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방법 논문

생체 내 안구건조증의 진단 및 관리에서 공초점 현미경: 이미징 프로토콜 및 해석에 중점을 둡니다.

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/69156

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2025년 11월 11일

 ,  , 

이 논문에서

요약

이 기사에서는 안구건조증의 진단 및 치료에서 생체 내 공초점 현미경의 작동 및 효과를 보여주고 향후 연구의 기초를 제공하기 위해 생체 내 공초점 현미경의 적용 및 결과를 조사합니다.

초록

생체 내 공초점 현미경(IVCM)은 비침습적 특성과 고해상도로 인해 큰 주목을 받았습니다. 이를 통해 각막, 결막, 눈꺼풀 가장자리, 마이봄샘 및 Demodex와 같은 기생충을 포함한 수많은 안구건조증(DED) 관련 안구 표면 구조를 세포 수준에서 생 체 내 관찰 및 객관적으로 정량화할 수 있습니다. 이 기능은 안과 의사가 DED의 특정 병인과 하위 유형을 식별하는 데 도움을 주어 정확한 진단, 표적 치료 및 예후 평가를 촉진합니다. 그러나 IVCM 운영 및 보고를 위한 표준화된 프로토콜은 여전히 부족합니다. 이 장치를 효과적으로 활용하고 고품질 보고서를 생성하려면 안과 지식과 기술 운영에 대한 숙련도가 필수적입니다. 이 기사에서는 DED 환자를 위한 IVCM 검사의 절차적 단계와 뉘앙스에 대해 자세히 설명합니다. 이것은 DED를 위한 최초의 JoVE 단계별 IVCM 프로토콜입니다. 임상의에게 참고 자료 역할을 하여 운영 비효율성을 피하고 임상 관리를 안내하기 위해 고품질 각막 및 안구 표면 이미지를 지속적으로 얻을 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다.

서론

지역 의료 자원의 제약이나 환자의 재정적 부담으로 인해 DED의 임상 진단은 종종 기본적인 측면(예: 세극등 현미경으로 관찰, 눈의 건조함 및 가려움증 호소) 또는 단일 지표(예: 침습적 눈물막 파괴 시간, 눈물 분비물 검사 또는 모낭충 감염). IVCM 적용은 프로토콜을 표준화하는 것은 고사하고 널리 사용되지 않습니다. 그러나 IVCM을 갖춘 안과 기관의 경우 저자는 처음 방문하는 환자에게 각막, 결막, 눈꺼풀 가장자리 등의 누락을 방지하기 위해 종합적인 현미경 검사를 받을 것을 권장합니다. 모호한 DED 사례 또는 Demodex 검출의 경우 IVCM은 명시적인 답변에 특히 적합합니다.

안구건조증(DED)은 눈물액의 질이나 양의 이상과 눈물막의 안정성 저하로 인한 만성 안구 표면 상태로 정의됩니다. 안구건조증 워크숍 II(DEWS II)에서 DED는 수성 결핍성 안구건조증(ADE), 증발성 안구건조증(EDE), 혼합성 안구건조증(MDE), 안구건조증 소인, 전임상 안구건조증 상태의 5가지 유형으로 분류됩니다1. Ralene et al. 2017년부터 2022년까지 발표된 문헌을 포함하여 다양한 유형의 안구건조증에서 IVCM의 중요한 임상 실습을 요약했습니다2. 최근 연구에 따르면 염증은 DED의 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다 3,4. 특히, 수지상 세포(DC) 밀도는 전신 면역 매개 과정과 관련된 DED의 좋은 지표가 될 수 있습니다5.

IVCM은 공초점 레이저 단층 촬영 기술을 활용합니다. 1 μm의 수평 및 수직 해상도를 제공합니다. 장치의 자세한 기술 사양은 Jeremy etal 6의 보고서에 문서화되어 있습니다. 안구 표면 검사 중에 IVCM은 먼저 각막7에 적용된 다음 결막과 마이봄샘8에 적용됩니다. 모낭충 안검염은 최근 몇 년 동안 임상적 관심을 받고 있습니다 9,10. IVCM은 각막, 결막 및 눈꺼풀 가장자리의 선명한 이미지를 제공합니다. 이러한 이미지를 통해 임상의는 질병 상태를 평가하고 염증 및 면역 세포의 이미징 및 정량화를 용이하게 할 수 있습니다.

