방법 논문

디지털 공간 프로파일링을 위한 보존된 형태와 RNA를 이용한 석회화된 동맥 준비 및 처리

DOI:

10.3791/69159

⸱

2026년 1월 23일

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에는 석회화된 혈관 표본에 대한 단계별 워크플로우가 포함되어 있습니다: 조직 취급, 탈석화, RNA 검증, 석회화 수준 검출, 그리고 Nanostring GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서의 관심 영역 선택 전략. 목표는 신뢰할 수 있는 공간 전사체 분석을 위해 혈관 조직 형태와 RNA를 보존하는 포괄적인 방법을 제시하는 것입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공간 전사체학은 전체 전사체 프로필을 조직 절편에 직접 매핑하여 세포 이웃과 유전자 발현 및 이러한 활동이 건강과 질병을 어떻게 유발하는지 연관시킵니다. 이 접근법은 종양학, 신경과학, 면역학, 발달과학 등 여러 분야에 변화를 가져왔지만, 혈관 질환이 전 세계적으로 주요 사망 원인임에도 불구하고 혈관생물학에서는 덜 널리 사용되고 있습니다. 두 가지 장애물이 두드러집니다: 동맥과 정맥은 절절에 평평한 면이 거의 없고, 병든 표본은 종종 동맥경화, 혈전, 플라크가 많거나 석회화된 경우, 탈석화와 같은 가혹한 처리가 필요해 형태와 RNA 무결성을 위협합니다. 그러나 이들 혈관은 동심원으로 이루어진 막막, 배지, 폐막 층 구조를 가지고 있어, 각 층마다 서로 다른 세포 유형과 유전자 프로그램이 벽을 가로질러 상호작용하기 때문에 공간 분석에 이상적입니다.

공간 전사체학을 위해 혈관 조직을 준비하는 방법에 대한 상세한 프로토콜은 거의 없습니다. 이러한 부족 현상은 연구자들이 이 기술의 잠재력을 최대한 활용하는 데 한계를 두고 있습니다. 이를 메우기 위해, 진행된 병변이 있는 인간 경골동맥에 최적화된 단계별 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 조직 취급, 고정, 적절한 탈석화를 포함하여 구조와 RNA 품질을 유지하고, 이후 조직학적 염색을 통해 석회화 심각도를 평가합니다. 또한 NanoString GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서 배치 효과를 억제하기 위한 조직 마이크로어레이(TMA) 구축과 관심 영역(ROI) 선택 전략에 대해서도 설명합니다.

기술적 장벽을 낮춤으로써, 이 프로토콜은 혈관 연구자들이 신뢰할 수 있는 공간 전사체 데이터를 생성하고, 건강한 혈관과 병든 혈관에서 층별 전사 활동을 연구할 수 있게 합니다. 우리는 석회화, 염증, 내막 동맥경화증 및 기타 혈관 병리의 기전 발견을 가속화하고, 혈관 생물학에서 공간 전사체학의 광범위한 채택을 촉진할 것으로 기대합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 10년간 차세대 시퀀싱과 고해상도 영상이 융합되어 공간 전사체학을 발전시켰습니다. 이는 조직 1,2 구간 내 각 전사체의 정확한 위치를 보존하면서 전체 전사체 정량화 방법입니다. 빠르게 성숙해지는 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 분야와 결합되면, 공간적 접근법은 유전자 서명을 조직이나 기관 내 특정 세포 유형, 상태, 지위와 연결하는 효율적인 경로를 제공하여 질병 기전에 대한 이해를 크게 풍부하게 합니다 3,4,5,6,7. 10X Visium, NanoString GeoMx 및 CosMx, Slide-seq, DBiT-seq 등 여러 상업용 플랫폼이 개발 중이며, 각각 종양과 뇌 조직과 같은 연약하고 세포성이 높은 조직에 최적화된 프로토콜로 지원되고 있습니다. 이 분야는 폭발적인 성장을 겪고 있으며, PubMed는 2023년에 약 150편, 2024년에는 거의 300편, 2025년에는 500편을 넘을 것으로 예상됩니다. 이러한 급증에도 불구하고, 혈관생물학은 암, 신경과학, 면역학에 비해 여전히 과소대표되고 있습니다.

