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방법 논문

폐경 후 골다공증에서 RANKL/OPG 뼈 보호 메커니즘을 조사하기 위한 CLCF1 운동 유도 미오카인 프로토콜

595 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

2025년 11월 7일

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

이 논문에서

요약

이 기사에서는 폐경 후 골다공증에서 RANKL/OPG 축 조절을 통한 뼈 보호의 운동 유도 매개체로서 심장 자극 유사 사이토카인 인자 1(CLCF1)을 조사하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

초록

최근 연구에서는 심장 자극 유사 사이토카인 인자 1(CLCF1)이 근골격계 이점을 매개하지만 나이가 들면서 감소하는 운동 유도 "청소년 분자"로 확인되었습니다. 이 프로토콜은 면역-뼈 누화 메커니즘 을 통한 운동 매개 뼈 보호에서 CLCF1의 조절 역할을 조사하기 위한 체계적인 접근 방식을 설명합니다. 이 방법론에는 핵 인자-κB 리간드(RANKL)/오스테오프로테게린(OPG) 신호 전달 축의 수용체 활성화제에 대한 CLCF1의 영향을 밝히기 위한 임상 샘플 분석, 분자 특성화 기술 및 기능 분석이 포함됩니다. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 웨스턴 블로팅, CRISPR/Cas9 유전자 편집 및 공동 배양 시스템을 통해 이 프로토콜은 STAT1 매개 파골세포 억제 및 STAT3 매개 조골세포 촉진 을 통한 CLCF1의 이중 뼈 보호 작용을 보여줍니다. 설명된 방법을 통해 CLCF1 발현 패턴의 포괄적인 평가, 골밀도 매개변수와의 상관 분석 및 잠재적인 운동 모방 치료 개입의 기계론적 평가가 가능합니다. 주로 파골세포를 표적으로 하는 기존의 항흡수 요법과 달리 CLCF1 기반 개입은 재흡수를 억제하는 동시에 뼈 형성을 촉진하는 고유한 이점을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자에게 운동 유도 사이토카인 매개 뼈 대사 조절을 조사하기 위한 표준화된 절차를 제공하고 연령 관련 뼈 장애에 대한 표적 치료 개입의 개발을 촉진합니다.

서론

폐경 후 골다공증(PMOP)은 면역 체계 조절 장애가 병리학적 뼈 손실을 촉진하는 연령 관련 근골격계 쇠퇴의 패러다임적 예를 나타냅니다 1,2,3. 운동은 노화 관련 뼈 악화를 예방하기 위한 가장 효과적인 비약물적 개입으로 널리 인식되고 있지만, 운동으로 인한 뼈 보호의 기초가 되는 정확한 분자 메커니즘은 최근까지 파악하기 어려운 상태로 남아 있습니다4. 뼈 대사에 대한 현대적 이해는 전통적인 내분비학적 틀을 넘어 골격 항상성을 지배하는 복잡한 골면역 상호 작용과 운동 유발 미오카인을 포괄하도록 발전했습니다5.

최근 연령 관련 근골격계 쇠퇴를 방지하는 운동 유발 인자로서 심장자극군 유사 사이토카인 인자 1(CLCF1)이 확인된 것은 뼈-근육 누화를 이해하는 패러다임 전환을 나타냅니다6. 이 획기적인 발견은 이전에 알려지지 않은 분자 메커니즘을 통해 운동의 잘 확립된 뼈 보호 효과를 설명하며, CLCF1을 운동 유발 골동화작용의 핵심 매개체로 자리매김합니다7. CLCF1을 과발현하는 형질전환 마우스는 야생형 대조군에 비해 향상된 뼈 형성, 향상된 내당능 및 우수한 신체 성능을 보여주었으며6, 이는 CLCF1 보충이 잠재적으로 앉아서 생활하거나 이동성 장애가 있는 집단에서 운동 이점을 모방할 수 있음을 시사합니다.

운동 모방 치료는 운동 유발 CLCF1 동역학을 복제하는 약리학적 개입으로 정의되며, 분자 경로를 통해 신체 활동과 유사한 치료적 이점을 제공합니다8. 뉴로트로핀-1(NNT-1) 또는 B 세포 자극 인자-3(BSF-3)으로 지정되는 심장자극 유사 사이토카인 인자 1(CLCF1)은 인터루킨-6(IL-6) 사이토카인 슈퍼패밀리에 속하며 다발성 생물학적 기능을 나타냅니다8. 원래 척수 운동 뉴런 생존 및 발달에서 신경 영양 특성을 특징으로 하는 CLCF1의 역할은 운동 유도 미오카인으로서의 역할이 중요한 연구 영역으로 부상했습니다. 최근 임상 연구에서는 CLCF1이 뼈 건강 상태에 대한 바이오마커로 검증되었으며, 골다공증이 있는 폐경 후 여성에서 말초 혈액 단핵 세포의 CLCF1 단백질 수치가 건강한 대조군에 비해 크게 감소했음을 입증했습니다9. 이러한 연구는 여러 골격 부위에서 CLCF1 발현과 골밀도 사이에 양의 상관관계가 있음을 보여주었으며, CLCF1 표적 치료 개입의 번역 잠재력을 강화하는 임상 검증을 제공했습니다.

사이토카인은 가용성 섬모 신경영양 인자 수용체(sCNTFR) 및 사이토카인 수용체 유사 인자-1(CRLF-1)을 포함한 이종 수용체 복합체를 통해 작동하여 다양한 세포 반응을 조율합니다10,11. 최근의 기계론적 연구는 CLCF1이 뼈 흡수를 억제하고 뼈 형성을 동시에 촉진하는 이중 신호 패러다임을 밝혔습니다 2,6,7,9. 이 이중 작용은 차등 신호 변환기 및 전사 활성화자(STAT) 경로 활성화를 통해 발생합니다: STAT1 인산화는 핵 인자-κB 리간드(RANKL) 유도 핵 인자-κB(NF-κB) 신호 전달의 수용체 활성화제를 방해하여 파골세포 억제를 매개하는 반면, 조골세포의 STAT3 활성화는 알칼리성 포스파타제 및 오스테오칼신을 포함한 뼈 형성 마커의 발현을 촉진합니다.

