유의하게(P < 0.0001) 낮습니다(Welch의 짝을 이루지 않은 t-테스트; 대조군 N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) 성인 푸르킨제 뉴런에서 Nav 전류의 전압 클램프 측정은 평균(±± SEM) 고속 과도 Nav 전류(INaT) 피크가 야생형 대조군에 비해 Tsc1mut/mut 세포에서 유의하게 감소함을 보여줍니다. (P = 0.007, RM 양방향 ANOVA; 야생형 대조군: N = 6, n = 22, 흑색; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, 파란색 사각형). -35mV 탈분극 단계에 의해 유발되는 예 INaT 레코드는 패널 C 오른쪽에 삽입 패널로 표시됩니다 . 이전에 Brown et al.8에 발표된 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 동적 클램프를 사용하여 이온 전도도가 푸르킨제 뉴런 흥분성에 미치는 영향을 결정합니다. 동적 클램프에는 멤브레인 전압(기록 전극을 통해)을 샘플링하고 샘플링된 전압을 기반으로 모델 컨캐턴스의 전류 출력을 계산하는 작업이 포함됩니다. 그런 다음 계산된 전류는 전류 주입 전극을 사용하여 생물학적 세포에 적용됩니다. 패널 (A)는 이러한 실험적 배열을 묘사한다. 전압 샘플링이 충분한 주파수에서 수행되고 전압 샘플링과 계산된 전류 적용 사이에 최소한의 지연(대기 시간)이 있는 경우 이 기술을 사용하여 모델링된 컨덕턴스를 더하거나 빼는 것이 신경 발화 및 막 흥분성에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있습니다. (B) 대표적인 실험에서 SutterPatch 소프트웨어와 dPatch 증폭기 시스템을 사용하여 동적 클램프 녹음을 획득했습니다. dPatch는 외부 신호 프로세서와 완전히 통합된 디지타이저가 있는 패치 클램프 증폭기로, 동적 클램프 녹음에 매우 적합합니다(토론 참조). (C) 모델링된 Nav 컨덕턴스의 400nS를 더하거나 빼기 위해 동적 클램프를 사용하기 전과 후의 자발적인 푸르킨제 뉴런 발화의 대표적인 전류 클램프 기록( 그림 1A에 표시됨). C1(왼쪽)에서 기록은 발화가 감쇠된 Tsc1mut/mut Purkinje 뉴런에서 가져온 것입니다. 400nS Nav 컨덕턴스를 추가하면 이 셀의 발화 주파수가 확실히 증가합니다. 또는 C2에서 기록은 야생형 푸르킨제 뉴런에서 가져온 것입니다. 이 실험에서 모델링된 Nav 컨덕턴스는 반극성(-400nS)으로 적용되어 Nav 컨덕턴스가 뺄지고 반복 발사 주파수가 명확하게 감소합니다. 회색으로 표시된 동적 클램프 전류 주입 기록은 검은색으로 표시된 활동 전위 발화(전압) 기록 아래에 표시됩니다. (D) Tsc1mut/mut 푸르킨제 뉴런(D1, n = 3)에 Nav 컨덕턴스를 추가하거나 야생형 푸르킨제 뉴런(D2, n = 3)에서 Nav 컨덕턴스를 뺀 후 자발 발화 주파수의 변화로 제시된 이러한 동적 클램프 실험의 결과는 Tsc1mut/mut (P = 0.029) 및 야생형(P = 0.031) 셀(쌍 스튜던트 t-테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

소뇌 회로는 고유 감각 및 운동 제어에서 기능하지만37,38 사회적 상호 작용 및 감정 처리와 같은 복잡한 행동에도 중요합니다 39,40,41. 소뇌 구조 및 기능의 병리학은 종종 ASD 42,43,44,45,46과 관련이 있습니다. 소뇌 회로의 단순한 구조47과 ASD 병리학에서 소뇌의 명확한 역할은 ASD 행동 결함의 분자 및 세포 동인과 잠재적인 치료법을 조사하는 데 매력적인 뇌 영역입니다. 동적 클램프 전기생리학은 이러한 조사를 위한 중요한 도구를 제공하여 연구자가 이온 채널 특성/이온 전도도의 ASD 관련 변화와 소뇌 뉴런의 발화 사이의 인과 관계를 직접 테스트할 수 있도록 합니다. 동적 클램프 방법은 신경 흥분성의 ASD 관련 변화를 조사하는 데 특히 적합하지만, 이 기술은 흥분성 막이 있는 세포에 영향을 미치는 다양한 병리학적 메커니즘을 조사하는 것과 관련이 있습니다. 또한 동적 클램프는 뉴런과 근육 세포가 적절한 활동 전위 발화를 조절하고 유지하는 복잡한 과정을 해부하는 데 탁월한 도구로 남아 있습니다.

