이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

용골성 질환 모델에서 노치 신호 조절을 통한 LY90009에 의한 파골세포 형성 억제

502 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

2025년 10월 7일

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

이 논문에서

요약

여기에서는 골수 유래 대식세포에서 RANKL 유도 파골세포 형성에 대한 γ-세크레타제 억제제 LY900009의 억제 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 세포독성 평가, 기능 분석, 분자 분석 및 쥐 용골 모델에서의 생체 내 검증이 포함되며 골용해 질환의 치료 개발에 적용됩니다.

초록

조절 장애가 있는 파골세포 활동은 용골성 질환의 진행에 크게 기여하지만 치료 개입 방식의 범위는 부작용으로 인해 제한됩니다. 이 연구는 γ-세크레타제 억제제인 LY900009와 Notch 신호 전달의 조절을 통해 RANKL 유도 파골세포 형성을 억제하는 능력을 조사했습니다. 골수 유래 대식세포를 사용하여 세포독성, 분화 및 기능적 분석에 대한 포괄적인 시험관 내 평가를 수행했습니다. qPCR과 웨스턴 블로팅을 사용한 유전자 및 단백질 발현 분석을 사용하여 기본 분자 메커니즘을 밝혔습니다. 생체 내 효능은 쥐 지질다당류 유도 뼈 흡수 모델을 사용하여 확증되었습니다. LY900009 치료 농도에서 세포 독성 없이 용량 의존적 방식으로 RANKL 유도 파골세포 형성 및 흡수 기능을 억제했습니다. 이 치료는 TRAP 양성 파골세포의 수를 크게 감소시키고, 액틴 벨트 형성을 손상시키고, 골기질 분해를 억제했습니다. NFATc1, c-Fos, 카텝신 K 및 TRAP을 포함한 파골세포 마커의 발현이 현저하게 하향 조절되었습니다. 기계적으로 LY900009 Notch 신호 전달과 다운스트림 MAPK/Akt 경로를 방해했습니다. 생체 내 투여는 LPS로 인한 뼈 파괴를 실질적으로 감소시켜 뼈 매개변수를 개선하고 파골세포 존재를 감소시켰습니다. 이러한 발견은 LY900009가 Notch/MAPK/Akt 신호 전달 축을 조절하여 파골세포 형성 및 뼈 흡수를 효과적으로 억제하여 골용해 장애에 대한 유망한 치료 후보가 된다는 것을 보여줍니다.

서론

뼈 항상성은 척추동물에서 정교하게 조정된 생리학적 패러다임을 구성하며, 조골세포 매개 뼈 형성과 파골세포 유발 뼈 흡수 사이의 섬세한 균형에 의해 조화를 이룹니다1. 이 복잡한 균형은 평생 동안 골격 무결성, 생체역학적 탄력성 및 대사 충실도를 유지하여 기계적 요구, 내분비 교란 및 병리학적 문제에 동적으로 반응합니다2. 뼈 리모델링 주기에는 활성화, 흡수, 전이, 형성 및 종료의 순차적 단계가 포함되며, 각 단계는 세포 활동의 시공간적 동기화를 보장하는 복잡한 분자 캐스케이드에 의해 지배됩니다3.

특히 과도한 파골세포 활동 또는 부적절한 조골세포 기능을 통한 이러한 항상성 메커니즘의 파괴는 수많은 골용해 장애의 특징인 병리학적 뼈 손실을 촉진합니다 4,5. 이러한 상태는 폐경 후 및 노화성 골다공증, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 종양성 뼈 침범, 파제트병 및 치주 질환을 포함한 광범위한 질병을 포함합니다6. 과도한 뼈 흡수의 임상 증상에는 골절 위험 증가, 골격 기형, 만성 통증, 기능 장애 및 상당한 의료 부담이 포함됩니다 6,7. 현대 역학 지표에 따르면 골다공증만으로도 전 세계적으로 2억 명 이상의 개인에게 영향을 미치며, 관련 골절로 인해 상당한 이환율, 사망률 및 연간 수십억 달러가 넘는 경제적 비용이 발생합니다 7,8.