급성 운동 반응이 만성 뼈 적응으로 어떻게 변환되는지 이해하는 것은 치료 개발에 여전히 중요합니다13. 단일 운동 시합 후 급성 CLCF1 상승은 기계론적 통찰력을 제공하지만, 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 반복되는 급성 반응은 누적 신호 전달 및 세포 적응을 통해 지속적인 뼈 보호 효과로 이어질 수 있습니다14.

골면역 병태생리학에서 CLCF1을 조사하는 이론적 근거는 B-림프구 조절에서 확립된 역할과 B 세포가 RANKL과 오스테오프로테게린(OPG)12,13의 중요한 생산자를 구성한다는 인식에서 비롯됩니다. 핵 인자-κB 리간드(RANKL)/오스테오프로테게린(OPG) 축의 수용체 활성화제는 파골세포 분화 및 골 흡수를 위한 중앙 조절 메커니즘 역할을 합니다14,15. 뼈 리모델링 조절을 통해 골격 항상성에 대한 조절 제어를 입증한 다른 IL-6 계열 구성원과 달리 CLCF1의 고유한 이중 뼈 보호 메커니즘은 우수한 치료 잠재력을 제공합니다 16,17,18.

기존 방법론에 비해 이 프로토콜의 장점에는 CLCF1 매개 뼈 대사 조절에 대한 중개 통찰력을 제공하기 위해 임상 상관 분석과 기계론적 세포 연구를 모두 통합하는 운동 골면역 조사에 대한 포괄적인 접근 방식이 포함됩니다. 이 프로토콜의 임상적 관련성은 CLCF1 수준이 생활 방식 개입을 통해 조절될 수 있다는 새로운 증거에 의해 더욱 강화되어 연령 관련 뼈 질환에 대한 실행 가능한 치료 표적으로 자리매김합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 기관 연구 윤리 위원회(프로토콜 #2024-CHSD-0156)의 승인을 받았으며 헬싱키 선언 원칙을 준수합니다. 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침(프로토콜 #2024-037)을 준수했습니다. 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했습니다.

1. 임상 샘플 수집 및 운동 중재 평가

  1. 참가자 모집 및 운동 이력 평가
    1. 폐경 후 최소 1년의 기간을 가진 55-75세의 폐경 후 여성을 모집합니다.
    2. 표준화된 신체 활동 설문지를 사용하여 지난 6개월 동안 신체 활동의 빈도, 강도, 유형 및 기간을 포함한 자세한 운동 이력을 평가합니다.
    3. WHO 운동 지침에 따라 참가자를 앉아서 생활하는 그룹(주당 < 150분), 중간 정도 활동적(주당 150-300분) 및 고활동성(주당 > 300분) 그룹으로 분류합니다.
    4. 약물 검토 및 동반 질환 스크리닝을 포함한 포괄적인 병력 평가 및 신체 검사를 수행합니다.
    5. APEX 소프트웨어 v4.5가 포함된 Hologic Discovery A 밀도계를 사용하여 이중 에너지 X선 흡수계(DXA) 측정을 얻으십시오. 척추 팬텀으로 매일 보정을 수행합니다. ISCD(International Society for Clinical Densitometry) 지침에 따라 포지셔닝 블록에 다리를 올린 상태로 환자를 바로 누운 자세로 배치합니다.
    6. 세계보건기구(WHO) 골다공증 기준(T-점수 ≤ -2.5 SD)에 따라 참가자를 분류합니다.
    7. 제외 기준 적용: 12개월 이내의 이전 항골다공증 요법, 면역억제 치료, 대사성 골질환, 이차성 골다공증 또는 운동 검사에 대한 금기 사항.
  2. 운동 유발 CLCF1 반응 평가
    1. EDTA 튜브에서 12시간 밤새 금식한 후 오전 8:00-10:00 사이에 기본 혈액 샘플을 수집합니다.
    2. 표준화된 급성 운동 프로토콜 구현: 최대 심박수 65-70%에서 45분 중간 강도 걷기. Karvonen 공식을 사용하여 최대 심박수를 계산합니다(220세)19. 가슴 스트랩 모니터 를 통해 지속적인 심박수 모니터링으로 전동 런닝머신에서 운동을 수행합니다. 목표 심박수를 달성하기 위해 경사 조절을 통해 걷기 속도를 3.5-4.5km/h로 유지합니다.
    3. CLCF1 동역학을 평가하고 일관된 수집 조건을 유지하기 위해 1시간, 4시간 및 24시간 시점에서 운동 후 혈액 샘플을 수집합니다.
    4. 후속 CLCF1 정량화를 위해 혈청 분취량을 -80°C에서 보관합니다. 검출 범위가 31.2-2000 pg/mL인 Human CLCF1 ELISA Kit를 사용하십시오. 시료를 분석 희석제로 1:2로 희석합니다. 2배 연속 희석액을 사용하여 7점 표준 곡선을 준비합니다. 샘플을 중복으로 실행합니다. 540nm 파장 보정으로 450nm에서 플레이트를 판독합니다. 중복 사이에 변동 계수(CV)< 20%를 허용합니다.
  3. 종단 운동 개입 프로토콜
    1. 주당 3회 세션으로 구성된 12주간의 점진적인 운동 프로그램을 설계합니다.
    2. CLCF1 궤적 분석을 위해 기준선, 4주, 8주 및 12주에 혈액 샘플을 수집합니다.
    3. 기준선 및 종점에서 VO2 max 테스트를 사용하여 체력 향상을 평가합니다.
    4. CLCF1 변화를 12주에 DXA로 측정한 BMD 개선과 연관시킵니다.
    5. 운동 내성 및 회복 패턴을 포함한 훈련 적응을 문서화합니다.