뼈, 연골, 치아, 플라크가 많은 석회화된 동맥이나 정맥과 같은 단단하거나 광물질화된 조직은 훨씬 더 불편한 것으로 입증되었습니다. 기술적 장애물은 다면적입니다. 첫째, 밀집된 광물 매트릭스를 가진 조직은 킬레이션이나 산 기반 제거가 필요하며, 이는 RNA를 분열시키고 조직 형태를 왜곡할 수 있는 공격적인 처리가 필요합니다. 둘째, 손상되었거나 섬유화된 병폐 조직은 방대한 세포외기질(ECM)에 내재된 살아있는 세포가 적어 전사체 수율이 감소하고 데이터 정규화를 복잡하게 만듭니다. 또한 혈관 조직은 속이 빈 내면을 감싸는 얇고 동심원형 구조(내막, 중간, 심폐막)를 가지고 있습니다. 특히 단세포층 막막 부분의 벽 두께가 제한되어 있어 포획 부위에 조직이 적을 수 있고, 수시간에 걸친 염색 및 잡종화 과정에서 단편이 찢어지거나 분리될 수 있습니다. 그 결과, 혈관 조직의 공간 전사체 연구는 여전히 드물지만, 심혈관 질환은 전 세계적으로 사망과 심각한 이환율의 주요 원인 중 하나로 꾸준히 자리매김하고 있습니다. 존재하는 프로토콜 논문들은 대체로 데이터 처리, 시각화 또는 NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13 이외의 플랫폼에 중점을 둡니다. 이들 논문 중에서, 특히 말초 동맥 질환(PAD)에서 임상적으로 중요한 혈관인 병든 경골동맥을 처리하는 벤치 수준 방법을 다루는 논문은 거의 없습니다. 특히 당뇨병 환자 중 점점 더 많은 비중을 차지하고 있습니다.

이 격차를 해소하기 위해, 절단을 받은 PAD 환자로부터 얻은 석회화된 인간 경골동맥에 대한 포괄적인 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 다음과 같습니다: (1) 수술실 채취 직후 조직 절단 및 해리; (2) 조직 형태와 RNA의 완전성을 유지하는 적절한 조직 고정 및 탈석화; (3) 배치 효과를 최소화하기 위한 비용 절감 조직 마이크로어레이(TMA) 구축; (4) RNAscope in situ 하이브리드화 및 조직학적 칼슘 염색을 통한 품질 관리; 그리고 (5) GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP) 플랫폼에서 석회화된 경골 동맥을 위해 특별히 설계된 관심 영역(ROI) 선택 전략. 이 단계에는 DSP 기기에서 샘플 채취, 라이브러리 준비, 시퀀싱, 데이터 분석이 포함됩니다.