파골세포는 단핵 식세포 계통의 조혈 전구체, 특히 골수 유래 대식세포에서 파생된 고도로 전문화된 다핵 거대 세포로 나타납니다9. 이들의 형성은 세포외 신호, 세포내 신호 전달 캐스케이드 및 전사 프로그램의 정확한 조정을 필요로 하는 복잡한 다단계 과정을 나타냅니다10. 파골세포 형성을 지배하는 필수 사이토카인에는 핵 인자 κB 리간드의 수용체 활성화제(RANKL) 및 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)가 포함되며, 이들은 각각의 수용체 RANK 및 c-Fms에 결합하여 분화 프로그램을 시작합니다11. RANKL-RANK 상호작용은 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 핵 인자 κB(NF-κB), 포스포이노시티드 3-키나아제/단백질 키나아제 B(PI3K/Akt) 및 칼슘/칼시뉴린 경로를 포함한 여러 다운스트림 신호 전달 경로의 활성화를 유발하며, 이는 파골세포 형성의 마스터 전사 조절자인 활성화된 T 세포 세포질 1(NFATc1)의 핵 인자에 수렴합니다 10,11,12.

파골세포 생물학을 제어하는 다양한 조절 메커니즘 중에서 Notch 신호 전달은 복잡하고 상황에 따라 달라지는 기능을 가진 중요한 조절자로 부상했습니다13. Notch 경로는 다양한 조직과 발달 단계에서 세포 운명 결정, 분화, 증식 및 세포사멸을 제어하는 진화적으로 보존된 세포-세포 통신 시스템입니다14. 포유류에서 4개의 Notch 수용체(Notch1-4)는 5개의 표준 리간드(Delta-like 1, 3 및 4, Jagged 1 및 2)와 상호 작용하여 세포간 신호 전달을 매개합니다. 경로 활성화에는 리간드 결합, 형태 변화 및 ADAM 메탈로프로테아제 및 γ-세크레타제 복합체에 의한 순차적 단백질 분해 절단이 포함되며, 이는 궁극적으로 Hes 및 Hey 계열을 포함한 표적 유전자의 핵 전좌 및 전사 조절을 위한 노치 세포내 도메인(NICD)을 방출합니다14,15. 파골세포 형성에서 Notch 신호 전달의 역할은 여전히 논쟁의 여지가 있으며 특정 수용체 아형, 리간드 가용성, 세포 미세 환경 및 실험 조건에 따라 자극 및 억제 효과를 모두 보고하는 연구와 함께 상황에 따라 매우 의존적인 것으로 보입니다 16,17,18.

골용해성 질환에 대한 일반적인 치료 접근법은 주로 비스포스포네이트, 데노수맙(RANKL 억제제), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 및 칼시토닌을 포함한 항흡수 전략에 중점을 둡니다 7,8,19. 이러한 치료법은 골흡수 및 골절 위험을 효과적으로 감소시키지만 위장관 독성, 턱 골괴사, 비정형 골절, 감염 위험 증가, 장기적인 안전성에 대한 우려 등 상당한 한계와 관련이 있습니다. 또한 이러한 약제는 뼈 회전율을 과도하게 억제하여 잠재적으로 뼈의 질과 복구 메커니즘을 손상시킬 수 있습니다. 결과적으로, 부작용을 최소화하고 생리적 뼈 리모델링 능력을 보존하면서 병리학적 파골세포 활성을 선택적으로 억제할 수 있는 새로운 치료제에 대한 시급한 임상적 필요성이 있습니다 8,14.

γ-Secretase 억제제는 Notch 신호전달 14,20의 조절을 통해 용골성 질환에 잠재적으로 응용할 수 있는 유망한 종류의 화합물을 나타냅니다. 이러한 제제는 종양학 및 신경퇴행성 질환 연구에서 광범위하게 연구되었으며, 여러 화합물이 알츠하이머병 및 다양한 암에 대한 임상 시험으로 진행되고 있습니다. 강력하고 선택적인 γ-세크레타제 억제제인 LY900009는 예비 연구에서 높은 특이성, 생체이용률 및 관리 가능한 안전성 프로파일을 포함하여 유리한 약리학적 특성을 입증했습니다21,22. 그러나 RANKL 유도 파골세포 형성에 대한 특정 효과와 용골성 질환에서의 잠재적 치료 유용성은 아직 불완전하게 특성화되어 있습니다. 이 연구는 LY900009가 Notch 신호 전달의 중단을 통해 파골세포 형성을 억제할 수 있는지 여부를 평가하여 잠재적으로 용골성 질환에 대한 새로운 치료 접근법을 제공할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 고안되었습니다. 우리는 염증성 뼈 손실 모델에서 파골세포 형성, 뼈 흡수 활성, 신호 전달 경로 및 생체 내 효능에 미치는 영향을 평가하기 위한 포괄적인 프로토콜을 개발했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 시술은 기관 지침에 따라 수행되었으며 산둥제1의과대학 부속 중앙병원 동물관리 및 이용위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 IACUC-2024-015). 이 연구는 표준 케이지(5마리의 마우스/케이지, 12시간 빛/암주기, 자유 음식/물) 및 그룹으로의 무작위 배정을 포함하여 동물 연구에 대한 확립된 윤리 원칙 및 ARRIVE 지침을 준수했습니다

