방법 논문

FLEX: 초파리 초파리에 대한 비행 운동 훈련 프로토콜

DOI:

10.3791/69217

⸱

2025년 10월 14일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, LSU School of Veterinary Medicine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜의 목표는 초파리 초파리에게 비행 운동을 제공하는 것입니다. 대표적인 결과는 비행 운동 훈련이 유산소 능력과 고지방 식단에 대한 저항력을 증가시키는 결과를 보여줍니다.

초록

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초파리는 최근 비만 및 관련 장애를 연구하는 데 널리 사용되는 모델이 되었습니다. 특정 식단을 사용하여 초파리에서 대사 장애를 유발하는 것은 상대적으로 쉽지만 파리를 위한 운동 모델을 만드는 것은 더 어렵습니다. 파워 타워 및 트레드휠과 같은 기존 방법은 흔들리거나 회전하는 바이알을 활용하여 파리가 올라가도록 유도하고 부정적인 지오택시 반응을 활용합니다. 그러나 장시간 지속적인 등반은 파리에게 부자연스럽고 운동 관련 부상과 사망으로 이어질 수 있습니다. 이 논문에서는 파리의 자연스러운 비행 능력을 활용하여 보다 자연스럽고 생리학적이며 부상 없는 운동 접근 방식을 제공하는 새로운 운동 프로토콜을 소개합니다. 실험에 따르면 5일간의 비행 운동 요법은 파리의 생체 에너지 능력을 증가시키고 서양식 식단(WD)의 부작용을 상쇄하여 등반 행동을 개선하고 WD 관련 사망률을 감소시킵니다. 이 프로토콜을 사용하면 많은 수의 파리를 동시에 훈련시켜 운동과 식이요법, 약물, 노화 및 유전학을 포함한 다양한 요인 사이의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 운동이 파리 생리학 및 행동에 미치는 영향을 연구하기 위한 기존 방법을 함께 보완할 수 있습니다.

서론

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신체 활동과 운동은 즉각적이고 장기적인 건강상의 이점에 대한 집중적인 연구의 초점입니다1. 신진대사에 대한 강력한 전신 효과로 인해 운동은 대사, 심혈관 및 신경 장애를 예방하고 치료하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다 2,3,4. 규칙적인 운동과 관련된 수많은 건강상의 이점에 대한 증거가 증가하고 있음에도 불구하고 이러한 이점을 뒷받침하는 정확한 분자 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다5. 이러한 메커니즘을 이해하려면 혁신적이고 처리량이 많은 동물 모델을 사용하는 것이 필수적입니다. 설치류 모델은 일반적으로 운동이 대사 질환에 미치는 영향을 조사하는 데 사용되지만 이러한 연구에는 상당한 비용, 규제 감독 및 특수 장비가 필요합니다 6,7.

최근 Drosophila melanogaster는 운동 생물학 연구를 위한 새로운 모델로 등장했습니다(검토 8,9,10). 다양한 강력한 유전 도구, 짧은 수명주기, 광범위한 자손 및 경제적인 유지 관리 요구 사항을 갖춘 초파리는 유전적, 후성유전적 및 세대 간 메커니즘을 조사하는 데 귀중한 자원을 제공합니다. 파리의 운동을 모델링할 때 현재 방법은 일반적으로 위로 올라가는 행동 반응인 음의 지오택시에 의존합니다11,12.

최초의 자동 운동 프로토콜 중 하나는 Power Tower11이라는 특수 운동 장치를 활용했습니다. 파워 타워는 동물이 있는 바이알을 반복적으로 들어 올린 다음 아래로 떨어뜨려 부정적인 지오택시 반응을 유도하는 모터 장치를 사용합니다11. 파워 타워에서 장기간 운동하면 연령과 관련된 이동성 및 심장 성능 저하가 크게 감소합니다13. 또한 파워 타워 요법은 파리에게 스트레스를 줄 수 있으며 과도한 훈련 강도는 부상이나 사망을 유발하는 것으로 보고되었습니다11.