참고된 DSP 플랫폼에서 입증되었지만, 이 원리는 10X Visium 또는 기타 플랫폼의 조직 준비를 안내할 수 있으며, 방법론은 추가 혈관 침대나 동물 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 바이오뱅크와 사후 조직에 적용될 수 있으나, 성공은 조직 보존, 고정, 저장 조건에 매우 중요합니다. 조직은 허혈 기간을 최소화하기 위해 수확 직후 즉시 고정해야 합니다(이상적으로는 1시간 이내). 표준 10% 중성 완충 포르말린(NBF)은 상온(RT)에서 최소 16시간 이상 권장됩니다. 고정 후 조직은 즉시 삽입되어야 하며, 에탄올에 3일 이상 보관해서는 안 됩니다. 포르말린 고정 파라핀 내재(FFPE) 블록은 권장 조건 하에 가공 및 보관되어 약 3년간 공간 프로파일링에 적합하지만, 블록 연령이 지나면서 RNA 품질이 저하됩니다. 따라서 저세포도 샘플, 6개월 이상 보관되는 블록, 바이오뱅크 샘플, 사후 조직에 대해 RNA 품질 평가가 권장됩니다. 최소 허용 RNA 품질은 선택된 분석법, ROI 선택, 원하는 해상도 및 핵심 시설 권고사항에 따라 달라집니다. 실제로는 견고한 결과를 위해 세그먼트당 약 50-100개의 핵이 권장됩니다. DSP 플랫폼은 FFPE와 신선 냉동 조직 모두를 지원합니다. 이 프로토콜에서는 FFPE 조직에 중점을 둡니다.

이 연구는 공간 전사체학에 중점을 두고 있으나, scRNA-seq와 쉽게 통합됩니다. 공개된 scRNA-seq 데이터셋과 계산 공간 디컨볼루션을 활용해 각 공간 점에 대해 세포 유형 비율을 추정하고, scRNA-seq로 정의된 세포 상태를 조직 구조에 투영할 수 있습니다. 구조와 RNA 무결성을 모두 유지함으로써, 우리 프로토콜은 단세포 또는 단일 분자 검증을 가능하게 하여 귀중한 혈관 표본에서 생물학적 통찰을 극대화하고 혈관생물학 연구에서 공간적 전사체학의 광범위한 채택을 가능하게 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 동맥 표본 채취를 위한 모든 절차는 워싱턴 대학교 인간 대상 부서 기관심사위원회(IRB)와 VA 퓨젯사운드 의료 시스템(시애틀, 워싱턴)의 IRB에서 승인받았습니다. 조직 채취 전에 환자들로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구에 사용된 재료와 장비는 재료표에 기재되어 있습니다.

1. 조직 절단 및 고정

  1. 조직 절단
    1. 운송 가방은 내관, 보조 용기, 외부 운송 용기, 생물위험 샘플 가방을 포함한 다층 포장으로 준비하세요. 내부 50mL 원심분리관에 4-[2-하이드록시에틸]-1-피페라지네에스폰산(HEPES) 1%와 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 포함한 저장 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지 30mL를 채웁니다.
    2. 채취한 전방 경골동맥(AT), 후경골동맥(PT), 비골동맥(PR>)을 각각 50mL 원심분리관에 넣어 50mL 원심분리관에 넣습니다. 수술실에서 조직 배양실로 얼음 캔을 옮겨.
      참고: 복제와 충분한 조직 보존을 위해 복제 및 추가 평가 또는 검증을 위해 충분한 조직을 확보하기 위해 채취한 샘플 길이는 최소 5cm가 권장됩니다.
    3. 각 동맥을 매체와 함께 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균 가위와 겸자를 사용해 과도한 혈관 주변 결합 조직을 제거하고, 동맥벽(안쪽 심폐막)만 남겨둡니다.
      참고: RNA 오염을 방지하기 위해 RNase 비활성화 용액으로 닦은 생체 안전 캐비닛에서 조직을 다루고 다듬어야 합니다. 멸균 메스와 겸자를 사용하세요; 샘플 사이에는 멸균되고 뉴클레아제가 없는 물로 잔여물을 제거하고 70% 에탄올로 꼼꼼히 닦아내세요.
    4. 새 페트리 접시에서 둘벡코의 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 다듬어진 동맥을 잠시 헹구세요. 멸균된 도마를 신선한 접시 안에 넣고 동맥을 그 위에 옮기세요.
    5. 수술용 칼로 동맥을 단면적으로 1cm 단위로 절단합니다.
  2. 조직 고정 및 저장
    1. 액체 질소(LN2)에서 냉동 보존을 위해 두 개의 구간을 냉동하여 향후 단백질/RNA 연구를 위해 보관합니다.
    2. 나머지 구간은 10% NBF가 들어 있는 15mL 튜브에 넣고, 1cm 동맥 구간은 4°C에서 24-48시간 고정합니다.
      참고: 10% NBF 사용을 권장합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용할 경우, RNA 손상을 최소화하기 위해 신선하게 준비하거나 중성 pH를 확인해 사용 전에 반드시 확인하세요.