1. 골수 유래 대식세포 분리 및 배양

  1. 5주 된 수컷 C57BL/6 마우스(분리당 n=5)를 5분 동안 분당 30% 챔버 부피의 유속으로 CO2 챔버에 배치하여 안락사시킵니다. 자궁경부 탈구로 인한 사망을 확인합니다.
  2. 마우스에 70% 에탄올을 뿌립니다. 멸균 가위를 사용하여 치골에서 흉골까지 정중선을 절개합니다. 대퇴골과 경골을 무균 상태로 제거합니다. 얼음 위의 멸균 PBS에 뼈를 넣습니다.
  3. 멸균 거즈를 사용하여 연조직의 뼈를 청소합니다. 멸균 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다. 마우스당 10mL의 저온 α-MEM과 함께 25G 바늘을 사용하여 골수를 세척합니다. 세포 현탁액을 70μm 세포 스트레이너에 통과시킵니다.
  4. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다. 10% FBS 및 33.3 ng/mL M-CSF를 함유한 α-MEM에 펠릿을 재현탁합니다. 트리판 블루 배제가 있는 혈구측정기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. T75 플라스크에 2 x 106 cells/mL로 플레이트합니다.
  5. 배양액을 5% CO2 분위기에서 37°C로 유지하며 48시간마다 배지를 교체합니다.
  6. 1x 106 개의 세포를 수확합니다. 2% FBS를 함유한 PBS로 세척합니다. 항-CD11b-FITC(1:100) 및 항-F4/80-PE(1:100)와 함께 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 다음 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석으로 분석합니다. 먼저, 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)을 기반으로 세포를 게이트하여 파편을 배제하고 생존 가능한 세포를 선택합니다. 둘째, 생존 가능한 세포 집단에서 CD11b 양성 세포를 게이트합니다. 셋째, CD11b 양성 세포에서 F4/80 양성 세포를 게이트하여 CD11b+/F4/80+ 이중 양성 대식세포를 식별합니다. 얼룩지지 않은 컨트롤과 단색 컨트롤을 기반으로 게이트를 설정합니다. >95%의 세포가 CD11b+/F4/80+인 경우에만 진행합니다.

2. 세포독성 평가

  1. 웰당 100μL의 배지를 사용하여 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포로 골수 유래 대식세포(BMM)를 시드합니다. 세포가 37°C에서 4시간 동안 부착되도록 합니다.
  2. 완전 배지에서 LY900009 희석액을 준비합니다: 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8, 25.6 μM. 오래된 배지를 제거합니다. 웰당 100μL의 처리 배지를 추가합니다. 각 농도에 대해 3부를 준비합니다.
  3. 24시간, 48시간 또는 96시간 동안 배양합니다. 배양 배지를 완전히 제거합니다. 10% CCK-8 시약을 함유한 신선한 배지 100 μL(배지 90 μL에 CCK-8 10 μL)를 추가합니다. 37°C에서 정확히 2시간 동안 배양합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 650nm의 기준으로 450nm의 흡광도를 측정합니다.
  4. GraphPad Prism을 사용하여 IC50을 계산합니다. 개방형 소프트웨어, 입력 농도(X축) 및 생존율(Y축). 비 선형 회귀 >분석 > 용량 반응 > 억제 > 로그(억제제) 대 가변 기울기 반응 반응을 선택합니다. 제약 조건 설정: Bottom=0, Top=100. 95% 신뢰 구간으로 IC50을 기록합니다.