DED 평가에서 우리의 초점에는 다음이 포함됩니다: 각막 상피 세포(CEC); 상피하 신경 섬유(SNF); 상피간 및 상피하 염증/면역 세포; 결막 잔 세포(CGC); 결막 염증/면역 세포; 마이봄샘 acini 및 구멍; 모낭충 및 모낭충; 주변 조직 내의 염증 세포. 이러한 강조는 병태생리학에서 비롯됩니다: 마이봄샘 기능 장애는 분비 감소 또는 눈물막 지질층의 구성을 변경하여 눈물 증발 가속화 및 안구 표면 손상을 초래합니다. 모낭충 감염은 안구 가려움증과 불편함을 유발합니다. CGC는 중요한 눈물막 구성 요소인 뮤신을 분비합니다. 이들의 고갈은 뮤신 결핍 DED를 유발할 수 있습니다. 반대로, DED 자체는 CEC 및 SNF를 포함한 안구 표면 구조를 손상시키고 이후 각막 및 결막 조직의 염증/면역 세포 밀도를 증가시킵니다. 이상적인 사진을 얻은 후에는 소프트웨어에 내장된 정량적 도구를 효과적으로 활용하여 언급된 수많은 세포를 계산할 수 있습니다(그림 1). 그러나 SNF의 형태학적 다양성을 위해서는 정량화에 도움이 되는 분석 소프트웨어에 의존해야 합니다11,12.

IVCM은 안구 표면 조직의 각막층, 신경 섬유 및 염증/면역 세포의 실시간 평가에 필수적입니다. CGC를 평가하기 위해 인상 세포학이 대체 방법으로 사용됩니다. 이 기술은 잔 세포 밀도가 최고조에 달하는 원추 결막을 표적으로 하여 일반적으로 IVCM 측정13,14보다 높은 값을 산출합니다. 그러나 결과는 염색 가변성과 작업자의 전문 지식에 따라 달라질 수 있으며, 시간 집약적인 프로토콜은 일상적인 임상 구현을 제한합니다. 마이봄샘 구멍 폐쇄는 세극등 현미경을 통해 직접 관찰할 수 있지만 이 방법은 IVCM이 정확하게 식별하는 단모낭충 유발 막힘을 감지할 수 없습니다. 모낭충 감염을 진단하기 위해 광학 현미경 검사를 통한 속눈썹 제모는 저렴한 방법을 제공합니다. 기술적으로는 간단하지만 이 접근 방식에는 상당한 한계가 있습니다: 환자의 불편함으로 인해 다중 샘플링이 제한되고 속눈썹 모낭 또는 마이봄샘 구멍 깊숙이 상주하는 진드기가 감지되지 않습니다15. 대조적으로, IVCM은 환자의 불편함을 최소화하면서 속눈썹 모낭과 마이봄샘 구멍을 포함한 여러 눈꺼풀 가장자리 부위를 종합적으로 검사할 수 있습니다. 이 접근법은 미세 서식지 내에서 기생충의 실시간 생체 내 시각화를 통해 훨씬 더 높은 진단 양성률을 달성합니다16,17.

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프로토콜

검사 절차는 Hankou Aier 안과 병원 윤리위원회의 승인을 받았으며 모든 환자로부터 사전 동의를 얻었습니다.

참고: 환자 선택을 위한 포함 기준에는 안구 건조증과 가려움증을 호소하는 환자와 일상적인 시력 검사를 원하는 개인이 포함됩니다. 환자 선택의 제외 기준에는 각막 천공 또는 각막 천공이 임박한 환자, 국소 안구 마취제에 알레르기가 있는 환자, 너무 어리거나(예: 3세 미만) 너무 나이가 많아 협조할 수 없는 개인, 눈꺼풀 검경을 수용할 수 없는 좁은 안꺼풀 균열 환자, 임산부 및 기타 이유로 협조할 수 없는 개인. 간단한 워크플로 다이어그램은 그림 2에서 찾을 수 있습니다. 자세한 작동 단계는 다음과 같습니다.

