이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

연구 논문

척수 손상 쥐에서 침술에 관여하는 신경굴린1-ErbB4 신호 전달이 척수 손상 쥐에서 미엘린 재생을 촉진합니다

450 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69166

⸱

2026년 2월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 SCI 쥐 모델에서 전기침술이 미엘린 재생에 미치는 영향을 조사하고, Neuregulin1(NRG1)-ErbB4 신호 전달 경로가 이 과정에서 역할을 하는지 검증하는 것을 목표로 합니다.

초록

척수 손상(SCI)은 종종 심각한 신경학적 장애를 초래하며, 수초 수리는 신경 기능 회복에 있어 매우 중요한 단계입니다. 전기침술(EA)은 전통 침술과 전기 자극을 결합한 치료법으로, 신경 수리 분야에서 널리 적용되고 있습니다. 그러나 EA에 관여하는 구체적인 신호 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구는 SCI 쥐에서 EA가 미엘린 재생에 미치는 영향을 조사하고, Neuregulin1(NRG1)-ErbB4 신호 전달 경로가 이 과정에서 역할을 하는지 검증하는 것을 목표로 합니다. SCI 쥐는 T10 척추 마디의 동맥류 클립 손상으로 유도되었습니다. L5-6 척추간 사이에 폴리에틸렌(PE) 카테터를 삽입하고 피하에 고정하여 장기 약물 전달 시스템을 구축하였습니다. 외인성 NRG1과 그 길항제는 PE 카테터를 통해 격일로 투여되었으며, 주사당 용량은 20 μL였습니다. EA 치료는 Dazhui(GV14)와 Mingmen(GV4) 침술 지점에서 격일로 시행되었으며, 각 시술은 4주 연속 30분 동안 진행되었습니다. 결과는 EA 처리가 척수 조직에서 미엘린 기본 단백질(MBP)의 발현을 유의미하게 촉진하고 쥐의 뒷지 운동 기능을 개선한다는 것을 보여주었습니다. 더불어, 외인성 NRG1은 EA와 유사한 효과를 보였습니다. 결론적으로, NRG1-ErbB4 신호 전달 경로는 SCI 쥐에서 EA 유도 미엘린 재생에 중요한 역할을 합니다.

서론

SCI는 심각한 신경학적 결함을 초래하는 외상 질환으로, 일반적으로 운동 장애, 감각 상실, 자율신경 기능 장애로 나타나며, 전 세계 인구 백만 명당 연간 약 40-80건의 발생률을 보입니다. 손상 후에는 축삭 파열과 수초가 신경 신호 전도를 방해하는 주요 병리학적 특징입니다. 미엘린은 중추신경계(CNS)의 희소돌기교세포와 말초신경계(PNS)의 슈반 세포에 의해 형성되며, 그 완전성은 신경 신호의 빠른 전도에 매우중요합니다. 그러나 SCI 후 국소 미세환경에서의 염증 반응, 산화 스트레스, 교세포 흉터 형성은 미엘린 재생을 현저히 억제하여 만성 신경 기능 장애를 초래합니다5. 동시에 SCI 후 올리고돌기교구(OL)의 죽음은 축삭의 탈수초화를 초래하며, 이 과정은 만성적이고 지속적으로 진행됩니다. 연구에 따르면 인간과 동물 모델 모두에서 축삭 탈수초화가 미엘린 재생을 통해 효과적으로 복구될 수 있음이 입증되었습니다. 따라서 미엘린 복구를 촉진하는 전략을 모색하는 것이 SCI 치료의 핵심 방향 중 하나입니다.

침술은 고대 전통 의학 기법으로서 중국, 한국, 일본 등 여러 국가에서 임상 실무에 널리 적용되어 왔습니다 7,8. 전통적인 침술과 전기 자극을 결합한 EA는 임상 현장에서 널리 채택되었습니다. 점점 더 많은 증거가 EA가 다양한 질환에 치료 효과를 가지며, 특히 척수 손상 후 미엘린 재생을 촉진하는 데 효과가 있음을 보여줍니다. EA 치료 중 침 지점 선택은 매우 중요하며, 예를 들어 GV14와 GV49가 있습니다. GV14는 7번째 경추의 척추 돌기 아래, 척추 중앙선 근처에 위치하며, GV4는 2번째와 3번째 요추의 척추돌기 사이에 위치합니다. 이전 연구들은 염증성 신호 경로, 산화 스트레스, 신경영양 인자, 자가포식이 EA 유도 미엘린 복구에 역할을 한다는 것을 보여주었다 10,11,12. 더 나아가, GV14, GV4와 같은 특정 침술 지점이 EA 치료 중 미엘린 재생을 촉진하는 데 적극적인 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다13, 14, 15. 그러나 척수 손상 후 EA가 미엘린 재생을 조절하는 분자 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다.