3. 파골세포 분화 및 TRAP 염색

  1. 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포로 골수 유래 대식세포(BMM)를 시드합니다. 10% FBS 및 33.3 ng/mL M-CSF를 사용하여 α-MEM에서 하룻밤 배양합니다.
  2. 배지를 100μL의 분화 배지로 교체합니다: 10% FBS, 33.3ng/mL M-CSF, 100ng/mL RANKL 및 LY900009(0, 100, 200, 400nM)을 함유한 α-MEM. 각 조건에 대해 사중을 준비합니다.
  3. 48시간마다 배지를 신선한 분화 배지로 교체하십시오. 6일 동안 계속합니다. 파골세포 형성을 위해 도립 현미경을 사용하여 100배로 매일 모니터링합니다.
  4. 흡인으로 모든 배지를 제거합니다. PBS 200μL로 한 번 세척합니다. PBS에 100μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가합니다. 실온에서 정확히 15분 동안 배양합니다. 고정제를 제거합니다. 200μL의 PBS로 3회 세척합니다.
  5. TRAP 염색 용액 준비: 0.1M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 50mL, 50mM 주석산나트륨 10mL, 디메틸포름아미드에 5mg/mL 나프톨 AS-MX 인산염 1mL, 11mg/mL Fast Red Violet LB 염 0.5mL를 혼합합니다. 0.22μm 필터를 통해 여과합니다. 웰당 200μL를 도포합니다. 어두운 곳에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 증류수로 3회 세척하여 반응을 멈춥니다.
  6. 파골세포를 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP 양성 세포(보라색/빨간색)로 식별합니다. 100배 배율의 도립 현미경을 사용하여 계수합니다. 우물당 5개의 무작위 필드를 촬영합니다.
  7. ImageJ를 사용하여 정량화합니다. 이미지 클릭 > 8비트로 변환(이미지 > 유형 > 8비트) > 임계값 설정(이미지 > > 임계값 조정) > TRAP 양성 영역 선택 > 입자 분석(분석 > 입자 분석: 크기 100-Infinity μm2, 원형도 0-1.0) > 결과를 Excel 23으로 내보냅니다.

4. 기능적 골흡수 분석

  1. 24시간 동안 M-CSF와 함께 6웰 플레이트(2 x 105 세포/웰)에서 BMM을 배양합니다. RANKL(100ng/mL)을 첨가하여 3일 동안 파골세포 형성을 유도합니다.
  2. 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 37°C에서 5분 동안 세포를 수확합니다. 완전한 배지로 중화하십시오. 트리판 블루를 사용하여 생존 세포를 계산합니다.
  3. 수산화인회석으로 코팅된 96웰 플레이트에 웰당 1 x 104개의 파골세포를 시종합니다. 4시간 동안 부착을 허용합니다.
  4. M-CSF(33.3ng/mL), RANKL(100ng/mL) 및 LY900009(0, 100, 200, 400nM)로 4일 동안 치료합니다. 2일마다 배지를 교체하십시오.
  5. 10% 표백제를 사용하여 10분 동안 세포를 제거합니다. 증류수로 5회 씻습니다. 완전히 자연 건조하십시오.
  6. 4배 배율의 자동 이미징 리더를 사용하여 재흡수 구덩이를 시각화합니다. 전체 우물 영역을 캡처합니다. ImageJ를 사용하여 전체 면적의 백분율로 흡수된 면적을 정량화합니다.

5. 면역형광현미경

  1. 3단계에서 설명한 대로 24웰 플레이트의 유리 커버슬립에 파골세포를 5-7일 동안 배양합니다.
  2. 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정합니다. PBS에서 0.1% Triton X-100으로 10분 동안 투과화합니다. 실온에서 1시간 동안 PBS에 1% BSA로 차단합니다.
  3. 로다민-팔로이딘(1:200)과 함께 어두운 곳에서 실온에서 45분 동안 차단 완충액에 배양합니다. DAPI(1μg/mL)로 핵을 10분 동안 대변염색합니다.
  4. 퇴색 방지 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 형광 현미경을 사용하여 200배 배율로 검사합니다. ImageJ를 사용하여 액틴 고리 면적을 측정합니다.

6. 정량적 실시간 PCR 분석

  1. RNA 추출 시약을 사용하여 2 x 106 세포에서 총 RNA를 추출합니다. 피펫팅으로 균질화합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 클로로포름 200μL를 첨가합니다. 15초 동안 세게 흔듭니다. 3분 동안 배양합니다. 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리합니다.
  3. 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 500μL의 이소프로판올을 첨가합니다. 부드럽게 섞는다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 에서 원심분리합니다.
  4. 펠릿을 1mL의 75% 에탄올로 세척합니다. 10분 동안 자연 건조합니다. RNase가 없는 물 30 μL에 녹입니다. 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다(A260/A280 비율>1.8 필요).
  5. 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 키트와 함께 1μg RNA를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
  6. qPCR 반응 준비: 마스터 믹스 10μL, cDNA 1μL, 각 프라이머 0.5μL(10μM), 물 8μL. 실시간 PCR 시스템에서 실행: 95°C에서 10분 동안 실행한 다음 95°C에서 15초, 60°C에서 60초 동안 40회 사이클합니다. GAPDH를 참조 유전자로 하는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 발현을 계산합니다.