2. 탈석화, 조직 처리 및 절절 절단

  1. 탈석화 용액을 준비하세요: 고형 에틸렌-디아민-테트라아세트산(EDTA)을 RNA 안정화 용액(RSS)에 10%(w/v)로 녹입니다. 여과는 필수가 아닙니다. 수산화나트륨(NaOH) 펠릿으로 pH를 9.2로 조절해 EDTA를 완전히 녹인 후, 10M HCl을 넣어 5.2로 낮추는데, 이는 RSS의 일반적인 작동 pH이며 RNA 무결성 유지에 도움이 됩니다.
  2. 고정된 휴지를 PBS에서 간단히 세척해 보세요. 각 샘플을 탈석화 용액이 담긴 15mL 튜브로 옮기고 4°C에서 72시간 동안 저어줍니다.
  3. 탈석이 완료되면 샘플을 PBS(2× 5분)로 세척합니다. 휴지를 카세트에 넣고 4시간 처리 프로그램을 이용해 휴지 프로세서에 넣으세요.
  4. 조직 블록당 여러 동맥 구간을 삽입하세요. 슬라이드 백에 제한 조직 구역을 표시하고 모든 부위가 이 영역 내에 있는지 확인하세요.
  5. 과도한 파라핀을 다듬으세요. 5 μm 크기에서 마이크로토옴과 저프로파일 블레이드로 블록을 절개하고, 조직 조각을 표시된 슬라이드 영역 내에 장착합니다.
    참고: 처음 몇 개의 절편은 얼굴을 맞은 후 버리고 이후 조직 절편을 수집하세요. RNase 프리 브러시를 사용하고, 샘플 배치 사이에 물욕을 청소하세요.
  6. 블록당 최소 네 개의 직렬 섹션을 준비하여 다양한 얼룩과 디지털 공간 프로파일링(DSP) 실험을 수행하세요. 슬라이드는 사용 전까지 4°C에서 보관하세요(이상적으로는 6개월 <).