NRG1은 표피 성장 인자 계열의 일원으로, 아미노 말단 영역을 기준으로 여섯 가지 유형(I-VI)으로 분류할 수 있습니다16. NRG1과 그 수용체 계열인 ErbB(ErbB1/2/3/4)는 신경 세포 이동, 분화, 재수초화, 시냅스 생성과 같은 신경계 발달과 수리에 중요한 역할을 합니다. PNS의 발달 과정에서 슈반 세포(SCs)는 신경세포의 축삭을 따라 증식하여 미엘린을 형성하며, NRG1-ErbB4 신호 전달 경로는 PNS 슈반 전구세포의 성숙에 중요한 역할을 한다17,18. 이전 연구들은 NRG1 신호 전달 경로가 신경 줄기세포의 슈반 세포로의 분화에 관여하며, SCI19 이후 신경세포의 미엘린 수리를 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 한 연구에서는 척수 손상 후 NRG1-ErbB4 신호 전달 경로가 올리고돌기세포 전구세포(OPCs)를 재수초화 전위가20인 슈반 유사 세포로 전환시키는 것을 보여준다. Alex 등은 인간이 유도한 다능성 줄기세포 유래 감각 신경세포와 쥐 슈반 세포의 공동 배양 시스템을 구축하여, 약물로 NRG1-ErbB 신호 전달 경로를 차단하면 신경 수초화가 유의미하게 억제된다는 사실을 발견하여, 이 경로가 인간 감각 축삭 수초화 촉진에 직접적인 역할을 한다는 직접적인 증거를제공했다. 또 다른 연구에서는 EA 치료가 척수에서 NRG1 발현을 상향 조절하고 염증성 통증을 완화할 수 있음을 보여주었습니다22.

EA가 SCI에서 NRG1-ErbB4 신호 전달 경로에 미치는 영향에 대한 연구는 제한적이며, 그 근본 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 본 연구는 GV14 및 GV4 침술 지점에 EA 자극을 투여함으로써 NRG1-ErbB4 신호 전달을 조절할 수 있는지 조사하고, SCI 쥐에서 미엘린 재생과 신경 기능 회복을 촉진하는 잠재적 역할을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 SCI 쥐에서 NRG1-ErbB4 신호 전달 경로와 EA 유도 미엘린 재생 간의 관계를 처음으로 조사한 연구로, SCI에 대한 새롭고 효과적인 치료 전략 개발에 대한 실험적 증거를 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

실험 기간 동안 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 윤리 지침을 준수했습니다. 실험 프로토콜과 설계는 쿤밍 의과대학 동물실험위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. KMMU2021051) 그리고 대학의 동물 연구 지침에 따라 진행되었습니다. 성체 수컷 스프래그-도울리 쥐(8주, 몸무게 250-270g, n = 60)는 쿤밍 의과대학(중국 윈난성)에서 채취하였습니다.

동물 조리

동물들은 일정한 습도, 적당한 온도, 12시간의 빛과 어둠 주기가 있는 통제된 환경에서 사육되었습니다. 동물들은 무작위로 11개 그룹에 배정되었습니다: 샴 수술군(S, n = 6), SCI 그룹(M, n = 6), EA 처리군과 함께한 SCI (M + EA, n = 6), NRG-1β 처리군과 함께하는 SCI 그룹(M + NRG-1β, n = 6), 5% DMSO 용매군과 함께한 SCI 그룹(M + D, n = 6), PD158780 억제제 포함 SCI 및 NRG-1β 처리군(M + PD+NRG-1β, n = 6), PD158780 억제제 및 EA 처리군 SCI (M + EA + PD, n = 6), 용매 및 EA 처리군 SCI (M + EA + D, n = 6), shRNA 및 EA 처리군 SCI (M + EA + shRNA, n = 6), 비표적 shRNA 및 EA 처리군 포함 SCI (M + EA + NC, n = 6), shRNA 처리군 SCI (M + shRNA, n = 6), SCI 및 shRNA 처리군 (M + shRNA, n = 6). 현재 표본 크기는 유사한 모델과 개입 사례를 바탕으로 결정되었으며, 이 수치에서 일관되게 유의미한 효과를 보여왔습니다. 더불어, 표본 크기에도 불구하고 주요 결과에서 통계적으로 견고하고 유의미한 차이가 관찰되어 보고된 결과에 대한 신뢰를 강화했습니다.

