연구 논문

쥐의 급성 철저한 운동으로 인한 힘줄-뼈 접합부의 미세 손상: 미세구조 변화 및 메커니즘

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DOI:

10.3791/69184

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2025년 11월 14일

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1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

이 논문에서

요약

본 연구는 급성 철저한 운동으로 인한 힘줄-뼈 접합부의 미세구조적 변화와 기전을 탐색하는 것을 목적으로 하였다. 급성 철저한 운동은 힘줄-뼈 접합부에서 미세 손상을 유도하여 ER 스트레스와 매개된 세포사멸 신호 전달 경로를 일시적으로 활성화합니다. 그럼에도 불구하고 이러한 미세 부상과 ER 스트레스는 운동 후 점진적으로 회복될 수 있습니다.

초록

힘줄-뼈 접합부(골부착부)에서 운동으로 인한 미세 손상은 건병증을 유발할 수 있습니다. 급성 철저한 운동 후 골부착부 내의 미세구조 변화와 메커니즘을 조사하면 건병증에 대한 이해를 높이고 임상 치료를 안내할 수 있습니다. 이 연구에서 36마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 대조군과 철저한 운동의 두 그룹으로 무작위로 배정했습니다. 철저한 운동 그룹은 운동 후 시간을 기준으로 0시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간의 5개 하위 그룹으로 더 세분화되었습니다. 헤마목실린-에오신 염색과 전자현미경을 사용하여 종골 힘줄-뼈 접합부의 변화를 조사했습니다. 힘줄-뼈 접합부에서 소포체 스트레스(ERS) 관련 단백질 GRP78, CHOP 및 Caspase-12의 발현은 면역조직화학(IHC)을 사용하여 정량화되었습니다. 급성 철저한 운동 후, 철저한 운동을 한 쥐의 힘줄-뼈 접합부는 상당한 구조적 변화를 보였습니다. 연골 세포와 콜라겐 섬유는 ERS를 나타내는 주목할만한 미세 구조 변화를 나타냈습니다. ERS 단백질 수치는 운동 직후 증가하여 6시간에 정점에 도달했습니다. 이러한 단백질 수치는 운동 후 12시간에 감소하기 시작하여 48시간까지 기준선으로 돌아왔습니다. 결론적으로, 급성 철저한 운동은 쥐의 힘줄-뼈 접합부에서 미세 손상 및 소포체 스트레스를 유발하지만 돌이킬 수 없는 손상은 발생하지 않습니다. 이러한 미세 부상을 적시에 치료하고 수리하면 과도한 손상과 건병증의 발병을 예방할 수 있습니다.

서론

아킬레스건병증은 잦은 발목 과사용 부상으로 인해 발생하는 일반적인 임상 상태입니다. 이 장애는 힘줄 부종, 통증 및 기능 장애를 특징으로 합니다. 이는 노인과 운동선수, 특히 달리기 선수와 점퍼 선수에게 더 널리 퍼져 있습니다. 아킬레스건병증은 비삽입성 건병증과 삽입성 건병증으로 분류됩니다. 비삽입성 건병증은 뼈 삽입 위 2-6cm의 힘줄에 영향을 미치는 반면, 삽입성 건병증은 힘줄-뼈 접합부1에 영향을 미칩니다. 더욱이, 비삽입성 건병증은 과체중, 노인, 활동량이 적은 사람에게서 발생하는 경향이 있는 반면, 삽입성 건병증은 활동적인 사람에게서 발생하는 경향이 있습니다1.

힘줄이 뼈에 삽입되는 힘줄-뼈 접합부는 석회화되지 않은 섬유연골과 석회화된 섬유연골을 포함하여 힘줄 조직에서 뼈 조직으로의 점진적인 전환을 포함합니다2. 이러한 변화는 부드럽고 유연한 힘줄 조직에서 단단한 뼈로의 전환을 제공합니다. 공학적 용어로 이 영역은 앵커 포인트 역할을 하여 관절 움직임을 촉진하기 위해 근력을 전달합니다 3,4. 따라서 이 부위는 스트레스가 집중되는 부위이며 스포츠에서 일반적으로 과도한 사용 부상을 입습니다.