7. 웨스턴 블롯 분석

  1. 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유한 RIPA 완충액에서 세포를 얼음 위에 30분 동안 용해시킵니다. 4°C에서 15분 동안 14,000 x g 에서 원심분리합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 로딩 버퍼에 30μg의 단백질 샘플을 준비합니다. 5분간 끓입니다.
  3. 10% SDS-PAGE 겔에 샘플을 로드합니다. 80V에서 30분 동안 실행한 다음 120V에서 90분 동안 실행합니다. 저온 전사 완충액에서 90분 동안 100V에서 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다.
  4. 0.1% Tween-20(TBST)이 함유된 Tris-Buffered 식염수에 5% 탈지유로 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 차단합니다.
  5. 재료표(1:1000)에 자세히 설명된 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다. TBST로 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
  6. HRP 접합 2차 항체(1:5000)와 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TBST로 3회 세탁합니다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 ECL 시약을 사용하여 감지하십시오. 적외선 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다. ImageJ를 사용하여 밴드 강도를 정량화합니다.

8. 생체 내 LPS 유도 골 흡수 모델

  1. G*Power 3.1을 사용하여 표본 크기를 계산합니다(효과 크기=0.8, α=0.05, 검정력=0.80, n=5/그룹 산출). 난수 생성기를 사용하여 7-8주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 그룹에 무작위로 할당합니다. 케이지당 5마리의 쥐를 12시간의 빛/암흑 주기, 온도 22 ± 2 °C, 습도 55% ± 10%, 표준 차우와 물에 자유롭게 접근할 수 있습니다.
  2. 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)의 복강내 주사를 사용하여 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기 반사로 마취를 확인합니다.
  3. 비히클 대조군 준비: 1% DMSO를 함유한 PBS. 준비 LY900009: 비히클에서 저용량(2.5mg/kg) 및 고용량(5mg/kg). 14일 동안 매일 27G 바늘을 사용하여 두개골에 100μL를 피하 주사합니다. 1일과 8일에 LPS(10mg/kg)를 주사합니다.
  4. 고통의 징후가 있는지 매일 2회 쥐를 모니터링하십시오. 인도적인 종점을 정의합니다: 체중 감소>20%, 걸을 수 없음, 구부정한 자세, 몸단장 감소. 종점에 도달하면 즉시 안락사시키십시오.
  5. 펜토바르비탈 과다 복용(복강내 100mg/kg 투여)을 사용하여 15일째에 안락사시킵니다. calvariae를 수확하십시오. 4 °C에서 48 시간 동안 4 % 파라포름 알데히드에 고정합니다.

9. Micro-CT 및 조직학적 분석

  1. 70kV, 114μA, 0.5mm 알루미늄 필터, 9μm 해상도, 0.4° 단계로 180° 회전하는 마이크로 CT 스캐너를 사용하여 고정 두개골을 스캔합니다.
  2. NRecon 소프트웨어를 사용하여 이미지를 재구성합니다. CTAn 소프트웨어를 사용하여 분석합니다. 관심 영역을 시상 봉합사를 중심으로 하는 3 x 3mm 영역으로 정의합니다. BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th 를 계산합니다.
  3. 매일 변경하여 14일 동안 10% EDTA(pH 7.4)에서 샘플을 탈회합니다. 옥살산칼슘 테스트를 이용한 탈회화 완료 시험24.
  4. 파라핀 포매 공정: 등급이 매겨진 알코올을 통해 탈수하고 자일렌에서 투명하게 파라핀으로 침투시킵니다. 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 절편합니다.
  5. 눈가림 확인: 임의의 세 자리 숫자를 사용하여 모든 샘플을 코딩합니다. 동료에게 코드 키를 유지 관리하도록 합니다. 치료 그룹에 대한 지식 없이 모든 분석을 수행합니다. 데이터 수집이 완료된 후에만 디코딩합니다.
  6. H&E 염색 수행: 탈파라핀화, 재수화, 헤마톡실린으로 5분 염색, 산성 알코올로 감별, 에오신으로 2분 염색, 탈수 및 마운트.
  7. 3.5단계와 같이 TRAP 염색을 수행합니다. 뼈 표면을 따라 TRAP 양성 다핵 세포를 계산합니다. mm 뼈 둘레당 숫자로 표현합니다.