1. 사전 심사

  1. 재료 준비: IVCM 장치, 각막 접촉 캡, 안과용 국소 마취제, 커플링제, 의료용 면봉, 눈꺼풀 검경, 알코올 볼, 알코올 저장소, 항염증 점안액(그림 3).
  2. IVCM 장비의 주요 구성 요소(하이델베르그 망막 단층 촬영 로스토크 각막 모듈(HRT-RCM)), 초점 손잡이, 모니터링 카메라, 시선 유도 조명, 턱 받침대, 이마 받침대, 왼쪽/오른쪽 눈 간 전환 버튼, HRT-RCM을 3축으로 이동하기 위한 회전 손잡이, 이미지 캡처 버튼 및 풋 페달, 전용 IVCM 소프트웨어가 있는 컴퓨터), 커플링 젤로 IVCM 장치를 준비합니다.
  3. 심사관 준비: 마스크를 착용하고 알코올 기반 젤로 손을 소독하거나 일회용 장갑을 착용하십시오.
  4. 장치 소독: 알코올 면봉으로 장비의 이마와 턱 받침대를 닦습니다.
  5. 절차 설명: 불안을 완화하기 위해 검사가 통증이 없음을 환자에게 간략하게 설명합니다.

2. 검사 중

  1. 컴퓨터의 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 새 환자 기록을 확인하고 만듭니다.
  2. 국소 마취제 투여: 시술 전 3분 간격으로 하부 원추에 2방울을 투여합니다.
  3. IVCM 장치의 로스토크 각막 모듈(RCM) 준비: RCM의 레이저 방출 영역을 커플링 젤로 코팅하고(기포가 없는지 확인)(그림 4 및 그림 5), 충분한 양의 커플링제(보통 한두 방울, 너무 많지 않음)만 각막 접촉 캡과의 완전한 접촉을 보장하고 궁극적으로 이상적인 영점 조정 인터페이스를 달성할 수 있습니다. 일회용 각막 접촉 캡을 부착합니다.
  4. 장치 배치: RCM을 완전히 집어넣습니다. 이마 받침대를 수평으로 고정합니다. 모니터링 카메라를 피사체의 시간면으로 조정합니다. RCM의 광축에 수직인 카메라 정지 지점의 위치를 찾습니다.
  5. 초점 보정: 소프트웨어가 이미지 품질 값이 정확히 100인 최대화된 흰색 얼굴을 표시할 때까지 초점 노브를 돌립니다. 깊이 값을 0으로 재설정합니다(영점 조정).
  6. 스캔 모드 선택: 달리 지정하지 않는 한 기본값은 단면 모드 입니다. 모낭충 진드기 활동을 관찰하기 위해 시퀀스 모드를 사용하여 동적 이미지를 연속적으로 기록할 수 있습니다.
  7. 환자 위치 지정: 턱 받침대에 턱을 단단히 올려 놓습니다. 이마 받침대에 이마를 누르십시오. 검사대와 턱받침대를 환자의 키에 맞게 조정하십시오.
  8. 눈꺼풀 검경 삽입: 면봉을 사용하여 윗눈꺼풀을 들어 올려 배치하면서 환자에게 아래를 내려다보도록 요청하고, 환자에게 면봉으로 아래 눈꺼풀을 부드럽게 아래로 당겨 배치하도록 합니다.
  9. 최종 지침: 올바른 헤드 위치를 다시 확인하십시오. 환자에게 긴장을 풀고 움직이지 않도록 상기시키십시오. 불편함이 있으면 즉시 보고하십시오.
  10. 각막 검사 프로토콜
    1. 거시적 정렬로 시작: 각막 정점을 근사화하도록 RCM을 육안으로 조정합니다(그림 6). RCM이 각막에 접근할 때 미세 조정을 위해 장치의 모니터링 카메라로 전환합니다. 환자가 병변 각막에 대한 시선을 회전시켜 병변을 RCM 아래 중앙에 두도록 안내합니다. 각막 손상을 방지하기 위해 부드러운 접촉을 유지하십시오.