SCI 쥐 모델

야사르길 동맥류 클립(티타늄, 표준 닫힘 70g)을 사용해 클램프형 기법을 이용해 SCI 쥐 모델을 구축하였습니다(그림 1A). 쥐들은 2% 펜토바르비탈나트륨(30 mg/kg, 복막 내 투여)으로 마취된 후 수술대에 올려졌습니다. 등 피부에 3-4cm 절개를 한 뒤, 피하 조직과 근육을 층별로 해리하여 T9-11 흉추 돌기와 척추궁을 노출시켰습니다. 혈관 클립을 사용해 T10 흉추돌기와 척추궁을 제거하여 척수를 완전히 노출시켰습니다. 야사르길 동맥류 클립은 T10 전체 구간에 수직으로 배치되어 60초 체류 후 빠르게 방출되었습니다. 이 모델은 다음 증상 중 두 가지 이상이 관찰될 경우 성공으로 간주되었습니다: (1) 신체의 경련성 떨림, (2) 꼬리 흔들리는 반사, (3) 척수에 보이는 검은 꼬임 자국. 적절한 지혈을 확인한 후, 절개 부위를 소독하고 봉합했습니다. 가짜 수술군에서도 같은 절차가 수행되었으나, 척수가 고정되지 않았다. 수술 후, 쥐들은 수분 보충을 위해 복막 내 정상 식염수(3mL)를 투여하고, 감염 방지를 위해 3일 연속으로 아침과 저녁에 각각 100,000단위의 페니실린(복막 내 투여)을 투여했습니다. 자발적 배뇨가 회복될 때까지 수작업 배뇨 보조가 제공되었습니다(하루 2회).

쥐 척강내 튜브 및 약물 전달

Storkson 등(23)의 방법에 따라 SCI 모델 유도 1주 전에 쥐의 지주막하 공간에 카테터를 삽입하였습니다. 마취 후 쥐들은 수술대에 고정되었고, L5-6 척추간 공간이 노출되었습니다. 19G 바늘을 사용해 경막과 지미막을 수직으로 관통했습니다. 바늘은 약 1-2mm 앞으로 나갔고, 거미막을 뚫고 나온 후 공간감이 느껴졌으며, 이어서 뇌척수액이 맑게 흐르는 것이 느껴져 성공적인 천공을 나타냈다. PE-10 카테터(폴리에틸렌, 내경 0.38mm, 외경 1.09mm)가 천자 바늘을 따라 지주막하 공간에 삽입되었습니다. 카테터는 약 3cm 길이로 앞으로 나아졌으며, 카테터 끝은 L3 척추체 근처에 위치했습니다. 삽입 과정에서 쥐들에서 꼬리 흔들리기와 뒷다리 경련이 관찰되었고, 뇌척수액이 카테터를 통해 흘러나와 카테터가 지주막하 공간 내에 있음을 확인했다.

NRG-1β와 PD158780 모두 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 후 인공 뇌척수액(ACSF)으로 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.5% 이하로 유지하였습니다. 최종 작동 농도는 NRG-1β는 20 nM, PD15878024는 20 μM이었습니다. SCI 후 2일째, M + NRG-1β 그룹의 쥐들은 격일로 20 μL NRG-1β 뇌막내 주사를 받았습니다. M + EA + PD 그룹의 쥐는 EA 치료 2시간 전에 20 μL PD15878025 시절 피내로 투여되었습니다.

EA 치료

수술 후3일째 에 쥐를 GV14와 GV4 침점에 고정하여 전기침술(EA) 치료 테이블에 고정시켰습니다(그림 1B). 이 지점들에 2개의 침(0.25mm x 13mm)을 3-4mm 깊이로 삽입하였다. EA 치료는 희소-조밀한 파동 패턴(희소파는 2Hz, 밀도는 10Hz, 주파수 비율은 1:5)을 가진 전기침술기구를 사용하여 시행되었다26. 출력 강도는 30분 동안 5(약 0.5 mA)로 설정되었으며, 격일로 진행되었습니다.

행동 평가

운동 기능은 수술 후 0일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 시점에서 사지의 움직임, 보행, 협응력, 발 위치를 평가하는 Basso, Beattie, Bresnahan(BBB) 척도27을 사용하여 평가되었습니다( 그림 2D). BBB 척도는 0(완전 마비)에서 21(정상 보행 표시)까지 다양합니다. 모든 평가는 실험 그룹 배정에 눈을 가리킨 두 명의 연구자가 독립적으로 수행하였습니다.

샘플 채취

실험 종료 후, 마취된 쥐들은 조직 채취를 위해 해부 플랫폼에 고정되었다. 복강을 열어 횡격막이 완전히 노출되었고, 혈관 손상을 막기 위해 홍채 가위로 조심스럽게 절개되었습니다. 그 후 양쪽 늑골 가장자리를 따라 갈비뼈를 열어 심장을 노출시킨 후, 좌심실 끝에 바늘을 삽입한 후 약 300-400 mL의 미리 냉각된 PBS를 빠르게 관류하여 전신 혈액을 정화시켜 우심방에서 맑은 체액이 흐르도록 했습니다. 분자 단백질 분석을 위해 이 단계에서 관류를 중단하고 척추 기둥을 해부했습니다. 인접한 갈비뼈와 근육을 제거해 척추뼈를 노출시킨 후, T10 마디를 찾았고, T10에서 앞쪽과 후쪽 약 1cm 떨어진 척수 마디를 홍채 가위로 채취한 후 액체 질소에 급동하여 -80 °C에 보관했습니다. 형태학적 검사를 위해 PBS 후 관류를 4% 파라포름알데히드로 전환했으며, 근육 수축과 몸통의 경직으로 성공적으로 고정됨을 나타냈습니다. 같은 척수 마디는 조직 구조를 보존하기 위해 신중하게 해부한 후, 4% 파라포름알데히드에 48시간 동안 고정하였습니다.