3. RNAscope 현장 잡종화(ISH) 및 조직학적 염색

  1. RNAscope ISH
    1. 슬라이드를 60°C의 건조 오븐에서 하룻밤 구워 슬라이드와의 조직 접착을 강화합니다.
    2. 탈파라핀화: 자일렌에 잠기(3분 × 5분), 이어서 100% 에탄올(2분 × 3분)을 투여합니다. 60°C에서 7분간 드라이슬라이드를 사용하세요.
    3. 제조사 프로토콜에 따라 RNAscope 2.5 HD Red ISH 분석법을 수행하세요. 3%H-2O2 로 내인성 과산화효소를 RT에서 10분간 차단; 증류수(DI)로 씻어내세요.
    4. 슬라이드를 미리 가열한 100 °C 회수 완충제(DI 물에 1:10 희석)에서 15분간 인큐베이팅합니다(스티머에서 최대 24장의 슬라이드 랙을 위해 200 mL 회수 완충액을 사용), 100% 에탄올에 5회 담근 후 60 °C에서 7분간 건조 슬라이드를 사용합니다. 소수성 장벽 PAP 펜을 사용해 조직 주변에 소수성 장벽을 만듭니다.
    5. 슬라이드를 하이브리다이제이션 오븐 선반에 놓고, 각 슬라이드에 200 μL 소화 효소 보충제(판매자가 드로퍼 병에 미리 희석한 상태)를 넣은 후 40°C에서 15분간 배양합니다. 슬라이드를 DI물에 두 번 헹구세요.
    6. 슬라이드에 양성 대조 프로브 Human Ppib을 적용하고 40°C에서 2시간 배양합니다. 슬라이드를 워시 버퍼에 2번 세척하세요.
    7. 순차적 증폭 수행: AMP1을 40°C에서 30분간 투여; AMP2 40°C에서 15분간 투여; AMP3는 40°C에서 30분간 사용; AMP4 40°C에서 15분간 투여; AMP5를 RT로 30분간 사용; 그리고 AMP6를 RT로 15분간 사용했습니다. 그 사이에 2분씩 세탁하세요.
    8. Fast Red 작업 용액을 추가하고 RT에서 10분간 배양하세요. 물을 빼고 슬라이드를 DI물에 담근 다음, 신선한 DI에 5번 담가세요. Ppib 양성 대조군 반점이 점진된 붉은 점으로 나타나는지 확인하세요.
    9. 길스 헤마톡실린 1개로 교환 스테인을 하고, DI 물 교환 2회에 5회 담그고, 0.02% 수산화암모늄에 블루를 담그고, DI 물 교환 2회 중 5회 담그세요. 핵이 파란색으로 염색되고 조직 형태가 보존되는지 확인하세요. 슬라이드는 하룻밤 말리게 한 후 마운트 매체로 덮어주세요.
  2. 알리자린 레드 S 염색
    1. 추가 직속 절편의 경우, 3.1.2 단계에서 탈파라핀 및 재수화 과정을 반복합니다.
    2. 알리자린 레드 S의 작동 용액 pH가 4.1-4.3인지 확인하세요.
    3. 알리자린 레드 S에 슬라이드를 30-60초간 담그거나, 칼슘 침전물이 주황빛 붉은색으로 변할 때까지 보관하세요.
    4. 과도한 염색 염료를 털어내세요. 100% 아세톤에 20번 빠르게 담근 뒤, 아세톤:자일렌에 20번 담근 후 1:1로 탈수하세요.
    5. 슬라이드를 두 번의 신선한 자일렌 목욕에 각각 3분씩 넣어 청소하세요. 커버슬립에 장착 매체를 사용하세요.

