이 프로토콜에는 석회화된 혈관 표본에 대한 단계별 워크플로우가 포함되어 있습니다: 조직 취급, 탈석화, RNA 검증, 석회화 수준 검출, 그리고 Nanostring GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서의 관심 영역 선택 전략. 목표는 신뢰할 수 있는 공간 전사체 분석을 위해 혈관 조직 형태와 RNA를 보존하는 포괄적인 방법을 제시하는 것입니다.
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방법 논문
디지털 공간 프로파일링을 위한 보존된 형태와 RNA를 이용한 석회화된 동맥 준비 및 처리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
공간 전사체학은 전체 전사체 프로필을 조직 절편에 직접 매핑하여 세포 이웃과 유전자 발현 및 이러한 활동이 건강과 질병을 어떻게 유발하는지 연관시킵니다. 이 접근법은 종양학, 신경과학, 면역학, 발달과학 등 여러 분야에 변화를 가져왔지만, 혈관 질환이 전 세계적으로 주요 사망 원인임에도 불구하고 혈관생물학에서는 덜 널리 사용되고 있습니다. 두 가지 장애물이 두드러집니다: 동맥과 정맥은 절절에 평평한 면이 거의 없고, 병든 표본은 종종 동맥경화, 혈전, 플라크가 많거나 석회화된 경우, 탈석화와 같은 가혹한 처리가 필요해 형태와 RNA 무결성을 위협합니다. 그러나 이들 혈관은 동심원으로 이루어진 막막, 배지, 폐막 층 구조를 가지고 있어, 각 층마다 서로 다른 세포 유형과 유전자 프로그램이 벽을 가로질러 상호작용하기 때문에 공간 분석에 이상적입니다.
공간 전사체학을 위해 혈관 조직을 준비하는 방법에 대한 상세한 프로토콜은 거의 없습니다. 이러한 부족 현상은 연구자들이 이 기술의 잠재력을 최대한 활용하는 데 한계를 두고 있습니다. 이를 메우기 위해, 진행된 병변이 있는 인간 경골동맥에 최적화된 단계별 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 조직 취급, 고정, 적절한 탈석화를 포함하여 구조와 RNA 품질을 유지하고, 이후 조직학적 염색을 통해 석회화 심각도를 평가합니다. 또한 NanoString GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서 배치 효과를 억제하기 위한 조직 마이크로어레이(TMA) 구축과 관심 영역(ROI) 선택 전략에 대해서도 설명합니다.
기술적 장벽을 낮춤으로써, 이 프로토콜은 혈관 연구자들이 신뢰할 수 있는 공간 전사체 데이터를 생성하고, 건강한 혈관과 병든 혈관에서 층별 전사 활동을 연구할 수 있게 합니다. 우리는 석회화, 염증, 내막 동맥경화증 및 기타 혈관 병리의 기전 발견을 가속화하고, 혈관 생물학에서 공간 전사체학의 광범위한 채택을 촉진할 것으로 기대합니다.
서론
지난 10년간 차세대 시퀀싱과 고해상도 영상이 융합되어 공간 전사체학을 발전시켰습니다. 이는 조직 1,2 구간 내 각 전사체의 정확한 위치를 보존하면서 전체 전사체 정량화 방법입니다. 빠르게 성숙해지는 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 분야와 결합되면, 공간적 접근법은 유전자 서명을 조직이나 기관 내 특정 세포 유형, 상태, 지위와 연결하는 효율적인 경로를 제공하여 질병 기전에 대한 이해를 크게 풍부하게 합니다 3,4,5,6,7. 10X Visium, NanoString GeoMx 및 CosMx, Slide-seq, DBiT-seq 등 여러 상업용 플랫폼이 개발 중이며, 각각 종양과 뇌 조직과 같은 연약하고 세포성이 높은 조직에 최적화된 프로토콜로 지원되고 있습니다. 이 분야는 폭발적인 성장을 겪고 있으며, PubMed는 2023년에....
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프로토콜
인간 동맥 표본 채취를 위한 모든 절차는 워싱턴 대학교 인간 대상 부서 기관심사위원회(IRB)와 VA 퓨젯사운드 의료 시스템(시애틀, 워싱턴)의 IRB에서 승인받았습니다. 조직 채취 전에 환자들로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구에 사용된 재료와 장비는 재료표에 기재되어 있습니다.