2. 강화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리 및 처리

  1. CLCF1 분석을 위한 최적화된 PBMC 분리
    1. 멸균 조건에서 EDTA 함유 튜브(튜브당 5mL EDTA)에 20mL의 정맥혈 샘플을 수집합니다.
    2. 최적의 세포 생존율과 CLCF1 발현 보존을 위해 수집 후 2시간 이내에 샘플을 처리합니다.
      1. 실온에서 인산염 완충 식염수(PBS)로 혈액 샘플을 1:1로 희석합니다. 혈액 20mL와 PBS 20mL를 혼합합니다.
      2. 50mL 원추형 튜브의 밀도 구배 배지 위에 희석된 혈액을 층으로 층으로 바꿉니다. 희석된 혈액 20mL당 15mL 밀도 구배 배지를 사용합니다(1:1.33 비율).
    3. 브레이크 없이 실온에서 400× g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
    4. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플라즈마-Ficoll 인터페이스에서 PBMC 층을 조심스럽게 흡인합니다.
    5. 2% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 PBS로 300× g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다.
  2. 세포 생존력 평가 및 CLCF1 기준선 측정
    1. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 생존율을 결정합니다(목표 > 95% 생존율)20.
    2. 분리 직후 기준선 세포내 CLCF1 발현을 평가합니다.
    3. 적절한 배지에서 세포 농도를 1 × 106 cells/mL로 조정합니다.
    4. 다운스트림 응용 분야에 셀을 할당하거나 액체 질소에 저장합니다. 90% FBS + 10% DMSO를 함유한 동결 배지에서 PBMC를 동결합니다. -1°C/min에서 -80°C까지 제어 속도 냉동 용기를 사용하십시오. 1mL 분취량(5 × 106 세포/바이알)을 냉동 보관합니다.

3. 종합적인 정량적 유전자 발현 분석

  1. CLCF1 특이적 고려 사항을 고려한 RNA 추출 및 정제
    1. 분리 후 1시간 이내에 1mL의 RNA 용해 시약에 106 PBMC를 용×해합니다.
    2. 클로로포름 200μL를 첨가하고 격렬하게 소용돌이치고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
    3. 상 분리를 달성하기 위해 4°C에서 15분 동안 12,000× g 에서 원심분리합니다.
    4. 수성을 새 튜브로 옮기고 같은 양의 이소프로판올을 첨가하십시오.
    5. 4°C에서 10분 동안 12,000 × g 에서 원심분리하여 RNA를 침전시킵니다.
    6. RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 자연 건조시킨 다음 뉴클레아제가 없는 물에 녹입니다.
    7. 아가로스 겔 전기영동 또는 바이오분석기(표적 RIN>7.0)를 사용하여 RNA 무결성을 평가합니다.
  2. 업데이트된 프라이머 세트를 사용한 역전사 및 정량적 PCR
    1. 분광 광도법 분석을 사용하여 RNA 농도를 정량화합니다(목표 A260/A280 비율 1.8-2.2).
    2. 역전사 시약 키트와 함께 총 RNA 1μg을 사용하여 역전사를 수행합니다.
    3. qPCR 반응 준비: 마스터 믹스 10μL, 각 프라이머 0.8μL(10μM 스톡, 최종 400nM), cDNA 주형 2μL(50ng), 뉴클레아제가 없는 물 6.4μL를 포함하는 20μL 반응을 준비합니다. 세 번 실행합니다. 실시간 PCR 시스템을 사용하십시오.
    4. 검증된 프라이머 서열 사용:
      1. CLCF1 전방: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        역방향: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 포워드: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        반방향: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 앞으로: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        역방향: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 전방: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        역방향: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. qPCR 프로토콜 실행: 95°C에서 10분 동안 실행한 후 95°C에서 15초, 60°C에서 1분 동안 40회 사이클합니다.
    6. β-액틴 정규화와 함께 2(-ΔΔCt) 방법을 사용하여 결과를 분석합니다21.
  3. 운동-반응 유전자 패널 분석
    1. 운동 반응 유전자를 포함합니다: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 및 미오스타틴.
    2. 검증된 프라이머 서열 사용:
      1. IL-6 전방: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        역방향: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTTTCACAC-3';
      2. TNF-α 포워드: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        역방향: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β 전방: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        역방향: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF 전방: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3',
        역방향: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 포워드: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        역방향: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. 미오스타틴 포워드: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        역방향: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. CLCF1의 운동 유발 변화를 다른 미오카인 발현 패턴과 연관시킵니다.
    4. 기능적 사이토카인 복합체 형성의 지표로서 CLCF1/CRLF1 공동 발현 비율을 평가합니다.