4. GeoMx DSP 슬라이드 준비 및 ROI 선정

  1. 시작 전에 모든 장비와 용기를 RNAse 비활성화 용액으로 세척하고, RNA 오염을 방지하기 위해 DEPC 처리된 물로 건조하거나 세척하세요. 공간 RNA 프로파일링 분석법 지침을 따르세요.
  2. 슬라이드를 60°C의 건조 오븐에서 하룻밤 구워 슬라이드와의 조직 접착을 강화합니다.
  3. 탈파라핀 및 재수화: 자일렌에 3× 5분간 잠긴 후 100% 에탄올(2× 5분), 그리고 DEPC 처리수에 희석된 95% 에탄올을 5분간 담가. 슬라이드를 1× PBS로 1분간 옮기세요.
  4. 슬라이드를 100 °C 예열된 Tris/EDTA pH 9.0 항원 추출 완충제에 20분간 인큐베이션하고, 슬라이드를 1× PBS에 5분간 RT로 옮깁니다.
  5. 1.0 μg/ml 단백질효소 K를 예열한 상태로 15분간 인큐베이팅하고, 1× PBS에 5분간 RT에서 세척합니다.
  6. 슬라이드를 10% NBF(슬라이드당 200 μL)에 5분간 RT에서 포스트픽스하고, PBS에서 5분간 세척합니다.
  7. PBS에서 슬라이드를 제거하고, 종이 타월을 두드린 뒤, Kimwipe로 조직 주변의 과도한 액체를 닦아내고, 하이브리드화 스테인팅 랙에 넣으세요.
  8. 각 슬라이드에 200 μL 하이브리다이제다이션 용액(버퍼 W에 1:10 희석)을 추가하고 하이브리다이제이션 슬립을 적용합니다. 하이브리드화 챔버를 닫고 오븐에 넣은 후 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
  9. 식염수-나트륨 시트레이트 버퍼(SSC, 2×)에 슬라이드를 담그고, 하이브리드화 슬립이 5분 이내에 저절로 미끄러져 나가도록 합니다.
  10. 슬라이드를 4× SSC와 탈이온화된 포름아마이드가 같은 비율로 구성된 엄격한 세척 버퍼로 37°C에서 세척당 25분씩 세척합니다. 슬라이드는 2× SSC 버퍼에 세탁한 후 한 번 2분씩 세탁하세요.
  11. RT에 버퍼 W를 사용해 슬라이드를 30분간 막으세요.
  12. 조직을 1차 항체 용액(Rabbit anti-CD45)에 1시간 동안 습도 챔버 슬라이드 박스에 묻혀 RT 시에 넣고, 2× SSC 버퍼로 3회 세척합니다.
  13. 2차 항체 용액(염소 항토끼 IgG-AF647)을 1시간 동안 도포하고 2× SSC 버퍼에 세척합니다.
  14. 조직을 습도 챔버 슬라이드 박스에서 1시간 동안 RT 상태로 덮고, 2× SSC 완충액으로 세척합니다.
  15. 슬라이드를 2 μM Syto83 핵 마커에 10분간 염색하고, 버퍼 W에 희석하여 10분간 염색합니다.
  16. RNA 프로파일링 기기로 슬라이드를 스캔하여 형태학적 표지 염색을 시각화하세요. 각 동맥 조직의 석회화 병변 근위 및 원위 ROI를 선택하여 각 ROI의 층별 위치를 주석합니다.
    참고: 조직 절편에 하이브리다이제이션 슬립을 적용할 때 기포 형성을 방지하기 위해 주의하세요.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 제시된 프로토콜은 경골동맥 수령부터 형태학과 RNA 무결성을 모두 보존한 TMA 슬라이드를 생성하여 공간 전사체학 분석을 수행하는 데 연구자들을 안내합니다. 또한 동맥 내 칼슘 침착을 시각화하는 조직학적 방법, 형태학적 표지 염색, ROI 선택 전략도 상세히 설명합니다.

그림 1에서는 동맥이 10% NBF에 고정되어 있습니다(2단계). NBF는 조직에 빠르게 침투하여 RNA 분해를 최소화하며, 인산염 완충제(pH 7.0)는 고정 과정에서 형성된 개미산을 중화하여 pH가 6 이하로 떨어지지 않도록 합니다. 프로파일러 기기에서 ROI가 선택된 후에는 다음 단계들이 이 프로토콜에서 시연되지 않습니다. 간단히 말해, 자외선(UV) 레이저가 각 ROI를 정밀하게 밝히며 바코드 태그가 부착된 올리고뉴클레오타이드를 방출합니다. 이 올리고들은 nCounter 또는 차세대 시...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 NanoString GeoMx DSP에서 공간적 전사체 프로파일링을 위해 석회화된 인간 경골동맥을 준비하는 데 필요한 단계를 상세히 설명합니다. 경골동맥은 모든 혈관과 마찬가지로 동심원으로 이루어진 막막, 중간, 폐막층을 가지고 있으며, 각각 손상과 수리를 조율하는 독특한 세포 집단을 가지고 있습니다. 이 층의 구조를 유지하는 것은 층 분해 전사체 분석에 필수적이지만, 종종 간과되는 여러 준비 단계가 그 목표를 저해할 수 있습니다.