이 문제를 해결하기 위해 트레드휠이라는 또 다른 운동 패러다임이 개발되었습니다14. 트레드휠은 또한 초파리의 부정적인 지오택시 반응을 활용하지만 파워 타워에서처럼 파리를 들어 올리고 떨어뜨리는 대신 동물이 담긴 유리병을 뒤집습니다. 파워 타워와 달리 이 방법은 파리에 더 부드럽고 운동 관련 부상과 사망을 예방합니다9. 그러나 트레드휠의 파리는 회전 운동에 익숙해질 수 있으며, 이는 결과의 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다12. 이 문제를 해결하기 위해 운동 중 활동을 측정하고 초파리 활동을 정량화하며 습관화를 설명하기 위해 운동 활동 모니터(LAM25H, Trikinetics)가 추가되었습니다. 그 후 시스템 이름은 회전 운동 정량화 시스템(REQS)12로 업데이트되었습니다.

흥미롭게도 초파리의 자연적인 비행 능력을 활용하여 운동을 모델링한 연구는 거의 없었습니다. 비행 연구의 주요 초점은 공중에서 호버링과 기동의 공기역학 및 생체역학적 측면에 있었습니다 15,16,17,18. 여러 연구에서19,20번 비행과 관련된 생리학적 및 세포적 메커니즘을 조사했습니다. 이 연구에서 비행 능력은 비행 분석(21,22)을 통해 평가되었으며, 여기서 개별 파리를 투명한 아크릴 상자에 방출하고 일정한 고도 및 비행을 유지하는 능력을 관찰했습니다23.

한 특정 연구에서 연구원들은 소용돌이 모양의 셰이커에 부착된 병에 파리를 넣어 유도 비행 운동의 효과를 조사했습니다. 셰이커는 프로그래밍 가능한 타이머(19)를 사용하여 5분 내지 10분 사이의 임의의 간격으로 병을 부드럽게 흔들었다. 이 연구는 유도된 비행 행동이 노화를 가속화하고 비행 근육의 노화와 관련된 항산화 능력의 노화 관련 손실을 보고했습니다19. 이전 연구를 바탕으로 우리 연구실은 자동화된 네거티브 지오택시 시스템을 대형 컨테이너에 파리를 수용하여 FLEX(비행 운동)라는 새로운 운동 프로토콜을 개발했습니다24. FLEX 훈련을 위해 파리는 모터에 부착된 수평 플랫폼에 묶인 1갤런 투명 플라스틱 드럼 어항에 넣었습니다. 모터는 5분마다 모터 회전을 시작하는 타이머에 의해 제어되었습니다. 회전할 때마다 플랫폼이 올라갔다가 아래로 떨어지면서 파리가 날아갈 수 있었습니다. FLEX는 5일 동안 7시간 동안 매일 수행되었습니다. 운동과 관련된 사망이나 부상은 관찰되지 않았습니다24. 또한, 서양식 식단(WD)을 사용하는 파리의 5일 FLEX 요법은 WD의 부작용을 현저하게 무효화하여 생존, 등반 행동 및 미토콘드리아 호흡을 개선했습니다24. 이 논문은 부상을 일으키지 않는 자연스러운 비행 활동을 기반으로 하는 새로운 운동 패러다임을 제시합니다. 이것은 운동, 식이요법, 약물, 노화, 환경 및/또는 유전학 간의 상호 작용을 연구하기 위해 많은 수의 파리를 동시에 훈련시킬 수 있는 고처리량 절차입니다. 이 프로토콜은 신체 활동이 파리 생리학 및 행동에 미치는 영향을 연구하기 위해 기존 운동 방법을 보완하는 데 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 운동기구 설정 및 작동