동적 클램프 실험을 정확하게 실행하려면 기술 매개변수를 신중하게 제어해야 합니다. 구체적으로, 실험자는 종종 지터29라고 하는 전압 샘플링과 전류 주입 사이의 지연의 잠재적 변동성의 결과와 전극 수동 특성, 공간 클램프 제한 및 조사 중인 실험 준비의 생리학적 충실도를 알고 이해해야 합니다. Bettencourt et al. (2008)48 및 Butera et al. (2001)29는 이전에 피드백 대기 시간이 샘플링 간격의 25%(≤ 5μs) 미만으로 이상적으로 유지되는 빠른 이온 컨ダク턴스를 정확하게 캡처하는 데 최소 50kHz의 높은 샘플링 속도를 달성하는 것이 중요하다는 것을 보여주었습니다. 상용 시스템, 특히 Windows 기반 플랫폼에서 보고하는 공칭 샘플링 속도는 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 따라서 독립적인 성능 검증이 필요한 경우가 많으며, 이에 대해서는 Milescu et al. (2008)25 및 Clausen et al. (2012)49. 특히 복잡한 형태와 비등전위 막 특성을 가진 온전한 뉴런으로 작업할 때 공간 클램프 제약 조건도 고려해야 합니다. 예를 들어, AIS와 같이 통합 부위의 원위부에 있는 전극을 사용하여 컨덕턴스를 적용(또는 빼기)하려고 하면 적용된 컨덕턴스의 효과가 부정확하게 묘사됩니다. 열악한(높은) 전극 저항, 부적절한 정전 용량 보상 및/또는 접합 전위 오류를 수정하지 못하면 전압 측정(입력 신호)의 잘못된 표시가 발생할 수 있으며, 결과적으로 모델링된 이온 컨덕턴스(50,51)의 잘못된 적용이 발생할 수 있습니다.

수천 개의 Markov 및 HH 모델은 각각 Human Brain Project 및 The Laboratory of Neural Microcircuitry의 지원을 받는 ModelDB52 및 Channelpedia53과 같은 온라인 데이터베이스에서 연구자가 무료로 사용할 수 있습니다. 이러한 데이터베이스에는 주로 NEURON, MATLAB 또는 Python으로 작성된 시냅스 컨덕턴스, 이온 채널 컨덕턴스 및 컨덕턴스 기반 뉴런 모델에 대한 모델이 포함됩니다. 데이터베이스 파일은 일반적으로 필요한 모델 방정식과 모델에 정보를 제공한 세포 유형 및 실험에 대한 기타 정보를 제공합니다.

마르코프 및 HH 컨덕턴스 모델 모두 전도성(시뮬레이션 채널 개방/활성화) 및 비전도성(시뮬레이션 채널 폐쇄) 게이팅 상태/변수를 포함합니다. 그러나 이러한 모델 유형은 샘플링된 각 전압에서 컨덕턴스 값을 계산하는 방식이 다르며, 마르코프 모델은 더 많은 계산 능력이 필요하지만 시뮬레이션된 채널의 게이팅 속성에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 예를 들어, HH 모델에서 전도 상태 및 비전도 상태는 독립 변수이며, 각각은 각 상태의 전압 입력 및 게이팅 동역학(54,55)에 의해 결정됩니다. 마르코프 모델과 대조적으로, HH 모델은 전압 개폐 나트륨 컨덕턴스 모델(25)에서 활성화된/개방 동역 상태에서 빠르게 비활성화된 동역 상태로 직접 시뮬레이션된 채널의 통과와 같은 게이팅 상태 사이의 전이를 시뮬레이션하거나 제한하지 않습니다. 이를 통해 HH 모델은 계산적으로 덜 복잡해졌고54,55 연구자는 높은 샘플링 및 업데이트 속도를 유지하면서 여러 고속 컨덕턴스 HH 모델을 동시에 추가할 수 있습니다.

마르코프 운동 상태 모델은 전도성 또는 비전도성일 수 있는 이산 운동 상태로 구성되며 이러한 상태는 고정된 토폴로지에서 상호 연결됩니다. 마르코프 모델 시뮬레이션에서 컨덕턴스는 전도 운동 상태를 차지하는 시뮬레이션된 채널의 비율에 따라 샘플링된 각 전압에서 계산됩니다. 각 운동 상태(시간 경과에 따라)를 차지하는 시뮬레이션된 채널의 비율은 상태 점유가 한 운동 상태에서 다른 운동 상태로 전환되는 속도를 제어하는 매개변수인 속도 상수에 의해 결정됩니다. 속도 상수는 단위 시간당 전이 확률을 나타내는 역초(s-1)의 단위를 갖습니다. 모델에 따라 속도 상수 값은 전압이나 온도와 같은 동적 요인에 따라 달라질 수 있습니다.