동맥 조직을 확보한 후에는 복엽 주위 지방 조직을 제거하되 폐막은 그대로 남겨야 합니다; 이로 인해 ROI 배치를 위한 공간적 틀 역할을 하는 연속적인 선박 벽이 보존됩니다. 중요한 단계는 RNA 품질을 유지하는 것입니다. 우리는 10% NBF에서 조직을 고정하는데, 이는 인산염 완충제(pH 7.0)가 고정 과정에서 생성된 개미산을 중화시켜 산 촉매에 의한 RNA 가수분해를 제...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 VA 퓨젯 사운드의 시드 보조금, VA 공로상 I01 BX004975-02, 그리고 자원 및 VA 퓨젯 사운드 헬스 케어 센터의 시설 이용으로 지원받았습니다.  이 작업은 저자의 것이며 재향군인부나 미국 정부의 입장이나 정책을 반드시 반영하지는 않습니다.  워싱턴 대학교 조직학 및 영상 코어(HIC)에서 제공하는 영상 서비스에 감사드립니다.  워싱턴 대학교의 DSP 실험에 대한 지도를 주신 슈리람 아킬레시 박사님과 MANTIS 연구소 UW 공간생물학 코어 그룹에 감사드립니다.  또한 워싱턴 대학교 당뇨병 연구센터의 니시 이바노프에게 조직학적 염색 연구를 통해 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
둘벡코 변형 독수리 미디엄(DMEM), 고포도당, 피루빈산 써모피셔 사이언티브11995065
4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지네에탄술폰산(HEPES) 완충액, 1 M써모피셔 사이언티브15630080
페니실린-스트렙토마이신(P/S), 10,000 U/mL써모피셔 사이언티브15140122
10% 중성 완충 포르말린(NBF)밀리포어 시그마65346-M
에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA)밀리포어 시그마3620
RNAlater 안정화 솔루션써모피셔 사이언티브AM7024RNA 안정화 솔루션(RSS)
과산화수소 (H2O2)어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사322335
표적 회수 해법어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사322001
프로테아제 플러스어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사322331소화 효소 보충제
DapB (음성 대조군)어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사310043
RNAscope 워시 버퍼 (RNAscope 2.5 HD Red ISH 검사 키트)어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사320058
AMP1어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324511
AMP2어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324512
AMP3어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324513
AMP4어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324514
AMP5 레드어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324515
AMP6 레드어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324516
패스트 레드 A어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사324517
인간 PPIB어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사313901
길' S 헤마톡실린밀리포어 시그마GHS132
항원 채취, Tris/EDTA pH 9써모피셔 사이언티브00-4956-58
프로테인나제 K써모피셔 사이언티브AM2546
하이브리다이제이션 솔루션-Hs WTA나노스트링121401102
하이브리스립교종 슬립
하이브리다이제이션 용액-버퍼 R나노스트링121300313
래빗 항CD45 세포 신호 전달1317
버퍼 W나노스트링121300313
염소 항토끼 IgG-AF647잭슨 면역연구소111-605-144
마우스 안티-SMA-AF488 써모피셔 사이언티브53-9760
Syto83 써모피셔 사이언티브S11364
수술용 칼날BD 생명과학371110
슈퍼프로스트  플러스 현미경 슬라이드써모피셔 사이언티브1255015
ImmEdge 펜
미세토름 블레이드써모피셔 사이언티브22-500-125
RNase 제거RNase 불활성화 용액
<스트롱>장비
HybEZ 하이브리다이제이션 오븐  어드밴스드 셀 디그노스틱스 주식회사321710
GeoMx 디지털 공간 프로파일러나노스트링 모델: GeoMx DSP
데이터 접근 플랫폼: GeoMx DSP 제어 센터 (버전 3.1.2.12)		채널 스캔 설정: FITC의 경우 폭발 시간은 300ms이며, 형광체는 AlexaFluro 488입니다; 채널 Cy3의 경우 노출 시간은 50 ms이며, 형광체는 Syto83입니다; 채널 Cy5의 경우 노출 시간은 300 ms이며, 형광 포어는 AlexaFluor 647입니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNARNAscope

관련 논문