임상 연구는 주로 비삽입성 건병증에 초점을 맞추고 있으며, 힘줄-뼈 접합부2의 삽입성 건병증에는 덜 관심을 기울였습니다. 연구에 따르면 과도한 사용 부하가 콜라겐의 무질서와 단편화, 지방 조직 침윤 및 힘줄의 혈관신생을 촉진합니다. 또한 석회화되지 않은 섬유연골 영역과 석회화된 섬유연골 영역 모두에서 섬유연골 세포 증식, 연골내 골화 및 뼈 박차를 유발합니다5. 그러나 최근 연구에 따르면 근육 수축 패턴은 삽입성 건병증에서 운동량보다 더 중요한 역할을 할 수 있습니다 6,7. 따라서 남용이 힘줄-뼈 접합부에 미치는 영향을 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이전 연구에서는 장기간 점프나 달리기와 같은 과도한 사용이 이러한 교차로에 미치는 영향을 조사했습니다. 그러나 급성 철저한 운동의 영향을 조사한 사람은 거의 없습니다. 최근 연구에 따르면 급성 운동은 쥐의 신장에서 소포체 스트레스를 유발하여 IL-6 신호 전달 및 열 충격 단백질(HSP)의 상향 조절과 미토콘드리아 호흡 복합체 mRNA8의 감소를 나타냅니다. 이러한 변화가 힘줄-뼈 접합부에서 발생하는지 여부는 보고되지 않았습니다. 이 연구는 급성 철저 운동에 의해 유발되는 변화와 근본적인 메커니즘을 밝히기 위해 힘줄-뼈 접합부(골부착부)에 초점을 맞춥니다. 이 발견은 삽입성 건병증에 대한 예방 전략 개발에 기여하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 쓰촨성 고등 한의학 연구소 과학기술부에서 제정한 실험동물 윤리기준(승인번호: 2023DS01)에 따라 수행되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 실험 설계 및 절차

  1. 마리
    36마리의 수컷, 12주 된 CD-Sprague-Dawley 쥐를 사육하고 실험 기간 동안 자유롭게 먹이를 제공했습니다. 환경은 20-25°C의 온도와 50%-60%의 습도 수준으로 유지되었으며 12시간의 밝음/암흑 주기가 있었습니다.
  2. 그룹 디자인
    일주일간의 적응 급식 후, 쥐는 대조군(Con, n = 6) 또는 철저한 운동 그룹(EE, n = 30)에 무작위로 배정되었습니다. EE 그룹의 쥐는 10도 경사의 오르막 런닝머신에서 3일 동안 15분 동안 10m/min의 속도로 달리는 적응 훈련을 받았습니다. 적응 훈련 후 EE 그룹은 철저한 운동 후 0시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간의 5개 시간 하위 그룹으로 더 나뉩니다.
  3. 개입 절차
    대조군의 쥐는 운동을 하지 않은 반면, EE 그룹의 쥐는 10도 경사의 오르막 런닝머신에서 철저한 달리기를 했습니다(그림 1A). Bedford 프로토콜9에 따라 운동 부하를 세 가지 수준으로 나누었습니다: 15분 동안 10m/min의 레벨 1, 15분 동안 15m/min의 레벨 2, 탈진할 때까지 20m/min의 레벨 3(그림 1B). 반복적인 저강도 전기(150V, 0.5mA 교류) 및 소리 자극(70dB)에도 불구하고 쥐가 더 이상 달릴 수 없고 1분 10 미만의 기간 내에 트랙에 세 번 갇혀 있을 때 탈진이 결정되었습니다.