  1. 대학 기계 공장에서 기계를 제작하세요. AC/DC 모터와 35mm x 35mm x 0.5mm 수평 알루미늄 플랫폼이 있는 35mm x 35mm x 1.4mm 직사각형 알루미늄 베이스를 사용합니다(그림 1A).
  2. 회전 운동을 선형 운동으로 변환하려면 모터에 장착된 직경 15cm의 맞춤형 회전 원형 캠을 제작합니다(그림 1B). 2cm 롤러가 있는 팔로워를 수평 플랫폼 바닥에 부착하여 플랫폼이 팔로워에 의해 들어 올려진 다음 팔로워 롤러가 캠을 지우면 원래 위치로 다시 떨어지도록 합니다.
  3. 전체 회전 주기가 약 5,360ms가 되도록 회전식 전위차계로 모터의 속도를 조정합니다.
    알림: 정확한 모터 사양, 팔로워 및 롤러의 치수, 캠 형상은 중요하지 않습니다. 파리를 쫓아내기 위해 플랫폼을 안정적으로 들어 올리고 떨어뜨리고 낙하 빈도에 대한 사용자 제어를 허용하는 모든 전동 구성은 허용됩니다.
  4. 나사 눈에 걸린 번지 코드로 1갤런 투명 플라스틱 드럼 어항을 플랫폼에 고정합니다(그림 1C).

2. FLEX 프로토콜

  1. 파리는 24°C 인큐베이터 또는 습도 60%와 12시간의 밝음/어두움 주기가 있는 방에 보관하십시오.
  2. 부화 후 3-4일 이내에 나이에 맞는 파리를 수집하십시오. 수집 후 파리를 운동 그룹과 앉아서 생활하는 그룹에 무작위로 할당합니다. 운동 그룹과 앉아서 생활하는 그룹 모두에 동일한 수의 파리를 사용하십시오.
    알림: 파리는 비행 운동을 방해하지 않으므로 그릇당 30에서 400 사이의 밀도로 수용할 수 있습니다. 그러나 비교 가능성을 보장하기 위해 실험군과 대조군은 항상 숫자, 성별 및 연령에 대해 일치해야 합니다.
  3. 앉아서 생활하고 통제하는 파리에게 7mL의 제형 식품을 제공하십시오. 테이프로 그릇에 식품 바이알을 고정합니다.
  4. 운동 요법을 시작하기 하루 전에 가볍고 짧은 CO2 마취를 사용하여 파리를 그릇으로 옮깁니다. 고무줄로 고정된 메쉬로 그릇의 입구를 덮습니다.
    알림: 파리는 패드의 가벼운 CO2 아래에서 잠시 마취해야 합니다. 지속적인 행동 영향을 피하기 위해 노출은 짧게 유지되어야 합니다. 따라서 운동 실험 1일 전에 마취를 시행해야 합니다.
  5. 번지 코드로 그릇을 플랫폼에 고정합니다. 운동 훈련은 온도 24°C, 습도 60%의 실내에서 실시합니다. 방의 습도가 조절되지 않으면 젖은 면 병을 어항에 넣고 유리병을 테이프로 그릇 벽에 고정하여 파리가 물에 접근할 수 있도록 하십시오.
  6. 대조 실험(가짜 운동)의 경우 운동 기구 옆에 위치하지만 플랫폼에 부착되지 않은 그릇에 동일한 수의 파리를 넣습니다.
  7. 운동은 연속 5일 동안 비행합니다.
    1. 두 개의 타이머로 모터를 제어합니다(그림 1D). 첫 번째 타이머는 하루 중 특정 시간에 기기를 켜고 끕니다. 오전 8시에 운동을 시작하여 오후 3시에 끝냅니다.
    2. 두 번째 타이머를 사용하여 일련의 세 번의 모터 회전을 시작하며 각 시퀀스는 5분마다 발생합니다. 회전할 때마다 플랫폼이 올라갔다가 아래로 떨어지면서 파리가 날아갑니다.
    3. 특정 날짜의 운동 치료가 완료되면 그릇을 인큐베이터로 되돌립니다. 이 프로토콜은 특정 실험에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.
      알림: 습도가 60% 미만이면 사망률이 증가할 수 있습니다. 소수의 파리는 첫 번째 낙하 후에 비행을 시작하지 않을 수 있지만 일반적으로 두 번째 또는 세 번째 낙하 후에 비행을 시작합니다. 모든 개체의 비행을 추적하는 것은 불가능하지만 대부분의 파리는 비행에 참여하며 모든 파리가 결국 운동에 참여한다고 가정합니다. 또한 대형 컨테이너는 낙하 사이에 자발적으로 비행할 수 있는 공간을 제공합니다.
  8. FLEX 요법이 끝나면 그릇을 냉장실에 5분 동안 두어 파리를 고정시킵니다. 그런 다음 표현형 특성의 추가 분석을 위해 파리를 새로운 식품 바이알로 옮기거나 관심 있는 분자 및/또는 생화학적 분석을 위해 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 추가 분석의 예로는 행동 및 생화학적 분석 및/또는 유전자 발현이 있습니다. 살아있는 파리와 관련된 분석은 표현형 분석의 특정 목표에 따라 즉시 수행되어야 합니다. 프로토콜은 수행할 평가에 따라 생화학/분자 생물학용 샘플을 동결 및 적절하게 보관하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 프로토콜의 요약은 표 1로 제공됩니다.