헤마톡실린과 에오신 염색

척수 파라핀 절편은 60°C 오븐에 넣어 30분간 예열했습니다. 탈면: 자일렌 I을 15분간 사용한 후 자일렌 II를 15분간 사용했습니다. 수분 보수: 100% 에탄올로 2분간 처리한 뒤, 95% 에탄올로 2분간 처리하고, 이어서 80% 에탄올을 2분, 이어서 70% 에탄올을 2분간 처리합니다. 마지막으로 5분간 증류수를 마셨습니다. 헤마톡실린 염색은 7분간 시행한 후 증류수로 헹구어 잔여 염색액을 제거했습니다. 1% 염산 알코올에서 3초간 분별한 후, 증류수로 세척하여 잔여 염색 용액을 제거하였습니다. 5% 암모니아 물로 2분간 블루잉을 한 후, 남은 블루잉 용액을 씻어냈습니다. 30초간 이오신 염색을 한 후, 증류수로 헹구어 잔여 염색액을 제거했습니다. 절편 탈수는 70% 에탄올로 10초, 80% 에탄올로 10초, 마지막으로 100% 에탄올로 30초간 진행되었습니다. 정화는 자일렌으로 5분간 처리했습니다. 장착 후 슬라이드는 자연 건조되었고, 건조 후 이미지를 촬영했습니다.

럭솔 패스트 블루 스테인팅

각 절면은 각각 10분간 자일렌으로 2회 왁싱을 한 뒤, LFB 미엘린 염색액으로 염색한 후 37°C에서 하룻밤 배양했습니다. 다음 날, 90% 에탄올을 사용해 과도한 염색 용액을 제거했습니다. 절편들은 10초간 럭솔 차별용액(C0631S)에서 분별한 후, 75% 에탄올에 30초간 담가 회색질이 맑아질 때까지 분별했다. 마지막으로 1분간 에오신 염색 용액으로 해당 구역을 카운터 스테인했습니다.

서부 블롯팅

단백질 샘플은 물에 5분간 끓였습니다. 먼저 총 5 μL의 단백질 마커를 전기영동 겔에 적재한 후, 시험 단백질 샘플을 순차적으로 적재하였습니다. 전기영동은 마커 밴드가 명확히 분리될 때까지 80V에서 시작되었고, 이후 전압을 130V로 올리고 전기영동이 완료될 때까지 유지되었습니다. 미리 절단된 PVDF 막을 메탄올에서 1분간 활성화한 후 필터 페이퍼 위에 올려놓고 준비된 젤과 겹쳐 놓았습니다. 단백질 전달은 300 mA의 일정 전류로 수행되었으며, 분자량에 따라 전송 시간은 조정되었습니다(± 10분). 이식 후 PVDF 막을 인큐베이션 박스에 넣고 TBST 완충제로 5분간 헹군 후, 상온에서 5% 탈지우유로 셰이커에 2시간 동안 차단했습니다. 이후 막은 4°C에서 4°C에서 1차 항체(GAPDH(1:2000), 튜불린(1:2000), NRG1(1:1000), ErbB4(1:1000), MBP(1:1000) 등 1차 항체로 각각 5분씩 TBST 완충제로 3회 세척하여 인큐베이션에 넣었습니다. 다음 날, 막을 TBST 완충제로 3회 각각 5분씩 세척한 후, 2차 항체인 염소 항(염소 항 토끼제, 1:4000)과 함께 실온에서 셰이커 위에서 2시간 배양했습니다. TBST로 세척한 후, 화학발광을 이용해 단백질 밴드를 시각화하였습니다. 워싱 워싱 이미지를 ImageJ 소프트웨어에 가져오고, 50픽셀의 롤링 볼 반경을 사용해 배경 뺄셈을 수행합니다. 기울어진 띠의 경우, 분할선 도구를 사용해 띠를 곧게 펴세요. Rectangle 도구를 사용해 목표 띠를 선택하고 Plot Lanes 를 선택하여 띠의 그레이스케일 값을 시각화하여 밀도 프로파일을 생성하세요. 매직 완드 도구를 사용해 피크를 구분하고 그레이스케일 값을 추출하세요. 데이터를 저장한 후에는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 막대 그래프를 생성합니다.