10. 통계 분석

  1. G*Power 3.1을 사용하여 필요한 표본 크기를 계산합니다: 입력 효과 크기 f=0.8, α=0.05, 검정력=0.80, 그룹 수. 그룹당 최소 n을 기록합니다.
  2. SPSS 28.0에서 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규성을 검정합니다. p > 0.05를 정규 분포로 간주합니다. Levene의 검정을 사용하여 분산 동질성을 검정합니다. p > 0.05를 동일한 분산으로 간주합니다.
  3. 분포를 기반으로 적절한 검정 적용: 분산이 동일한 정규 데이터의 경우 모수 검정을 사용합니다. 두 그룹에 대해 짝을 이루지 않은 Student's t-test를 적용합니다. 여러 그룹의 경우 일원 분산 분석을 사용합니다.
  4. 사후 분석 수행: 유의미한 ANOVA(p<0.05)의 경우 모든 쌍별 비교에 대해 Tukey의 정직하게 유의한 차이 테스트를 적용합니다.
  5. 비정규 데이터에 비모수 대안 사용: 두 그룹에 대해 Mann-Whitney U 검정을 적용하고 여러 그룹에 대해 Dunn의 사후적 검정을 사용하여 Kruskal-Wallis를 적용합니다.
  6. 효과 크기 계산: t-검정의 경우 Cohen의 d, ANOVA의 경우 부분 eta 제곱.
  7. 소수점 이하 세 자리까지 정확한 p-값과 95% 신뢰 구간을 보고합니다. 정상 데이터는 평균 ± 표준 편차로, 비정상 데이터를 중앙값(사분위수 범위)으로 표시합니다.
  8. p < 0.05를 통계적으로 유의하다고 생각합니다. 다중 비교가 수행될 때 Bonferroni 보정을 적용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜의 성공적인 구현은 LY900009 여러 상호 연결된 메커니즘을 통해 파골세포 형성 및 기능에 강력한 억제 효과를 발휘한다는 것을 밝혔습니다. 골수 유래 대식세포의 초기 세포독성 평가는 24시간, 48시간 및 96시간에 각각 4.44μM, 3.66μM 및 2.93μM의 계산된 IC50 값으로 독성의 시간 의존적 증가를 입증했습니다(그림 1A,B). 중요한 것은 이러한 세포독성 농도가 치료적으로 효과적인 용량보다 상당히 높아 유리한 치료 기간을 설정했다는 것입니다. LY900009의 분자 구조는 그림 1C에 나와 있습니다. TRAP 염색 분석은 100 내지 400 nM 범위의 농도에서 파골세포 수와 크기 모두에서 유의한 감소와 함께 RANKL 유도 파골세포 형성의 용량 의존적 억제를 나타냈습니다(그림 1D-F).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

본 조사는 뼈 관련 장애에 대한 γ-세크레타제 억제제에 대한 관심 증가와 일치하여 파골세포 형성의 강력하고 선택적인 억제를 통해 LY900009가 골용해 질환에 대한 유망한 치료제를 나타낸다는 설득력 있는 증거를 제공합니다 14,20,21. 연구 결과는 이 γ-세크레타제 억제제가 Notch, MAPK, PI3K/Akt 및 NF-κB 캐스케이드를 포함한 여러 중요한 신호 전달 경로의 조정된 파괴를 통해 RANKL 유도 파골세포 형성 및 골흡수 기능을 효과적으로 억제한다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과의 치료적 중요성은 생체 내에서 LPS 유발 뼈 손실을 예방하는 화합물의 효능으로 입증된 바와 같이 기계론적 통찰력을 넘어 확장되며, 염증성 및 대사성 뼈 장애 관리에 대한 상당한 임상적 잠재력...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 이해 상충이 없음을 선언합니다. 저자는 이 작품에 언급된 상업 단체와 금전적 관계를 맺지 않습니다. 모든 저자는 ICMJE 공개 양식을 작성했습니다.