쥐는 지정된 시간(철저한 운동 후 0시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간)에 3% 펜토바르비탈나트륨(200mg/kg)의 과도한 복강내 주사 를 통해 희생되었습니다. 종골의 피부와 피하 조직을 조심스럽게 해부하고 아킬레스건을 종골 위 2cm에서 안과용 가위로 절단했습니다. 오른쪽 종골(부착된 아킬레스건 포함)은 조직병리학적 검사 및 면역조직화학적 검사를 위해 4% 파라포름알데히드로 보존되었습니다. 또한, 초미세구조 변화를 연구하기 위해 전자현미경을 위해 왼쪽에서 3개의 무작위 샘플을 2% 파라포름알데히드-2.5% 글루타르알데히드 용액에 보관했습니다( 그림 1C).

2. 힘줄-뼈 접합부 조직학

샘플을 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 실온(20-25°C)에서 4주 동안 15% EDTA로 석회질을 제거했으며 용액을 매일 교체했습니다. 석회질 제거 과정은 힘을 가하지 않고도 바늘로 뼈를 쉽게 뚫을 수 있을 때 종료되었습니다. 석회질 제거 후, 샘플은 등급이 매겨진 일련의 에탄올과 자일렌을 포함하는 자동화된 공정을 통해 탈수를 거친 후 PBS로 세 번 세척했습니다. 샘플을 파라핀에 시상으로 포획하고 5μm에서 절편했습니다. 헤마톡실린-에오신 염색은 표준 절차에 따라 수행되었으며, Panthera 디지털 삼안 마이크로카메라 시스템으로 20× 및 40× 배율로 이미지를 캡처했습니다.

3. 전자현미경 스캔

왼쪽 샘플에 2% 파라포름알데히드-2.5% 글루타르알데히드를 48시간 동안 접두사로 붙인 다음 일련의 아세톤 용액에 탈수하고 에폭시 경화 분석기에 침투시킨 다음 시상으로 포매했습니다. 힘줄-뼈 접합부 영역을 식별하기 위해 메틸렌 블루를 사용하여 반박 절편을 염색했습니다. 약 60-90nm 두께의 초박형 절편을 다이아몬드 나이프를 사용하여 절단했습니다. 이 절편을 10-15분 동안 우라닐 아세테이트로 염색한 다음 1-2분 동안 구연산납으로 염색했습니다. 섹션은 6000×,12000× 및 25000×의 배율로 투과 전자 현미경으로 검사되었습니다.

4. 면역조직화학적 분석

힘줄-뼈 접합부는 이전에 설명한 대로 일상적으로 석회질을 제거하고 절편했습니다. 구연산염 완충 항원 회수 용액과 함께 10분 동안 배양한 후, 샘플을 3%H2O2 로 10분 동안 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 차단한 후, 25°C에서 20분 동안 정상 염소 혈청으로 차단하였다. 그런 다음 절편을 GRP78(1:100)을 포함하는 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. CHOP(1:100) 및 Caspase-12(1:100). 그 후, 샘플을 25°C에서 2시간 동안 2차 항체와 함께 배양했습니다. 25°C에서 8분 동안 DAB를 사용하여 발색을 달성하여 갈색-노란색 양성 신호를 얻었습니다. 핵을 헤마톡실린으로 3분 동안 재염색했습니다. Image-Pro Plus 6.0 소프트웨어를 사용하여 평균 밀도를 분석했습니다. 힘줄-뼈 접합부 영역의 3개 관심 영역(힘줄, 섬유연골 및 광물화된 섬유연골)을 선택하여 분석하고 평균값을 계산했습니다.

5. 통계 분석

GraphPad Prism 8을 사용하여 데이터를 분석하고 차트를 생성했습니다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 서로 다른 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석을 사용하여 이루어졌으며 쌍별 비교에는 LSD(Least Significant Difference) 테스트를 사용했습니다. < 0.05의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