면역형광

파라핀 단면은 각각 10분간 자일렌으로 2회 탈왁스된 후 등급별 에탄올 시리즈로 재수화되었습니다. 항원 채취는 5% 구연산 용액에 절편을 15분간 끓인 후, 10% 염소 혈청으로 2시간 동안 차단하는 방식으로 수행되었습니다. 절편들은 다음 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이팅되었습니다: 마우스 단클론 NRG-1(1:200), 토끼 단클론 ErbB4(1:300), 인간 단클론 MBP(1:300). 0.1% Triton X-100(PBST)이 함유된 인산염 완충 식염수로 각각 10분간 세척한 후, 절편들은 다음 2차 항체로 1시간 동안 어둠 속에서 배양했습니다: FITC 표지된 염소 항생쥐 IgG(1:500), FITC 표지된 염소 항-토끼 IgG(1:500), FITC 표지된 염소-반인간 IgG(1:500). 각 섹션은 각각 10분씩 PBST로 3회 세척한 후, 형광 신호를 보존하기 위해 안티페이드 시약으로 고정했습니다. 슬라이드는 어두운 곳에서 4°C로 보관되었습니다. 형광 현미경으로 10배 대물렌즈 아래에서 표적 세포를 찾은 후, 40배 렌즈로 전환하여 형광 영상을 포착합니다.

실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

ErbB4와 기준 유전자 GAPDH의 프라이머는 NCBI 웹사이트를 통해 설계되었습니다. 프라이머의 서열은 다음과 같았습니다: ErbB4 전방 프라이머: ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC; ErbB4 역프라이머: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; GAPDH 포워드 프라이머: CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; GAPDH 역프라이머: TACGCCAAATCCGTTCACA. 대두 크기의 척수 조직을 1.5mL 원심분리관에 넣고, 총 RNA 추출 시약 600 μL을 첨가했습니다. 조직은 완전히 균질화되어 얼음 위에서 5분간 배양한 후, 12,000 x g에서 4 °C에서 5분간 원심분리했습니다. 상청액은 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겨졌고, 400 μL의 클로로포름이 추가되었습니다. 혼합물은 12,000 x g에서 4 °C에서 5분간 원심분리되었습니다. 상청액은 다시 새로운 튜브로 옮겨졌고, 400 μL 이소프로판올이 추가되었습니다. 용액은 실온에서 10분간 배양한 후, 12,000 x g에서 10분간 원심분리했습니다. 상원액은 버려지고 RNA 펠릿은 75% 에탄올 400 μL로 세척되었다. 7,500 x g 원심분리 후 4 °C에서 5분간 원심분리한 후, 상청액을 버리고 튜브를 뒤집어 깨끗한 표면에서 자연 건조했습니다. RNA 펠릿은 60 μL 무RNA수에 용해되어 충분히 혼합한 후 RNA 농도를 측정하였다. RNA의 순도와 농도는 260nm와 280nm에서 흡수도를 측정하여 기록했으며, 260/280 비율이 약 2.0 정도로 되도록 했습니다. cDNA 합성을 위해 반응 1(gDNA 이레이저 포함)과 반응 2(역전사효소 포함)를 완전히 혼합하여 95°C에서 15분간 배양했습니다. 형광 PCR 반응 시스템은 cDNA 합성 키트 설명서에 따라 준비되었습니다. 2 μL 샘플을 23 μL PCR 반응 혼합물에 첨가하고, 형광 정량 PCR 키트 프로토콜에 따라 증폭이 수행되었습니다. 어닐링 온도는 60 °C로 설정되었으며, 증폭 조건은 다음과 같았습니다: 전변성: 95 °C에서 30초, 1 사이클; PCR 반응: 3초간 95°C, 30초간 60°C, 40사이클; 해리 곡선 분석은 다음과 같이 수행되었습니다: 95 °C에서 5초, 60 °C에서 30초, 이어서 60 °C에서 95 °C로 점차 상승하며 연속 형광 신호 획득을 수행했습니다. Ct 값은 Bio-Rad 컴퓨터 소프트웨어를 사용해 측정 및 계산했으며, 상대적인 mRNA 수치는 2-ΔΔCt 방법으로 측정하였습니다.

안전 및 취급 지침

파라포름알데히드 고정: 파라포름알데히드는 환기가 잘 되는 배기구 후드에서만 사용하세요. 항상 마스크, 장갑, 실험복, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 파라포름알데히드 용액은 직사광선과 열원에서 떨어진 밀폐된 용기에 보관하세요. 쿤밍 의과대학의 실험실 안전 지침에 따라 폐기물을 유해 폐기물에 보관하여 폐기물 처리합니다.

DMSO 해결책: DMSO는 피부를 통해 흡수되어 체내에 들어갈 수 있습니다. 핸들링 시 장갑과 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. DMSO는 강한 산화제가 닿지 않는 실온의 밀봉 용기에 보관하세요. 쿤밍 의과대학의 실험실 안전 지침에 따라 DMSO를 유해 폐기물 용기에 폐기하십시오.