감사의 글

저자는 이 연구 과정에서 기술 지원과 도움을 준 산둥 제1의과대학 부속 중앙병원과 페이청 인민병원 직원들에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 또한 동물 실험에 대한 귀중한 토론과 도움을 준 실험실 동료들의 기여에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 세포 배양 플레이트코 닝3524면역형광 현미경
6웰 세포 배양 플레이트코 닝3516세포 배양 및 웨스턴 블롯
70% 에탄올시그마-알드리치E7023살균 및 소독
75% 에탄올시그마-알드리치E7148RNA 세척 완충액
96웰 세포 배양 플레이트코 닝3596세포 배양 및 분석
알루미늄 필터(0.5mm)브루커해당 사항 없음Micro-CT 스캐닝 필터
항-CD11b-FITC 항체바이오레전드101206유세포 분석 - 대식세포 마커
항절단 Notch1 항체 (토끼 단클론)세포 신호 전달 기술4147초웨스턴 블롯 - 노치 신호
항-F4/80-PE 항체바이오레전드123108유세포 분석 - 대식세포 마커
퇴색 방지 마운팅 매체벡터 연구소H-1000형광 현미경 장착
항-Hes1 항체(토끼 단클론)세포 신호 전달 기술11988년대웨스턴 블롯 - 노치 다운스트림 타겟
항-NFATc1 항체(마우스 단클론)산타크루즈 생명공학SC-7294 시리즈웨스턴 블롯 - 파골세포 마스터 레귤레이터
항-인-Akt(Ser473) 항체세포 신호 전달 기술4060년대웨스턴 블롯 - PI3K/Akt 신호
항인-ERK1/2(Thr202/Tyr204) 항체세포 신호 전달 기술4370초웨스턴 블롯 - MAPK 신호
항인-NF-&카파; B p65 (Ser536) 항체세포 신호 전달 기술3033초웨스턴 블롯 - NF-&카파; B 신호
항인산-p38 MAPK(Thr180/Tyr182) 항체세포 신호 전달 기술4511S웨스턴 블롯 - p38 MAPK 신호
항-&베타;-액틴 항체(마우스 단클론)세포 신호 전달 기술4970년대웨스턴 블롯 로딩 제어
자동 이미징 리더분자 장치ImageXpress 마이크로흡수 피트 정량화
BCA 단백질 분석 키트피어스/써모 피셔23225단백질 농도 측정
표백제(차아염소산나트륨 10%)시그마-알드리치425044흡수판에서 세포 제거
BSA(소 혈청 알부민)시그마-알드리치A7906면역형광을 위한 차단 완충액
C57BL/6 마우스(수컷, 5-8주령)찰스 리버 연구소27시험관 내 BMM 분리 및 생체 내 연구
옥살산칼슘 시험 시약시그마-알드리치C0350석회질 제거 완료 테스트
CCK-8 시약(Cell Counting Kit-8)도진도 분자기술CK04세포 생존력 평가
셀 스트레이너(70 & m)BD 팔콘352350골수 세포 여과
원심분리기(냉장)에펜도르프5424 R세포 및 시료 준비
클로로포름시그마-알드리치C2432RNA 추출 상 분리
CO2 챔버유타넥스 주식회사EX-075동물 안락사
CTAn 소프트웨어브루커버전 1.20Micro-CT 이미지 분석
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)시그마-알드리치디9542핵 대변염색
디메틸포름아미드(DMF)시그마-알드리치D4551TRAP 염색 용매
DMSO(디메틸설폭사이드)시그마-알드리치D2650차량 제어 준비
ECL 웨스턴 블로팅 기질피어스/써모 피셔32106웨스턴 블롯에서 단백질 검출
EDTA(10%, pH 7.4)시그마-알드리치E6758석회질 제거 용액
에오신 Y시그마-알드리치E4009H& E 조직학적 염색
패스트 레드 바이올렛 LB 소금시그마-알드리치F3381TRAP 염색 발색원
태아 소 혈청(FBS)Gibco/써모 피셔16140-071세포 배양 보충제
유세포 분석기BD 바이오사이언스FACSCaliburBMM 특성화
형광현미경올림푸스IX73 시리즈면역형광 이미징
G*Power 소프트웨어하인리히 하이네 대학교버전 3.1통계적 검정력 분석
유리 커버슬립(22 & 22 mm)피셔 사이언티픽12-541-B면역형광 현미경
그래프패드 프리즘GraphPad 소프트웨어버전 9.0IC50 계산 및 그래프 작성
헤마톡실린시그마-알드리치H3136H& E 조직학적 염색
혈구계하우스 사이언티픽3200세포 계수