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결과

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FLEX 프로토콜은 이전에 우리 연구실에서 발표된 작업에서 검증되었습니다. 발표된 연구에서 우리는 비행 운동이 서양식 식단(WD)24의 부정적인 대사 효과를 완화한다는 것을 보여주었습니다. 이 다이어트는 표준 Nutri-Fly Bloomington 다이어트를 기반으로 15% Nutiva USDA 인증 유기농, 비 GMO, 레드 팜유, 15% 자당 및 0.1M NaCl을 첨가하여 만들어졌습니다.

운동이 WD의 부작용을 예방할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 생후 3-4일 된 성인 수컷 초파리를 다음 4개 그룹 각각에 무작위로 배정했습니다. 2) WD에서 앉아서 생활하는 파리; 3) CD(CDE)의 운동 파리; 4) WD(WDE)에서 운동 비행.

실험 결과 5일 FLEX 요법이 WD에서 파리의 사망률을 유의하게 감소시켰으며(~ 2배...

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토론

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FLEX 프로토콜은 비행을 통해 Drosophila melanogaster 의 유산소 운동을 유도하기 위한 새롭고 생리학적으로 관련된 방법을 제공합니다. 부정적인 지오택시와 기계적 교반에 의존하는 Power Tower 및 TreadWheel과 같은 전통적인 패러다임과 달리 FLEX는 파리의 타고난 비행 행동을 활용합니다. 이 접근법은 운동으로 인한 부상과 스트레스 반응을 최소화하여 운동 생물학을 위한 보다 안전하고 생물학적으로 적합한 모델이 됩니다.

곤충은 매우 높은 질량 특이적 대사율을 특징으로 하는 가장 에너지적으로 요구되는 유산소 활동 중 하나로 비행에 의존합니다26. 수백만 년의 진화를 통해 그들은 먹이를 찾는 동안 공중에 떠 있는 상태를 유지할 수 있는 호버링 비행을 개선했습니다. 초파리, 날개 박동은 1000Hz를 초과할 수 있으며, 동물계 전체에서 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 NIDDK R01DK129455(AKM)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
17 x 100 mm 14 mL 폴리프로필렌 배양관  VWR그리고 nbsp; 60818-689
1갤런 투명< > 플라스틱 드럼 어항 및 nbsp;펫코해당 없음펫코에서 구입 가능
8개 콘센트 서지 프로텍터와 7일 디지털 타이머BN-링크 EGPH020028아마존에서 구입 가능
AC/DC 모터 및 nbsp;데이턴  모델 12W368, 토크 80 IN-LBS
블루밍턴 포뮬레이션 식이 뉴트리플라이그리고 nbsp; 66-112샌디에이고, 캘리포니아의 Genesee Scientific Inc.에서 구입 가능
김-와이프스피셔 사이언티브06-666킴벌리-클라크 프로페셔널 34120
카운트다운과 무한 단축 사이클이 있는 다기능 프로그래머블 타이머 출구NEARPOW SPM10188153502아마존에서 구입 가능

참고문헌

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