1. 조직 절단 및 고정
- 조직 절단
- 운송 가방은 내관, 보조 용기, 외부 운송 용기, 생물위험 샘플 가방을 포함한 다층 포장으로 준비하세요. 내부 50mL 원심분리관에 4-[2-하이드록시에틸]-1-피페라지네에스폰산(HEPES) 1%와 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 포함한 저장 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지 30mL를 채웁니다.
- 채취한 전방 경골동맥(AT), 후경골동맥(PT), 비골동맥(PR>)을 각각 50mL 원심분리관에 넣어 50mL 원심분리관에 넣습니다. 수술실에서 조직 배양실로 얼음 캔을 옮겨.
참고: 복제와 충분한 조직 보존을 위해 복제 및 추가 평가 또는 검증을 위해 충분한 조직을 확보하기 위해 채취한 샘플 길이....
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결과
여기서 제시된 프로토콜은 경골동맥 수령부터 형태학과 RNA 무결성을 모두 보존한 TMA 슬라이드를 생성하여 공간 전사체학 분석을 수행하는 데 연구자들을 안내합니다. 또한 동맥 내 칼슘 침착을 시각화하는 조직학적 방법, 형태학적 표지 염색, ROI 선택 전략도 상세히 설명합니다.
그림 1에서는 동맥이 10% NBF에 고정되어 있습니다(2단계). NBF는 조직에 빠르게 침투하여 RNA 분해를 최소화하며, 인산염 완충제(pH 7.0)는 고정 과정에서 형성된 개미산을 중화하여 pH가 6 이하로 떨어지지 않도록 합니다. 프로파일러 기기에서 ROI가 선택된 후에는 다음 단계들이 이 프로토콜에서 시연되지 않습니다. 간단히 말해, 자외선(UV) 레이저가 각 ROI를 정밀하게 밝히며 바코드 태그가 부착된 올리고뉴클레오타이드를 방출합니다. 이 올리고들은 nCounter 또는 차세대 시.......
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토론
이 프로토콜은 NanoString GeoMx DSP에서 공간적 전사체 프로파일링을 위해 석회화된 인간 경골동맥을 준비하는 데 필요한 단계를 상세히 설명합니다. 경골동맥은 모든 혈관과 마찬가지로 동심원으로 이루어진 막막, 중간, 폐막층을 가지고 있으며, 각각 손상과 수리를 조율하는 독특한 세포 집단을 가지고 있습니다. 이 층의 구조를 유지하는 것은 층 분해 전사체 분석에 필수적이지만, 종종 간과되는 여러 준비 단계가 그 목표를 저해할 수 있습니다.
동맥 조직을 확보한 후에는 복엽 주위 지방 조직을 제거하되 폐막은 그대로 남겨야 합니다; 이로 인해 ROI 배치를 위한 공간적 틀 역할을 하는 연속적인 선박 벽이 보존됩니다. 중요한 단계는 RNA 품질을 유지하는 것입니다. 우리는 10% NBF에서 조직을 고정하는데, 이는 인산염 완충제(pH 7.0)가 고정 과정에서 생성된 개미산을 중화시켜 산 촉매에 의한 RNA 가수분해를 제.......
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공개 사항
저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
이 작업은 VA 퓨젯 사운드의 시드 보조금, VA 공로상 I01 BX004975-02, 그리고 자원 및 VA 퓨젯 사운드 헬스 케어 센터의 시설 이용으로 지원받았습니다. 이 작업은 저자의 것이며 재향군인부나 미국 정부의 입장이나 정책을 반드시 반영하지는 않습니다. 워싱턴 대학교 조직학 및 영상 코어(HIC)에서 제공하는 영상 서비스에 감사드립니다. 워싱턴 대학교의 DSP 실험에 대한 지도를 주신 슈리람 아킬레시 박사님과 MANTIS 연구소 UW 공간생물학 코어 그룹에 감사드립니다. 또한 워싱턴 대학교 당뇨병 연구센터의 니시 이바노프에게 조직학적 염색 연구를 통해 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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| 페니실린-스트렙토마이신(P/S), 10,000 U/mL | 써모피셔 사이언티브 | 15140122 | |
| 10% 중성 완충 포르말린(NBF) | 밀리포어 시그마 | 65346-M | |
| 에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA) | 밀리포어 시그마 | 3620 | |
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참고문헌
- Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
- Schmitd, L. B.,
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재인쇄 및 허가