고용량 cDNA 역전사 키트어플라이드 바이오시스템4368814RNA에서 cDNA 합성
HRP 접합 항마우스 IgG세포 신호 전달 기술7076S웨스턴 블롯 2차 항체
HRP 접합 항토끼 IgG세포 신호 전달 기술7074S웨스턴 블롯 2차 항체
하이드록시인회석 코팅 96웰 플레이트코닝 바이오코트354651골흡수 기능 분석
이미지JNIH버전 1.53e이미지 분석 및 정량화
인큐베이터(CO2)써모 피셔51033058세포 배양 유지 관리
적외선 이미징 시스템바이오 래드케미독 MP웨스턴 블롯 검출
도립 현미경올림푸스CKX41 시리즈세포 배양 모니터링, TRAP 계수
이소프로파놀시그마-알드리치I9516RNA 침전
LPS(대장균의 지질다당류)시그마-알드리치L4391생체 내 염증성 골 흡수
LY900009(&감마-세크레타제 억제제)셀렉 케미칼S7999테스트 화합물 - 파골세포 억제제
M-CSF(대식세포 콜로니 자극 인자)R& D 시스템416-ML-010대식세포 생존 및 파골세포 분화
Micro-CT 스캐너브루커스카이스캔 1272뼈 미세구조 분석
마이크로플레이트 리더바이오텍시너지 H1흡광도 측정(CCK-8)
마이크로톰라이카2255 링깃조직학적 절편
나프톨 AS-MX 인산염시그마-알드리치N5000TRAP 염색 기질
바늘(25 G, 27 G)BD305122, 305109골수 세척, 주사
NRecon 소프트웨어브루커버전 1.7Micro-CT 이미지 재구성
석랍시그마-알드리치P3683조직 포매
파라포름알데히드(4%)시그마-알드리치P6148세포 및 조직 고정
PBS(인산염 완충 식염수)Gibco/써모 피셔14190-144세포 세척 및 완충액 준비
펜토바르비탈 나트륨시그마-알드리치P3761동물 마취 및 안락사
포스파타제 억제제 칵테일로슈4906837001인산화 보존
PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스어플라이드 바이오시스템A25742정량적 실시간 PCR
프로테아제 억제제 칵테일로슈11697498001단백질 분해 방지
PVDF 멤브레인(0.45 & m)바이오 래드1620177웨스턴 블롯 단백질 전사
RANKL(NF-&kappa의 수용체 활성화제; B 리간드)R& D 시스템462-TEC-010파골세포 분화 유도
실시간 PCR 시스템어플라이드 바이오시스템7500 고속정량적 유전자 발현 분석
로다민-팔로이딘Invitrogen/써모 피셔R415F-액틴 시각화
RIPA 버퍼세포 신호 전달 기술9806에스단백질 추출
RNase가 없는 물앰비온/써모 피셔AM9937RNA 용해 및 PCR
SDS-PAGE 젤 (10%)바이오 래드4561036웨스턴 블롯 단백질 분리
탈지분유바이오 래드1706404웨스턴 블롯 차단
아세트산나트륨 완충액(0.1 M, pH 5.0)시그마-알드리치에스2889TRAP 염색 완충액
주석산나트륨(50mM)시그마-알드리치에스4297TRAP 염색 특이성
분광 광도계써모 피셔나노드롭 2000RNA/단백질 농도 측정
스프스IBM 주식회사버전 28.0통계 분석
주사기(1mL, 10mL)BD309659, 309604골수 세척, 주사
T75 세포 배양 플라스크코 닝430641기본 BMM 배양
TBST(0.1% Tween-20 함유 트리스 완충 식염수)바이오 래드1706531웨스턴 블롯 세척 완충액
전송 버퍼바이오 래드1704270웨스턴 블롯 단백질 전사
트리톤 X-100시그마-알드리치T8787세포 투과성
트리졸 시약Invitrogen/써모 피셔15596026총 RNA 추출
트리판 블루 (0.4 %)시그마-알드리치T8154세포 생존력 평가
트립신-EDTA(0.25%)Gibco/써모 피셔25200-056세포 수확 및 분리
웨스턴 블롯 전사 시스템바이오 래드트랜스 블롯 터보멤브레인으로의 단백질 전달
자일렌시그마-알드리치엑스3750조직 처리 및 청소
&알파;-MEM(알파 미니멀 에센셜 매체)Gibco/써모 피셔12561-056세포 배양 배지

참고문헌

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

파골세포 분화 억제LY900009RANKL 유도 파골세포골흡수골수 유래 대식세포웨스턴 블롯TRAP 염색MAPK Akt 경로
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.