    2. 핵심 기술: 각막 접촉 캡은 물리적 크기는 크지만 광학 영역은 매우 작습니다(레이저 방출 중앙 영역으로 제한됨). 중요한 요구 사항: 접착력이 좋지 않으면 이미징 아티팩트(예: 기포, 오일 간섭 또는 완전한 신호 손실)가 발생하므로 캡과 표적 조직 사이의 고정밀 접촉을 달성합니다.
      알림: 연속 이미징의 경우 장시간 스캔을 위해 풋 페달을 밟아 순차적 깊이 이미지를 캡처하고 중요한 데이터를 누락하지 않도록 하십시오.
  11. 층상 각막 평가: CEC, SNF, 상피하 염증 세포의 순서로 표층에서 심층으로 스캔합니다.
    1. 권장 랜드마크인 하부 소용돌이와 인접한 상/하부 부위에 집중18.
  12. 비강 결막 검사
    1. 초점면을 깊이 값 0으로 재설정합니다. 캡에 커플링 젤을 바릅니다. 환자에게 일시적 또는 하측액적으로 응시하도록 지시하십시오. RCM을 결막 표면으로 부드럽게 밀어냅니다. 동시 기동: 오른손으로 최적의 시야를 위해 RCM 위치를 조정합니다. 초점 손잡이를 돌려 왼손으로 가장 바깥쪽 결막층의 잔 세포를 식별합니다.
  13. 눈꺼풀 검경 제거: 환자에게 아래를 내려다보도록 지시하고 면봉을 사용하여 윗눈꺼풀을 들어 올려 제거합니다. 그리고 환자에게 위를 올려다보도록 지시하고 면봉으로 아래쪽 눈꺼풀을 부드럽게 눌러 제거합니다.
  14. 장치 재설정: 이마 받침대를 풀고 들어 올립니다. 초점 노브를 제로화합니다. 커플링 젤을 RCM 표면에 다시 도포합니다.
  15. 마이봄샘 및 속눈썹 모낭 평가
    1. 환자 위치 지정: 아래쪽을 바라보도록 지시합니다. 검사관의 기동: 윗 눈꺼풀 피부를 부드럽게 들어 올리고 안쪽으로 눌러 눈꺼풀 가장자리를 각막 캡 평면과 평행하게 정렬합니다. RCM을 가로로 이동하면 동일한 유형의 구조의 더 많은 이미지를 볼 수 있습니다. RCM을 수직으로(아래에서 위로) 움직여 마이봄샘 구멍 검사에서 선봉 검사, 속눈썹 뿌리로 전환합니다.
      알림: 초보자는 마이봄샘 구멍을 검사할 때 더 나은 노출을 위해 눈꺼풀을 전복시킬 수 있습니다. 이 부분의 검사 위치는 위 눈꺼풀의 중앙 1/3을 제안합니다.
    2. 정량적 표준(기관 프로토콜): 인접한 acini15가 있는 8개의 연속 난포를 평가하고 4-8개의 순차적인 샘 구멍을 검사합니다. 깊이 보정: 모낭의 선명한 이미지를 얻으려면 모낭충 진드기가 선명한 경계를 보일 때까지 초점을 맞추십시오(있는 경우). 선방의 선명한 이미지를 얻기 위해 권장 값은 약 30-50μm 깊이입니다. 그리고 구멍의 경우 약 30μm입니다(감염된 경우 모낭충 단단한 가시성을 조정하십시오)19.

3. 사후 심사

  1. 시술 후 관리: 손 위생을 실시하고 손을 철저히 소독하십시오. 면봉을 사용하여 안구 표면에 남아 있는 커플링 젤, 찢어짐 또는 부스러기를 부드럽게 닦아냅니다. 감염을 예방하기 위해 항생제 점안액을 투여하십시오.
  2. 환자 지침: 검사 당일 눈을 비비지 않도록 환자에게 조언하십시오.
  3. 보고: 획득한 모든 이미지를 종합적으로 분석하고 진단 보고서를 생성합니다. 보고 요구 사항: 조직 구조당 최소 하나의 이미지를 포함하고 필요에 따라 비정상적인 소견에 대해 더 추가합니다. 선택한 모든 이미지는 검사 순서 및 깊이 값에 따라 정렬되고 정확한 설명과 측정이 뒤따릅니다.
  4. 폐기물 처리 지침: 일회용 재료(접촉 캡, 면봉, 마취 용기)의 경우 전문적인 폐기를 위해 의료 폐기물통에 버리십시오.