4. STAT 경로 초점을 통한 향상된 단백질 발현 분석

  1. STAT 분석을 위한 단백질 추출 및 정량
    1. 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 보충된 용해 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.0)에서 PBMC를 용해합니다.
    2. 사용 직전에 몇 가지 특정 포스파타제 억제제인 오르토바나데이트나트륨(1mM) 및 불화나트륨(50mM)을 첨가하십시오.
    3. 10분마다 중간 속도로 주기적인 소용돌이와 함께 얼음 위에서 30분 동안 용해물을 배양합니다.
    4. 세포 파편을 제거하기 위해 4°C에서 15분 동안 12,000 × g 에서 원심분리합니다.
    5. Bradford 분석 또는 BCA 방법22를 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다.
    6. 샘플 버퍼에서 단백질 농도를 2 μg/μL로 조정하고 웨스턴 블로팅 응용 분야를 위한 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  2. STAT 신호 집중을 통한 포괄적인 웨스턴 블롯 분석
    1. 표준 아크릴아미드/비사크릴아미드 용액을 사용하여 10% SDS-PAGE 겔 10mL를 준비합니다.
    2. 사전 염색된 분자량 마커와 함께 레인당 20μg의 단백질을 로드하고 120V에서 90분 동안 분해합니다.
    3. 전이 완충액(25mM Tris, 192mM 글리신, 20% 메탄올)을 사용하여 4°C에서 2시간 동안 100V에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전사합니다.
    4. 0.1% Tween-20(TBST)이 함유된 Tris-완충 식염수에 50mL의 5% 탈지 분유로 멤브레인을 차단합니다.
    5. 4°C에서 밤새 1차 항체와 함께 배양: 항-CLCF1(1:1,000); 안티 CRLF1(1:1,000); 안티 OPG(1:1,000); 안티 RANKL(1:1,000); 안티 JAK2(1:1,000); 항인포-JAK2(Tyr1007/1008, 1:1,000); 안티 STAT1(1:1,000); 항인-STAT1(Tyr701, 1:1,000); 안티 STAT3(1:1,000); 항인산-STAT3(Tyr705, 1:1,000); 항β-액틴 (1:1,000)
    6. 15mL의 TBST로 멤브레인을 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체와 함께 배양합니다.
    7. 향상된 화학발광 기질을 사용하여 단백질 밴드를 검출합니다. 자동 노출 최적화 기능이 있는 화학발광 이미징 시스템을 사용한 이미지. ImageJ v1.53 겔 분석 도구와 함께 밀도 분석을 사용하여 정량화합니다.
  3. STAT1/STAT3 이중 경로 분석
    1. ImageJ/Fiji 소프트웨어 버전 1.54f를 사용하여 인산-STAT1/총 STAT1 및 인산-STAT3/총 STAT3 비율을 계산합니다.
    2. CLCF1 기능적 활동의 지표로 STAT1/STAT3 활성화 균형을 평가합니다.
    3. STAT 활성화 패턴을 RANKL/OPG 발현 비율과 연관시킵니다.
    4. CLCF1 처리 후 0, 15, 30, 60, 120 및 240분에 웨스턴 블롯 을 통해 STAT1/STAT3 인산화를 평가합니다. 밀도계를 사용하여 인단백질을 총 단백질 수준으로 정규화합니다.

5. 검증을 통한 고급 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃

  1. 향상된 렌티바이러스 벡터 구축
    1. CLCF1 유전자 서열을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 설계:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'입니다.
    2. 녹아웃 효율 향상을 위해 추가 sgRNA 서열을 포함합니다.
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'입니다.
    3. 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 sgRNA를 렌티바이러스 벡터로 클론합니다.
    4. DNA 염기서열 분석 분석을 통해 구조 무결성을 확인합니다.
    5. T7 엔도뉴클레아제 I 분석을 사용하여 sgRNA 절단 효율을 평가합니다23.
    6. 억제제를 사용한 경로 특이성 검증을 포함합니다: AG490(JAK2, 50μM), 플루다라빈(STAT1, 10μM) 및 Stattic(STAT3, 5μM).
    7. 경로의 필요성을 검증하기 위해 구성적으로 활성 STAT 구조를 사용하여 구조 실험을 수행합니다.
  2. 최적화된 렌티바이러스 형질도입 프로토콜
    1. 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지(500mL)에서 Raji 세포를 배양합니다. 모든 세포 배양을 5%CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C로 유지합니다. 사용하기 전에 최소 30분 동안 배양 배지를 사전 평형화하십시오.
    2. 형질도입 효율을 높이기 위해 폴리브렌(8μg/mL)으로 세포를 전처리합니다.
    3. 인산칼슘 형질감염 을 통해 패키징 및 엔벨로프 플라스미드가 있는 HEK293T 세포를 사용하여 렌티바이러스를 생산합니다. p24 ELISA(> 108 TU/mL 필요)로 역가를 측정합니다. BSL-2 격리 절차23을 따르십시오.
    4. 100의 감염 다중도(MOI)에서 렌티바이러스로 세포를 형질도입합니다. 형질도입 후 24시간 동안 배지를 교체하십시오. 7일 동안 퓨로마이신 (4 μg/mL)을 사용하여 형질도입된 세포를 선택한 후, 다음 PCR 조건을 사용하여 표적 부위에 걸쳐 있는 500 bp 영역을 증폭한다: 95°C에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 95°C에서 30초 동안 35 사이클의 변성, 60°C에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 30초 동안 확장, 72°C에서 5분 동안 최종 확장. T7 엔도뉴클레아제 분석의 경우, PCR 산물을 변성 및 재어닐링하고, T7E1 엔도뉴클레아제로 37°C에서 30분 동안 분해한 다음 2% 아가로스 겔에서 산물을 분석합니다.
    5. 웨스턴 블로팅 및 Sanger 시퀀싱24,25를 통해 유전자 녹아웃 효율을 검증합니다.
    6. GUIDE-seq 또는 유사한 방법론을 사용하여 오프 타겟 분석을 수행합니다26.
      참고: 최근의 증거는 CLCF1 분비 효율이 CRLF1 샤페론 단백질과의 공동 발현을 필요로 한다는 것을 보여줍니다. 완전한 기능적 절제를 위한 이중 녹아웃 접근법을 고려하십시오27.

6. 운동 모방제를 사용한 포괄적인 공동 배양 시스템

참고: 번역 검증을 위해 rhCLCF1을 10μg/kg i.p. 4주 동안 매일 마이크로 CT 를 통해 BMD를 평가합니다.