펜토바르비탈 마취: 펜토바르비탈은 규제 약물이며 허가된 인원만 다루어야 합니다. 취급 중 우발적인 노출을 피하고 사용 시 적절한 환기를 확인하세요. 적절한 보호 장비를 착용하세요. 펜토바르비탈은 허가된 인력의 감독 하에 실온의 잠긴 캐비닛에 보관하세요. 쿤밍 의과대학의 규제 물질 지침을 준수하여 펜토바르비탈 폐기물을 처리하고, 적절한 사용 승인과 폐기물 처리 절차를 준수해야 합니다.

일반 폐기물 처리: 모든 유해 화학물질과 시약은 쿤밍 의과대학의 실험실 관리 지침에 따라 폐기되어야 합니다. 모든 폐기물은 적절히 라벨링되어 안전한 용기에 보관되어 안전하게 처리되도록 하세요.

통계 분석

모든 실험은 3회 이상 진행되었습니다. 대상 단백질의 밴드 밀도 값은 그룹 간 비교를 용이하게 하기 위해 대조군과 정규화되었습니다. 데이터는 중간값(4분위 범위) 또는 평균 ± 표준편차로 제시되며, n은 쥐 수를 나타냅니다. 정규분포 데이터의 경우, 그룹 간 유의한 차이를 일방향 분산분석(ANOVA)으로 평가하였다. 비정규분포 데이터의 경우, 그룹을 비교하기 위해 Kruskal-Wallis H 검정을 적용하였습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

H&E 염색과 BBB 점수 측정은 EA가 SCI 쥐에 미치는 보호 효과를 입증합니다

H&E 염색을 통해 척수 후방 뿔 세포의 형태와 구조를 조사하였다(그림 2D). H&E 결과는 그룹 S에서 후방 뿔 세포가 깔끔하게 배열되어 있으며, 세포 윤곽이 명확하고 핵이 중심에 위치함을 보여주었다. 반면, M군에서는 후방 뿔 세포 수가 감소했고, 세포 배열이 불규칙하게 형성되었으며, 공포, 교세포 과형성, 척수강 형성이 나타났다. 후후면 뿔 형태의 손상과 공동화는 M + EA 및 M + EA + D 그룹에서 M 그룹에 비해 유의하게 완화되었습니다. 그러나 M + EA + PD 그룹에서는 M + EA 그룹과 비교했을 때 후후뿔의 부상 후 공동화가 유의미하게 개선되지 않았으며, M그룹과 유사한 형태학적 손상을 보였습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

본 연구는 EA 치료가 척수손상 후 척수 공동화 및 탈수초화를 완화하고, MBP 단백질 발현의 상향 조절을 통해 재수초화를 촉진하고, 그 결과 쥐의 뒷지 운동 기능을 개선한다는 것을 입증합니다. 더 나아가, 우리는 NRG-1/ErbB4 신호전달 경로가 신경 재수초화의 중요한 매개체이며, EA가 SCI 쥐에서 후지 운동 기능의 재수초화와 회복을 촉진하는 잠재적 치료 기전임을 확인했습니다.

SCI의 신경 전도는 여러 요인에 의해 방해받아 손상 부위의 신경학적 기능 장애를 초래합니다28. 척추손상 후 신경 괴사, 탈수초, 재수초화, 염증 등 주요 병리학적 변화가 신경학적 결손에 기여합니다29,30. 재수초화는 SCI 말기 신경 기능 회복에 중요한 요인이며, 쥐의 후지 운동 기능 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구에 기여해 주신 저자들께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학기금(NSFC 81960817, 82260387)과 윈난성 과학기술부 과학기술계획 기초연구특별프로그램(202301AS070020)의 재정 지원을 받았습니다. 쓰촨 북부 의과대학 과학연구개발 프로젝트 (CBY22-QNA20)

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BCA 단백질 검출 키트 비요타임 바이오테크놀로지컬P0012S정량적 단백질 분석
전기침 기기화투오 전기침술기구, SDZ-V, 쑤저우—치료 장비
FITC 표지 염소 반인간 IgG비요타임A0556형광 2차 항체
FITC 표지 염소 항생쥐 IgG비요타임A0568형광 2차 항체
FITC 표지된 염소 항토끼 IgG비요타임A0562형광 2차 항체
형광 현미경올림포스——
인간 단클론 MBP앱캠AB209328특이항체
LFB 미엘린 염색 용액솔라비오G3240미엘린 피 염색
밀리포어 ECL밀리포어WBKLS0100검출 시약
마우스 단클론 NRG-1그리고 nbsp; 산타크루즈SC-57384특이항체
나노드롭 ND-1000랩테크—
NRG1-1 베타노보프로틴 테크놀로지 주식회사C753재조합 인간 NRG1-1 베타
PD158780글립바이오 기술GC15925표피 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나제 억제제
PE-10 전관벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니427401척추막내 주사
주사를 위한 페니실린 나트륨하얼빈 중징 생명공학 주식회사80451182수술 후 항감염 치료
토끼 단클론 ErbB4앱캠AB109273특이항체
RNAiso 플러스 키트타카라9109RT-PCR 시약
RT 시약 키트타카라RR037ART-PCR 시약
2차 항체비요타임 바이오테크놀로지컬—특이항체
펜토바르비탈 나트륨시그마-올드리치69020100동물 마취
야사르길 동맥류 클립렙스톡 인스트루먼트 GmbH—쥐 척수 손상 모델 구축