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결과

모든 IVCM 현미경 이미지는 384픽셀 × 384픽셀의 해상도, 400μm × 400μm의 관찰 필드로 획득되었습니다. 적절하게 "영점 조정"되면 이 검사는 이미지 프레임에 세 가지 가능한 결과만 표시합니다. i) 이미지가 전혀 없음(실패한 실험): 중앙 광학 영역이 대상 조직과 접촉하지 않았습니다. ii) 부분 이미지(그림 7) 또는 기타 비정상적인 상황(그림 8)(실패한 실험): 중앙 광학 영역이 표적 조직과 불완전하거나 느슨한 접촉을 했습니다. iii) 선명하고 완전한 이미지(성공적인 실험): 중앙 광학 영역은 표적 조직과 완벽한 접촉을 달성했습니다(그림 9 내지 그림 17). 따라서 문제는 성공한 이미지와 실패한 이미지를 구별하는 것이 아니라 작동 ...

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토론

"생체 내 공초점 현미경" 및 "안구건조증"이라는 키워드를 사용한 PubMed 문헌 검색(2025년 6월 검색)은 > 300개의 간행물을 산출했습니다. 특히 연간 출판률은 2021년 이후 연간 약 40편으로 안정화되고 있다. 안구 표면 장애에 대한 IVCM의 광범위한 적용은 지난 2004-2024년 동안 > 2,000건의 연구를 생성했습니다. 임상적으로 IVCM은 안구 표면 병리의 세포 수준 평가에 혁명을 일으켰습니다. 이 기술을 사용하면 무증상 질병 증상을 감지할 수 있어 위에서 언급한 후자의 두 가지 유형의 DED와 정확하게 일치하는 조기 진단 및 정밀 개입이 용이합니다. 또한, IVCM 유도 치료 프로토콜은 객관적인 개선 시 증거 기반 약물 감량 또는 중단을 허용하여 치료 부담 및 관련 사회경제적 영향을 줄입니다. 예를 들어, 마이봄샘 개구부 및 선방의 막힘에 대한 마이봄샘 막힘 제거 치료(그림 14

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 일부 사진을 도와준 Hankou Aier Eye Hospital의 Lina Jin과 Wuhan Asia Heart Hospital 안과의 Min Chen, 그리고 수술 절차를 위해 일하는 모든 참가자와 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 우한시 위생건강위원회(WX23A20)의 과학 연구 프로젝트의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 면봉지안치, 중국http://www.hnjianqi.com작은 알코올 볼을 만들 때
알코올 기반 젤리캉, 중국 상하이31107904손 소독 세척 젤, 500ml
카보머 안약류비디식, 독일8187195결합제용 멸균 안과 젤, 10g
각막 접촉 캡(토모캡)하이델베르크, 독일18829광학 매체와 각막 무균 접촉
눈꺼풀 질경아시콘, 중국6102A눈을 뜨게 해줘서
하이델베르크 아이 익스플로러 소프트웨어하이델베르크, 독일버전 1.5.2.0IVCM 장치에 포함된 소프트웨어입니다
IVCM 장치하이델베르크, 독일HRT-?,08398시험의 주요 장비
의료용 면봉이사운드 메드, 중국www.e-soundmed.com환자의 눈을 세척하고 눈을 뜨는 데 10cm
75% 의료용 알코올중국 휘창www.huichang888.cn알코올 볼을 만들 때는 75% 이상; 5% 500ml
0.4% 옥시부프로카인 하이드로클로라이드 안약류산텐, 일본http://www.santen.co.jp안과 국소 마취제, 0.4% (0.5ml: 2mg)
토브라마이신 안약류토브렉스, 벨기에8453824항염증 안약, 0.3% (5ml: 15mg)

참고문헌

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  26. Kryszan, K., et al. Artificial-intelligence-enhanced analysis of in vivo confocal microscopy in corneal diseases: a review. Diagnostics. 14, 694(2024).

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