  1. 고급 Raji-MG-63 공동 배양 설정
    1. 5% CO2 및 95% 습도의 37°C에서 가습 인큐베이터에서 2 × 104 세포/웰의 밀도로 24웰 플레이트 하부 챔버에 MG-63 조골세포 유사 세포를 시종합니다. 사용하기 전에 인큐베이터에서 30분 동안 배지를 미리 평형화합니다. 향상된 번역을 위해 상업용 공급원의 1차 인간 조골세포(밀도 1 × 104/웰)로 대체하십시오.
    2. MG-63 세포가 포함된 웰에 0.4μm 기공 크기의 멤브레인 인서트를 놓습니다.
    3. 1 ×10 5 세포/웰의 밀도로 상부 챔버에서 Raji 세포(야생형, CLCF1-녹아웃 또는 CLCF1-과발현)를 시드합니다.
    4. 5% CO2로 37°C에서 지정된 실험 기간(7, 14, 21일) 동안 완전한 RPMI-1640 배지(하부 챔버에서 2mL, 상부 챔버에서 1.5mL)에서 공동 배양을 유지합니다.
    5. 용량-반응 관계를 평가하기 위해 재조합 CLCF1(5-10ng/mL) 치료군을 포함합니다.
  2. 운동 모방 CLCF1 치료 프로토콜
    1. 운동 유발 수준에 따라 재조합 CLCF1(5-10ng/mL)의 생리학적 농도로 공동 배양 시스템을 처리합니다.
    2. 박동성 CLCF1 치료 요법 적용: 1일째 0, 8, 16시간에 CLCF1을 2시간 펄스 동안 적용한 후 24시간 동안 지속적으로 노출시킨 후 주기를 반복합니다. 총 치료 기간: 총 9개의 펄스로 7일.
    3. 치료 후 1시간, 4시간, 24시간 및 7일에 시간 의존적 효과를 평가합니다.
    4. 0, 15, 30, 60분에 웨스턴 블롯 을 통해 두 세포 집단에서 STAT1/STAT3 인산화 동역학을 모니터링합니다. 억제제와 함께 완충액(500μL)에서 세포를 용해하고 총 STAT1/3 및 β-액틴으로 정규화합니다.
  3. 향상된 골형성 분화 평가
    1. 아스코르브산(50μg/mL), β-글리세로인산염(10mM) 및 덱사메타손(10nM)을 함유한 표준 골형성 배지를 사용하여 골형성 분화를 유도합니다. 3일마다 골형성 배지를 교체합니다(하부 챔버 2mL, 상부 챔버 1.5mL). 각 변경에 대해 신선한 아스코르브산 용액을 준비하십시오. β-글리세로인산염과 덱사메타손은 안정적으로 유지됩니다.
    2. 7일, 14일 및 21일에 비색 효소 분석을 사용하여 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성을 평가합니다28. 500 μL의 추출 부피를 사용합니다. 405nm에서 읽습니다. 총 단백질 함량으로 정규화합니다. 예상 색상 범위: 밝은 노란색(낮음)에서 짙은 노란색(높음).
    3. 21일째에 Alizarin Red S 염색 및 정량화를 통해 칼슘 침착을 평가합니다. 500μL의 세틸피리디늄 클로라이드로 추출, 540nm에서 판독, 예상 색상 범위: 연한 분홍색(낮은 광물화)에서 진한 빨간색(높은 광물화).
    4. 염화세틸피리디늄 추출 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 광물화를 정량화합니다.
    5. 골형성 유전자 발현을 분석합니다: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN 및 OPG단계 3.2에 설명된 qPCR 프로토콜을 사용합니다.
    6. 파골세포 관련 마커를 평가합니다: MG-63 세포의 TRAP, 카텝신 K 및 RANKL.

7. 고급 통계 분석 및 데이터 해석

  1. 포괄적인 통계 방법론
    1. 모든 연속 변수에 대해 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규성 테스트를 수행합니다29. 정규성 가정을 위반하는 경우 비모수 검정을 사용합니다(p < 0.05).
    2. 그룹 간의 비모수 비교를 위해 Mann-Whitney U 테스트를 적용합니다30.
    3. CLCF1 수준과 임상 매개변수 간의 연관성 연구를 위한 Spearman 상관 분석을 수행합니다31.
    4. 다중 회귀 분석을 수행하여 BMD의 독립적인 예측 인자를 평가합니다.
    5. 운동 개입 시간-경과 분석을 위해 반복 측정 ANOVA 사용32.
    6. 다중 비교를 위해 Bonferroni 보정 적용33.
    7. 모든 분석에 대해 통계적 유의성 임계값을 p < 0.05로 설정합니다.
  2. 향상된 데이터 표시 및 분석
    1. 연속 데이터를 평균 ± 표준 편차 또는 사분위수 범위가 있는 중앙값으로 표시합니다.
    2. 통계에는 GraphPad Prism v9, 밀도 측정에는 ImageJ v1.53을 사용하여 CLCF1 발현 대 BMD, 림프구 수 및 운동 매개변수에 대한 상관 플롯을 생성합니다. 사용자 지정 스크립트가 필요하지 않습니다. Prism의 내장 도구를 통해 ROC를 생성합니다. Prism의 Spearman 을 통한 상관 관계.
    3. 운동 유도 CLCF1 반응 동역학에 대한 시간 경과 플롯을 생성합니다.
    4. 골다공증 바이오마커로서 CLCF1에 대한 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 개발합니다.
      참고: 대표적인 웨스턴 블롯 이미지는 정량적 밀도 분석을 사용하여 생성되었습니다.

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결과

이 프로토콜의 구현은 여러 실험적 접근법을 사용하여 면역 매개 뼈 대사에서 CLCF1의 조절 역할을 성공적으로 입증합니다. 임상 검증 연구는 그림 1A에서 입증된 바와 같이 건강한 대조군에 비해 PMOP 환자에서 CLCF1 발현의 상당한 하향 조절을 보여주며, 말초 혈액 단핵 세포의 정량적 PCR 분석은 상대적 CLCF1 mRNA 수준이 건강한 폐경 후 대조군(n = 94)에 비해 PMOP 그룹(n = 109)에서 현저하게 감소했으며 발현이 약 40% 감소했습니다(p < 0.001). 이 발견은 단백질 수준에서 확인되었으며, 웨스턴 블롯 분석에서 PMOP 환자에서 CLCF1 단백질(35kDa) 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 밀도 정량화는 대조군에 비해 약 25% 감소한 것으로 나타났습니다(p < 0.001; 그림 1B...