그림 2A에서 볼 수 있듯이 대조군에서는 힘줄-뼈 접합부의 연골세포와 콜라겐 섬유세포가 규칙적으로 배열되어 있으며 섬유연골과 광물화된 섬유연골 사이에는 조수표(노란색 화살표)로 알려진 부드러운 파란색 선이 있습니다. 철저한 운동 그룹에서는 힘줄-뼈 접합부에서 미세구조 변화가 발생했습니다. 이러한 변화에는 연골 세포의 증가(녹색 원), 콜라겐 섬유의 얇아짐 및 파열(파란색 화살표), '불꽃' 또는 닫힌 원(빨간색 화살표)과 유사한 상승 또는 불규칙한 파란색 선으로 나타나는 조수의 변화가 포함됩니다. 이러한 변화는 운동 후 0시간 및 6시간에 가장 두드러졌습니다(그림 2B,C). 그러나 미세구조 변화는 회복 기간(운동 후 12시간, 24시간 및 48시간)에 걸쳐 점차적으로 회복되...

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토론

골부착부 또는 삽입 부위라고도 하는 힘줄-뼈 접합부는 힘줄을 뼈에 삽입할 수 있게 하며 인대와 힘줄이 뼈에 부착되는 스트레스 집중 부위입니다4. 앵커 포인트로서 발목의 움직임을 촉진하고, 종아리 근육의 수축력을 발 인대와 힘줄에 전달하며, 발목과 발의 움직임에 참여한다2. 힘줄-뼈 접합부는 힘줄, 섬유연골, 광물화된 섬유연골 및 뼈 2,3의 4개의 연속 영역으로 구성됩니다. 섬유연골에서 광물화된 섬유연골로의 전이 영역에는 조수표시 4,11,12,13으로 알려진 파란색 선이 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 자연과학재단(보조금 번호 23ZRYB03), 연구 및 혁신 팀 프로젝트(TD-2022-04), 임상 의학 과학 및 교육 혁신 그룹 및 쓰촨성 한의학 대학의 지원과 쓰촨성 한의학 총국이 자금을 지원하는 2025년 연구 프로젝트(25MSZX329)에 진심으로 감사를 표하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2% 파라포름알데히드 - 2.5% 글루타알데히드 용액MKBio, 중국MM1515,  전자현미경 스캔
항-카스파제12항체항저우 화안 바이오테크놀로지 유한회사.HA500144면역조직화학 분석
항-CHOP 항체항저우 화안 바이오테크놀로지 유한회사.ET1703-05면역조직화학 분석
항-GRP78 항체항저우 화안 바이오테크놀로지 유한회사.ER1706-50면역조직화학 분석
생체현미경모틱 인더스트리얼 그룹 유한회사, 중국BA210디지털힘줄-뼈 접합부 조직학을 위한 생체현미경 면역조직화학적 분석
CD-스프래그-도울리 쥐베이징 비탈 강 실험동물기술유한회사.SCXK2021-0007 CD
시트레이트 완충 항원 회출액ZSGB-바이오, 중국ZLI-9065,  면역조직화학 분석
DAB 그리고 nbsp; ZSGB-바이오, 중국ZLI-9018 면역조직화학 분석
EDTA시노팜 치미컬 리건트 주식회사10009717헤마톡실린-에오신 염색 
에폭스 812시노팜 치미컬 리건트 주식회사XW00000020전자현미경 스캔
에탄올 시노팜 치미컬 리건트 주식회사10009218헤마톡실린-에오신 염색 
그래프패드 프리즘 8 그래프패드 소프트웨어 주식회사그리고 nbsp; 그래프패드 프리즘 8 통계 분석
H2O2nbsp;시노팜 치미컬 리건트 주식회사011092708면역조직화학 분석
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파라포름알데히드 시노팜 치미컬 리건트 주식회사20230408헤마톡실린-에오신 염색  면역조직화학 분석
PBSZSGB-바이오, 중국ZLI-9062전자현미경 스캔
투과 전자현미경일본 전자광학 연구소 주식회사JEM-1400Flash, 일본전자현미경 스캔
쥐와 쥐를 위한 러닝머신 마우스바이오메드 이지 테크놀로지스 주식회사; 중국SA101러닝머신에서 강도 높은 운동을 했습니다
자일렌시노팜 치미컬 리건트 주식회사10023418헤마톡실린-에오신 염색 

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