마르코프 모델에서 상미분 방정식은 각 운동 상태의 시간 의존적 점유를 설명하는 데 사용됩니다. 이 방정식은 전이 속도 상수를 기반으로 각 상태에 있을 확률이 시간이 지남에 따라 어떻게 진화하는지를 제어합니다. 이것은 속도 행렬 Q: figure-discussion-156으로 표시됩니다. 위에서 논의한 바와 같이 상태 간의 움직임을 결정하는 전이 속도 상수(r)는 입력 전압(V)과 전압 전반에 걸친 컨덕턴스의 동역학을 반영하는 매개변수 α 및 β의 영향을 받을 수 있습니다. 이들 방정식은 다음과 figure-discussion-2같이 설명될 수 있으며, 모델56,57,58의 각 운동 상태 안팎으로 연결(전이 속도 상수)을 포함하는 그래프의 형태로 시각적으로 표현될 수 있다. 마르코프 모델 및 토폴로지 개발에 대한 유용한 논의는 Schoening and Silva(2024)56에서 찾을 수 있습니다.

비선형 이온 전도도가 모델링되고 (전류 주입 전극을 통해) 실시간으로 살아있는 세포에 적용되는 현재 형태의 동적 클램프가 시작된 이래19,59, 이 기술을 위한 방법 및 자원은 진화해 왔으며, 마이크로컨트롤러 기반의 저비용 시스템(60) 및 무료 오픈 소스 소프트웨어(23)와 같은 혁신으로 인해 점점 더 접근성이 높아지고 비용 효율적입니다. 25,26. Sutter Instrument의 dPatch 또는 Cytocybernetics의 Cybercyte와 같은 상용 시스템은 통합 하드웨어 및 소프트웨어 솔루션을 통해 동적 클램프 실험의 신속한 구현을 더욱 촉진합니다27,61.

동적 클램프의 다양성은 가상 화학 및 전기 시냅스의 생성, 인공 네트워크 내에 실제 뉴런 내장(또는 그 반대의 경우), 가상 이온 채널 추가(62)를 포함한 다양한 응용 분야를 가능하게 합니다. 중요한 것은 적용된 컨ダク턴스의 전압 의존성, 동역학적 특성 및 진폭을 신속하게 조정할 수 있어 연구자가 하나 이상의 매개변수를 스케일링하는 것이 활동 전위 발화 및 막 흥분성에 어떤 영향을 미치는지 직접 테스트할 수 있다는 것입니다31. 오늘날의 시스템은 높은 샘플링 속도를 제공하여 빠른 과도 컨덕턴스의 정확한 적용을 가능하게 하고 기존의 전기생리학적 장비(60,63)와 쉽게 통합될 수 있어 동적 클램프를 신경 기능 및 기능 장애에 대한 이해를 발전시키기 위한 이상적인 방법으로 확고히 합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술 문의에 도움을 주신 Sutter Instrument의 Telly Galiatsatos와 Josh Stanford에게 감사드립니다. 또한 dPatch 동적 클램프 연구를 시작하는 데 도움을 준 Jan Dolzer에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CaCl2피셔 케미컬C79-500 시약
모세관 유리관 붕실산염 표준 벽 외경 1.5 mm 내경 길이 0.86 mm 길이 10 cm워너 인스트루먼트64-0793설비
클린벤치TMC63-9090E설비
컴프레스톰 VF-500-Z 바이브라토임 프레스시셔너리 악기https://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/설비
델 옵티플렉스 7080작은 골짜기https://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffus설비
포도당피셔 케미컬D16-500 시약
dPatch 증폭기 시스템서터 악기FG-DPATCH설비
EGTAEMD 밀리포어324626-25GM시약
젠장피셔 케미컬7365-45-9시약
인라인 히터워너 인스트루먼트64-0102설비
KCl피셔 케미컬P330-500 시약
케타민데크라 수의학 제품193.40620.3  시약
K-글루코네이트TCI 케미컬G0040시약
LinLab 소프트웨어과학https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2설비
LSE 6L 워터 배스코 닝6783설비
Mg-ATP시그마-올드리치74804-12-9시약
MgCl2피셔 케미컬012288.A9시약
모델 P-1000 피펫 풀러서터 악기FG-P1000설비
나클피셔 케미컬S271-500 시약
나-GTPMP 생의학56001-37-7시약
아니2PO4J.T. 베이커02-004-220 시약
NaHCO3피셔 케미컬S233-500 시약
안구 소프트웨어디지털 옵틱스 리미티드https://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-software설비
면도날인물60-0139-CTN설비
슬라이스 하프워너 인스트루먼트64-0255설비
슬라이스스코프 프로 3000과학https://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000설비
순간접착제록타이트8040-00-142-9193설비
SutterPatch 소프트웨어서터 악기https://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatch설비
온도 조절기워너 인스트루먼트64-2400설비
자일라진MP 생의학158307시약

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