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토론

여기에 설명된 프로토콜은 RANKL/OPG 축의 체계적인 분석을 통해 뼈 보호의 운동 유도 매개체로서 CLCF1의 역할을 조사하기 위한 포괄적인 방법론적 프레임워크를 제공합니다. 최근의 획기적인 연구에 따르면 CLCF1은 연령 관련 근골격계 쇠퇴를 방지하는 운동 유발 인자로 확인되어 운동 유발 뼈 보호의 중심 매개체로 자리매김했습니다 34,35,36. 이 향상된 프로토콜은 이중 뼈 보호 작용으로 새로 확인된 운동 모방 인자를 조사하기 위한 표준화된 방법론을 제공함으로써 골면역학의 중요한 지식 격차를 해결합니다.

최근 기술 발전을 통해 확인된 중요한 단계는 CLCF1 반응 동역학을 최적화하기 위한 세심한 운동 개입 설계, 샘플 처리 중 STAT 인산화의 신...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 이 연구에 자원한 참가자와 환자 모집 및 샘플 수집에 도움을 준 산둥 제1의과대학 부속 중앙병원의 임상 직원에게 감사를 표합니다. 세포 배양 및 분자 생물학 실험을 지원해 주신 실험실 기술자들에게 감사드립니다. H.Z.는 연구를 구상하고 설계하고, 실험을 수행하고, 데이터를 분석하고, 원고를 작성했습니다. HL은 실험 설계, 데이터 수집 및 원고 수정에 기여했습니다. Y.S.는 프로젝트를 감독하고, 비판적인 피드백을 제공하고, 원고를 편집했습니다. 모든 저자는 제출을 위해 최종 원고를 검토하고 승인했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cell Culture 배양 및 시약
디메틸 설폭사이드 (DMSO)시그마-올드리치D2650Purpose_Application:  냉동 보존 배양지 성분
Specifications_Comments: 분자생물학 등급, 멸균 여과
DMEM 매체써모피셔 사이언티브11965092Purpose_Application:  MG-63 골모세포 배양 배양
Specifications_Comments: L-글루타민 함유 고포도당 제형제
태아 소 혈청 (FBS)써모피셔 사이언티브16000044Purpose_Application:  세포 배양 보충제(열 불활성화)
Specifications_Comments: 56Â에서 열로 불활성화; ° 30분 동안 C를 유지했습니다
페니실린-스트렙토마이신써모피셔 사이언티브15140122Purpose_Application:  멸균 배양용 항생제 보충제
Specifications_Comments: 100X 스톡, 최종 농도 1%
폴리브렌(헥사디메트린 브로마이드)산타크루즈 바이오테크놀로지SC-134220Purpose_Application:  렌티바이럴 전도촉진제
Specifications_Comments: 8 Î ¼ g/mL 작동 농도
푸로마이신 디하이드로클로라이드인비보젠앤트-PR-1Purpose_Application:  형질 세포에 대한 선택적 항생제
Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ 7일간 g/mL 선택 농도를 유지했습니다
RPMI-1640 미디엄써모피셔 사이언티브11875093Purpose_Application:  라지 B-림프구 배양 배양지
Specifications_Comments: L-글루타민 함유, 페놀 레드 제외 선호
트라이판 블루 솔루션써모피셔 사이언티브15250061Purpose_Application:  세포 생존성 평가
Specifications_Comments: 배제 분석에 0.4% 해답을 적용합니다
제어 속도 냉동 컨테이너써모피셔 사이언티브5100-0001Purpose_Application:  제어 속도 세포 동결 (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: -1 및 Acirc에 해당하는 Mr. Frosty 또는 동등한 인물; ° C/min 냉각
EDTA 혈액 채취관BD 생명과학366643Purpose_Application:  항응고제
Specifications_Comments를 이용한 정맥 혈액 채취: 10-20 mL 용량, 보라색 상부 튜브
Ficoll-Paque PLUS 밀도 구배시티바 (GE 헬스케어)17144003Purpose_Application:  밀도 원심분리
Specifications_Comments를 통한 PBMC 분리: 멸균, 세포 분리를 위한 내독소 검사
인산염 완충 식염수(PBS)써모피셔 사이언티브14190144Purpose_Application:  세포 세척 및 희석 완충제
Specifications_Comments: 멸균, 세포 배양 등급
<강>RNA 추출 및 qPCR
클로로포름 (ACS 등급)시그마-올드리치C2432Purpose_Application:  RNA 추출에서의 상 분리
Specifications_Comments: ACS 시약 등급, 그리고 순환; & 퍼밀; ¥ 순도 99%
에탄올 (75%, 분자등급)시그마-올드리치E7023Purpose_Application:  RNA 펠릿 세척
Specifications_Comments: 분자생물학 등급, 신선하게 준비하세요
이소프로판올 (분자급)시그마-올드리치19516Purpose_Application:  RNA 침전
Specifications_Comments: 분자생물학 등급, 그리고 순환; & 퍼밀; ¥ 순도 99.5%
뉴클레아제 없는 물써모피셔 사이언티브AM9930Purpose_Application:  PCR 반응 제제
Specifications_Comments: DNase/RNase 프리, PCR 적용 대상 시험
광학 접착 필름써모피셔 사이언티브4311971Purpose_Application:  qPCR 플레이트
Specifications_Comments의 광학 밀봉: qPCR 응용을 위한 광학 품질
PCR 플레이트 (96웰)써모피셔 사이언티브N8010560Purpose_Application:  96웰 포맷, 고처리량 qPCR
Specifications_Comments: 흰색, 투명한 바닥, 광학 검출
PCR 튜브 스트립써모피셔 사이언티브AB0451Purpose_Application:  소용량 PCR 반응
Specifications_Comments: 개별 캡이 있는 8관 스트립
PrimeScript RT 시약 키트타카라 소개RR037APurpose_Application:  RNA를 cDNA