참고문헌

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
  3. Anjum, A., et al. Spinal Cord Injury: Pathophysiology, Multimolecular Interactions, and Underlying Recovery Mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  4. Fang, M., Chen, L., Tang, T., Qiu, M., Xu, X. The committed oligodendrocyte precursor cell, a newly-defined intermediate progenitor cell type in oligodendroglial lineage. Glia. 71 (11), 2499-2510 (2023).
  5. Hellenbrand, D. J., et al. Inflammation after spinal cord injury: a review of the critical timeline of signaling cues and cellular infiltration. J Neuroinflammation. 18 (1), 284(2021).
  6. Pukos, N., et al. Chronic demyelination and myelin repair after spinal cord injury in mice: A potential link for glutamatergic axon activity. Glia. 71 (9), 2096-2116 (2023).
  7. Birch, S., Robinson, N. Acupuncture as a post-stroke treatment option: A narrative review of clinical guideline recommendations. Phytomedicine. 104, 154297(2022).
  8. Jiang, K., Sun, Y., Chen, X. Mechanism Underlying Acupuncture Therapy in Spinal Cord Injury: A Narrative Overview of Preclinical Studies. Front Pharmacol. 13, 875103(2022).
  9. Wang, X., et al. Electroacupuncture at Dazhui (GV14) and Mingmen (GV4) protects against spinal cord injury: the role of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Neural Regen Res. 11 (12), 2004-2011 (2016).
  10. Li, S. S., et al. Electroacupuncture treatment improves motor function and neurological outcomes after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural regen res. 17 (7), 1545-1555 (2022).
  11. Liu, C., et al. Electroacupuncture promotes oligodendrocyte differentiation and myelin repair in a rat model of vascular dementia: Investigation of the mechanism from NF-κB-mediated inflammation. Neuroscience. 572, 21-34 (2025).
  12. Tong, T., et al. Electroacupuncture ameliorates chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and cognitive impairment through suppressing oxidative stress and neuroinflammation in rats. Brain Res Bull. 206, 110838(2024).
  13. Ahn, S. M., et al. Electroacupuncture ameliorates memory impairments by enhancing oligodendrocyte regeneration in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion. Sci Rep. 6, 28646(2016).
  14. Kong, Y., Yang, J., Fan, Y. Q., Wang, W. S., Zhang, Y. T. "Huayu Tongluo" moxibustion improves learning-memory ability and promotes myelin regeneration by regulating Sonic Hedgehog signaling pathway in vascular dementia rats. Zhen Ci Yan Jiu. 48 (6), 578-584 (2023).
  15. Chen, W. C., et al. Influence of electroacupuncture of Dazhui (EX-B2) and Mingmen (GV4) on NR2B expression in anterior horns of spinal cord in rats with acute spinal cord injury. Zhen Ci Yan Jiu. 44 (2), 95-101 (2019).
  16. Mei, L., Nave, K. A. Neuregulin-ERBB signaling in the nervous system and neuropsychiatric diseases. Neuron. 83 (1), 27-49 (2014).
  17. Birchmeier, C., Bennett, D. L. Neuregulin/ErbB Signaling in Developmental Myelin Formation and Nerve Repair. Curr Top Dev Biol. 116, 45-64 (2016).
  18. Chen, S., et al. Neuregulin 1-erbB signaling is necessary for normal myelination and sensory function. J Neurosci. 26 (12), 3079-3086 (2006).
  19. Bartus, K., et al. ErbB receptor signaling directly controls oligodendrocyte progenitor cell transformation and spontaneous remyelination after spinal cord injury. Glia. 67 (6), 1036-1046 (2019).
  20. Tao, F., et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem cells. 31 (1), 83-91 (2013).
  21. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  22. Wan, C., et al. Neuregulin1-ErbB4 Signaling in Spinal Cord Participates in Electroacupuncture Analgesia in Inflammatory Pain. Front Neurosci. 15, 636348(2021).
  23. Tseropoulos, G., et al. Immobilized NRG1 Accelerates Neural Crest like Cell Differentiation Toward Functional Schwann Cells Through Sustained Erk1/2 Activation and YAP/TAZ Nuclear Translocation. Adv Sci (Weinh). 11 (33), e2402607(2024).
  24. Luo, M., et al. Neuronal activity-dependent myelin repair promotes motor function recovery after contusion spinal cord injury. Brain Res Bull. 166, 73-81 (2021).
  25. Hesp, Z. C., Goldstein, E. Z., Miranda, C. J., Kaspar, B. K., McTigue, D. M. Chronic oligodendrogenesis and remyelination after spinal cord injury in mice and rats. J Neurosci. 35 (3), 1274-1290 (2015).