Specifications_Comments로 역전사: 게놈 DNA 제거를 위한 gDNA 이레이저
SYBR 그린 마스터 믹스응용 생명 시스템4309155Purpose_Application:  실시간 PCR 증폭 및 검출
Specifications_Comments: 정규화를 위한 ROX 참조 염료 사용
트리졸 시약 (RNA 용해)써모피셔 사이언티브15596026Purpose_Application:  세포 용해 및 RNA 추출
Specifications_Comments: 4Â에 저장; ° C, 6개월 이내에 사용
<스트롱>단백질 분석 - 웨스턴 블롯
아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 (29:1)바이오-래드1610146Purpose_Application:  SDS-PAGE 겔 중합
Specifications_Comments: 30% 아크릴아마이드 정액
BCA 단백질 분석 키트써모피셔 사이언티브23225Purpose_Application:  단백질 농도 정량화
Specifications_Comments: 정확한 정량화를 위한 환원 호환
증강 화학발광(ECL) 기질써모피셔 사이언티브32106Purpose_Application:  화학발광 단백질 검출
Specifications_Comments: 펨토그램 민감도 검출
무지방 건조 밀크연구소 사이언티브170-6404Purpose_Application:  웨스턴 블롯 차단제
Specifications_Comments: 블로킹 등급, 낮은 배경
포스파타제 억제제 칵테일로슈 응용과학4906845001Purpose_Application:  단백질 탈인산화 방지
Specifications_Comments: 오카다산과 칼리큘린 A 포함
프리스테인 단백질 사다리바이오-래드1610394Purpose_Application:  분자량 기준 표준
Specifications_Comments: 10-250 kDa 범위, 11개 밴드
프로테아제 억제제 칵테일로슈 응용과학11697498001Purpose_Application:  금속 의존성 인산효소에 대해 용해
Specifications_Comments 단백질 분해 방지: EDTA 프리
PVDF 막 (0.45 Î ¼ m)밀리포어 시그마IPVH00010Purpose_Application:  단백질 전달막 (0.45 Î ¼ m 기공)
Specifications_Comments: 낮은 형광 배경
RIPA 용해 버퍼세포 신호 전달 기술9806SPurpose_Application:  전세포 단백질 추출
Specifications_Comments: 세제가 포함된 즉시 사용 가능한 용해 버퍼
샘플 로딩 버퍼 (4배)바이오-래드1610747Purpose_Application:  SDS-PAGE
Specifications_Comments 단백질 샘플 준비: 염료 적재 및 및 Icirc; ²-머캡토에탄올
SDS-PAGE 러닝 버퍼바이오-래드1610732Purpose_Application:  단백질 전기영동
Specifications_Comments: 트리스-글리신-SDS 완충 시스템
불화나트륨시그마-올드리치201154Purpose_Application:  추가 인산효소 억제
Specifications_Comments: 50 mM 작동 농도
정형반산나트륨시그마-올드리치S6508Purpose_Application:  JAK2/STAT 인산화 보존
Specifications_Comments: 1 mM 작업 농도, 신선하게 준비
전이 버퍼 농축물바이오-래드1704156Purpose_Application:  반건성 단백질 전이
Specifications_Comments: 농축액 10배, 사용 전에 희석해
트윈-20을 이용한 트리스 버퍼 식염수 (TBST)세포 신호 전달 기술9997SPurpose_Application:  막 세척 및 항체 희석
Specifications_Comments: 0.1% 트윈-20, pH 7.6
<강>CRISPR/유전자 편집
인산칼슘 형질전환 키트프로메가E1200Purpose_Application:  포장 세포
Specifications_Comments DNA 형질전환: 렌티바이러스 생산을 위한 높은 형질전환 효율
DNA 젤 추출 키트치아겐28706Purpose_Application:  시퀀싱을 위한 PCR 제품 정제
Specifications_Comments: 컬럼 기반 정제 시스템
GV371 렌티바이러스 벡터제네켐 주식회사GV371Purpose_Application:  CRISPR/Cas9 유전자 노크아웃
Specifications_Comments 발현: 즉시 사용 가능한 CRISPR/Cas9 렌티바이러스 시스템
HEK293T 세포주ATCCCRL-3216Purpose_Application:  렌티바이러스 포장 세포주
Specifications_Comments: 매우 형질형질형질전환 가능한 포장 세포주입니다
생거 시퀀싱 서비스매크로젠 주식회사관습Purpose_Application:  녹아웃 검증 및 오프타겟 분석
Specifications_Comments: 맞춤형 프라이머를 이용한 표준 시퀀싱
T7 엔도뉴클레제 I뉴잉글랜드 바이오랩스M0302SPurpose_Application:  CRISPR 절단 효율 검증
Specifications_Comments: CRISPR 검증을 위한 불일치 특이적 엔도뉴클레아제
<스트롱>엘리사 & 면역분석
ELISA 플레이트 (96웰, 평평한 바닥)코 닝3590Purpose_Application:  ELISA 기질 반응
Specifications_Comments: ELISA의 고결합, 평평한 바닥
인간 CLCF1 듀오셋 ELISAR& D 시스템즈DY1234Purpose_Application:  CLCF1 단백질 정량 (31.2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments: 검출 범위: 31.2-2000 pg/mL, CV 및 10%
p24 ELISA 키트 (렌티바이랄 역가)제프토메트릭스 코퍼레이션801111Purpose_Application:  렌티바이러스 역가 결정
Specifications_Comments: 렌티바이러스 역가 결정에 사용한다(>10â ¸ TU/mL)
<강력>기능성 검사
알리자린 레드 S 스테인 키트시그마-올드리치A5533Purpose_Application:  칼슘 침착 시각화
Specifications_Comments: 증류수 내 2% 용액, pH 4.1-4.3
알칼리성 인산효소 활성 키트앱캠AB83369Purpose_Application:  ALP 효소 활성 측정
Specifications_Comments: 405 nm에서 측정된 색도 분석
아스코르브산 (L-아스코르브산)시그마-올드리치A4544Purpose_Application:  골성 배지 성분
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL 최종 농도
세틸피리디늄 클로라이드시그마-올드리치C9002Purpose_Application:  정량을 위한 알리자린 레드 S 추출
Specifications_Comments: 염료 추출을 위한 10% 용액
덱사메타손시그마-올드리치D4902Purpose_Application:  골생성 배지 성분
Specifications_Comments: 최종 농도 10 nM
Î ²-글리세로인산시그마-올드리치G9422Purpose_Application:  골생성 배지 성분
Specifications_Comments: 최종 농도 10 mM
골생성 분화 배지프로모션셀C-28010Purpose_Application:  골모세포 분화 유도
Specifications_Comments: 즉시 사용 가능한 완전 골형성 배지
트랜스웰 세포 배양 인서트 (0.4 & Icirc; ¼ m)코 닝3470Purpose_Application:  0.4 Î와의 공배양 시스템; ¼ m 분리
Specifications_Comments: 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막, 무균
<스트롱>장비 - 메이저 인스트루먼트
원심분리기 (고속, 냉장)에펜도르프5430RPurpose_Application:  샘플 처리 및 셀 분리
Specifications_Comments: 냉장 보관, 최대 30,000 x g
화학발광 영상 시스템바이오-래드 연구소12003154Purpose_Application:  웨스턴 블롯 영상 및 정량화
Specifications_Comments: 젤 문서 및 웨스턴 블롯 영상
CO2 인큐베이터 (가습)써모피셔 사이언티브51030287Purpose_Application:  세포 배양 유지 (37Â ° C, 5% CO2)
Specifications_Comments: 삼중 가스 (CO2/O2/N2), 습도 조절
심박수 모니터 (흉부 스트랩)폴라 일렉트로H10Purpose_Application:  연속 심박수 모니터링
Specifications_Comments: 블루투스 연결 및 순환; ± 1 bpm 정확도
Hologic Discovery A DXA 스캐너호로닉 주식회사발견 APurpose_Application:  골밀도 측정
Specifications_Comments: APEX 소프트웨어 v4.5 사용 시 매일 품질 관리 필요
마이크로플레이트 리더(멀티모드)바이오텍 인스트루먼츠시너지 H1Purpose_Application:  ELISA 플레이트 판독 및 흡수도 측정
Specifications_Comments: UV-Vis, 형광, 발광 검출
모터 러닝머신라이프 피트니스95TiPurpose_Application:  표준화 운동 개입
Specifications_Comments: 가변 속도 0-16 km/h, 0-15% 경사
실시간 PCR 시스템 (CFX96 또는 동등)바이오-래드 연구소1855195Purpose_Application:  실시간 PCR 증폭 및 검출
Specifications_Comments: 96웰 블록, 그라디언트 가능
소프트웨어 & 분석 도구
APEX 소프트웨어 v4.5 (DXA 분석)호로닉 주식회사버전 4.5Purpose_Application:  DXA 스캔 분석 및 골밀도 계산
Specifications_Comments: 참조 데이터베이스를 이용한 골밀도 분석
바이오-래드 CFX 마에스트로바이오-래드 연구소CFX 마에스트로Purpose_Application:  qPCR 데이터 분석 및 CT 결정
Specifications_Comments: 실시간 PCR 분석 및 데이터 내보내
그래프패드 프리즈 v9.0그래프패드 소프트웨어v9.0Purpose_Application:  통계 분석 및 그래프 생성
Specifications_Comments: 그래프 생성을 포함한 통계 소프트웨어
ImageJ/피지 v1.53국립보건원(NIH)v1.53Purpose_Application:  웨스턴 블롯 밀도측정 및 영상 분석
Specifications_Comments: 측정 도구를 이용한 이미지 분석
마이크로소프트 엑셀 365마이크로소프트 코퍼레이션365Purpose_Application:  데이터 조직 및 기본 계산
Specifications_Comments: 데이터 조직 및 기본 통계 함수
<강>소모품 및 플라스틱웨어
1.5 mL 마이크로 원심분리관에펜도르프22363204Purpose_Application:  소용량 샘플 저장 및 처리
Specifications_Comments: DNase/RNase 무첨가, 저결합
15 mL 원뿔관코 닝430766Purpose_Application:  중용량 샘플 처리
Specifications_Comments: 폴리프로필렌, 눈금, 캡 포함
24웰 세포 배양 플레이트코 닝3524Purpose_Application:  공동 배양 및 기능적 분석법 설정
Specifications_Comments: 조직 배양 처리, 평평한 바닥
50 mL 원뿔 튜브코 닝430829Purpose_Application:  대량 샘플 채취 및 처리
Specifications_Comments: 모자 포함 눈금식 폴리프로필렌
크라이오바이알 (1 mL)써모피셔 사이언티브375418Purpose_Application:  -80 및 순환 경에 대한 장기 세포 및 샘플 저장; ° C
Specifications_Comments: 외부 나사산, O-링 씰, -196 & Acirc; ° C 등급
파스퇴르 피펫 (멸균)피셔 사이언티브13-678-20APurpose_Application:  멸균 샘플 채취 및 이송
Specifications_Comments: 개별 포장, 멸균

참고문헌

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