  26. Levy, G., et al. Gtf2i-encoded transcription factor Tfii-i regulates myelination via Sox10 and Mbp regulatory elements. Nat Commun. 16 (1), 8518(2025).
  27. Cescon, M., et al. Gut microbiota depletion delays somatic peripheral nerve development and impairs neuromuscular junction maturation. Gut Microbes. 16 (1), 2363015(2024).
  28. Ayar, Z., et al. The effect of low-level laser therapy on pathophysiology and locomotor recovery after traumatic spinal cord injuries: a systematic review and meta-analysis. Laser Med Sci. 37 (1), 61-75 (2022).
  29. Ghane, N., Beigi, M. H., Labbaf, S., Nasr-Esfahani, M. H., Kiani, A. Design of hydrogel-based scaffolds for the treatment of spinal cord injuries. J Mater Chem B. 8 (47), 10712-10738 (2020).
  30. Laskin, J. J., Waheed, Z., Thorogood, N. P., Nightingale, T. E., Noonan, V. K. Spinal Cord Stimulation Research in the Restoration of Motor, Sensory, and Autonomic Function for Individuals Living With Spinal Cord Injuries: A Scoping Review. Arch Phys Med Rehabil. 103 (7), 1387-1397 (2022).
  31. Li, G., et al. Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes Motor Functional Recovery by Enhancing Oligodendrocyte Survival and Differentiation and by Protecting Myelin after Spinal Cord Injury in Rats. Neurosci Bull. 36 (4), 372-384 (2020).
  32. Csomó, K. B., et al. A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats. J Vis Exp. (181), e63534(2022).
  33. Li, J. J., et al. Animal Models for Treating Spinal Cord Injury Using Biomaterials-Based Tissue Engineering Strategies. Tissue eng part b-re. 28 (1), 79-100 (2022).
  34. Coman, I., Barbin, G., Charles, P., Zalc, B., Lubetzki, C. Axonal signals in central nervous system myelination, demyelination and remyelination. J Neurol Sci. 233 (1-2), 67-71 (2005).
  35. Inouye, H., Kirschner, D. A. Evolution of myelin ultrastructure and the major structural myelin proteins. Brain Res. 1641 (Pt A), 43-63 (2016).
  36. Chen, X., Li, H. Neuronal reprogramming in treating spinal cord injury. Neural Regen Res. 17 (7), 1440-1445 (2022).
  37. Huang, S., et al. Protective Effect of Electroacupuncture on Neural Myelin Sheaths is Mediated via Promotion of Oligodendrocyte Proliferation and Inhibition of Oligodendrocyte Death After Compressed Spinal Cord Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1870-1881 (2015).
  38. Kang, Z., et al. Electroacupuncture promotes regeneration and repair of myelin sheath of corpus callosum in demyelination mice. Zhen Ci Yan Jiu. 45 (1), 1-7 (2020).
  39. Zhu, K., et al. Electroacupuncture Promotes Remyelination after Cuprizone Treatment by Enhancing Myelin Debris Clearance. Front Neurosci. 10, 613(2017).
  40. Lu, J. Y., et al. Effects of electroacupuncture at different acupoints on the histomorphology of neurogenic bladder and the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels in interstitial cells of Cajal in a rat model of suprasacral spinal cord injury. Ann Palliat Med. 9 (6), 3830-3838 (2020).
  41. Tu, W. Z., et al. The regulatory effect of electro-acupuncture on the expression of NMDA receptors in a SCI rat model. Life Sci. 177, 8-14 (2017).
  42. Ding, Z., et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 134, 111168(2021).
  43. Kataria, H., et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia. 66 (3), 538-561 (2018).
  44. Schmitd, L. B., et al. Deletion of murine Sarm1 results in a microenvironment that delays peripheral nerve regeneration after injury. Sci Transl Med. 17 (819), eadp9155(2025).
  45. Hu, X., et al. Pan-ErbB inhibition impairs cognition via disrupting myelination and aerobic glycolysis in oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (45), e2405152121(2024).
  46. Størkson, R. V., Kjørsvik, A., Tjølsen, A., Hole, K. Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat. J Neurosci Methods. 65 (2), 167-172 (1996).
  47. Rahimi-Movaghar, V., Jazayeri, S. B. When do we start Basso, Beattie, and Bresnahan assessment after experimental spinal cord injury. Acta Med Iran. 51 (8), 5183(2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

전침 치료신경 재생수초 기본 단백질뒷다리 기능혈위외인성 NRG1신호 경로
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.