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방법 논문

면역 세포 프로파일링을 위한 괴사성 소장결장염 및 Lamina Propria 분리의 신생아 마우스 모델

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/69233

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2025년 9월 19일

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 괴사성 소장결장염(NEC)의 신생아 마우스 모델 및 신생아 쥐 소장에서 고유판 면역 세포의 후속 분리를 설명합니다.

초록

괴사성 소장결장염(NEC)은 주로 미숙아에게 영향을 미치는 신생아 장의 심각한 염증성 질환입니다. NEC는 상피 손상, 미생물 세균 불균형 및 조절 장애 면역 반응을 특징으로 하며 종종 장 괴사 및 전신 염증을 유발합니다. 인간 질병의 주요 측면을 요약하는 실험적 쥐 모델은 질병을 유발하고 치료법 개발을 알리는 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 필수적이었습니다. 이 프로토콜은 분유 수유, 간헐적 저산소증, 지질다당류(LPS)의 경구 투여 및 NEC가 있는 영아로부터 배양한 장내 박테리아를 활용하는 괴사성 소장결장염(NEC)의 잘 확립된 신생아 마우스 모델을 설명합니다. 이 조합은 인간 영아에서 NEC와 일치하는 조직학적, 전사적 및 면역학적 특징을 안정적으로 유도하며 해당 분야의 여러 주요 발견의 기초가 되었습니다. 또한, 이 프로토콜은 신생아 마우스의 소장 고유층에서 면역 세포의 분리를 설명합니다. Lamina propria 세포 분리는 유세포 분석을 통해 상세한 면역 세포 프로파일링을 가능하게 하여 장 내 선천성 및 적응성 세포 집단의 분석을 용이하게 합니다.

서론

괴사성 소장결장염(NEC)은 거의 독점적으로 미숙아에게 영향을 미치는 심각한 장 염증성 질환입니다. 초저체중아(<1500g)의 약 7%-8%가 NEC의 영향을 받으며, 외과적 개입이 필요한 신생아의 경우 질병과 관련된 사망률이 50%에 육박할 수 있습니다1. NEC의 병인은 아직 불완전하게 이해되어 있습니다. 그러나 현재의 증거에 따르면 NEC는 미성숙한 장 장벽, 조절 장애 면역 신호 전달 및 불균형 미생물군집을 포함한 여러 요인의 합류로 인해 발생합니다 2,3,4. 이러한 요인의 수렴은 장에서 염증 반응을 시작하고 악화시킬 수 있으며, 특히 TLR4(Toll like receptor 4)의 활성화를 통해 상피 손상 및 세포사멸 및 괴사를 포함한 다양한 유형의 세포 사멸을 초래할 수 있습니다 5,6. 이 프로토콜의 목적은 인간 신생아에서 관찰되는 장 염증 및 장폐렴증(장벽 내의 가스)을 요약하여 질병 병인에 대한 기계론적 조사를 가능하게 하는 NEC의 재현 가능하고 생리학적으로 관련된 마우스 모델을 제시하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 신생아 마우스의 소장 고유층에서 면역 세포의 분리를 설명하여 연구자가 유세포 분석을 통해 면역 세포 프로파일링을 수행할 수 있도록 합니다.

신생아 쥐 또는 새끼 돼지와 같은 더 큰 동물 모델과 비교할 때7,8, 신생아 마우스 모델은 저렴한 비용, 형질전환 동물에 대한 더 큰 접근성, 더 큰 코호트에서 실험을 수행할 수 있는 능력 등 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 쥐 NEC 모델은 주로 분유 수유, 냉한 스트레스 및 저산소증의 조합을 활용하여 인간 환자에서 관찰되는 NEC의 복잡한 병태생리학을 시뮬레이션합니다 7,8,9. 그러나 NEC의 많은 쥐 모델은 광범위한 미생물 스트레스 요인 또는 미생물군의 인위적인 변경에 대한 의존성으로 인해 제한되어 임상적 관련성을 손상시킬 수 있습니다. 대조적으로, 이 프로토콜에 설명된 모델은 인간 영아의 NEC 병인과 관련된 몇 가지 핵심 요인을 통합하여 이러한 한계를 극복합니다10,11. 구체적으로, 이 모델은 장 장벽 무결성 3,12을 파괴하는 데 연루된 저산소 스트레스와 장 염증을 유발하는 잘 특성화된 TLR4 리간드인 지질다당류(LPS)가 보충된 유아용 조제분유의 경구 투여와 NEC totalis 환자로부터 배양한 장내 박테리아, 장의 범괴사를 특징으로 하는 가장 심각한 형태의 질병10,13. 이러한 임상적으로 관련성이 있고 질병에 특정한 스트레스 요인을 통합함으로써 우리 모델은 NEC의 임상 및 분자적 특징을 정확하게 반영합니다. 또한, 연구자에게 NEC 병인의 기초가 되는 면역 매개 메커니즘을 조사하기 위한 프레임워크를 제공하기 위해 이 프로토콜은 유세포 분석을 위해 신생아 쥐 소장에서 고유층 세포를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 장 점막 면역 활동의 주요 부위인 고유층에는 NEC 관련 염증에서 중심적인 역할을 하는 상주 및 침윤 면역 세포의 동적 레퍼토리가 포함되어 있습니다14. 유세포 분석법은 이러한 면역 세포 집단을 고해상도로 특성화하기 위한 강력하고 확장 가능한 플랫폼을 제공하여 세포 표현형의 상세한 분석, 면역 반응의 정량화 및 NEC 병인과 관련된 면역학적 시그니처의 식별을 가능하게 합니다15.

이 프로토콜에 설명된 쥐 NEC 모델은 신생아 장의 복잡한 환경 내에서 숙주-마이크로바이옴 상호 작용, 면역 반응 및 염증 신호 전달에 대한 연구를 가능하게 함으로써 시험관 내 모델을 보완합니다. 시험 관 내에서 모델링할 수 없는 NEC 병인의 주요 측면을 재현하여 질병 메커니즘을 밝히고 치료 전략을 평가하는 데 유용한 도구입니다. 종별 차이는 여전히 한계로 남아 있지만 이 모델은 NEC에 대한 이해를 높이고 표적 개입 개발을 가속화할 수 있는 강력하고 접근 가능한 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

모든 방법은 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 제공하는 윤리적 지침에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 채플힐 의과대학에 있는 노스캐롤라이나 대학교의 IACUC(프로토콜 번호 24-114)에서 승인한 연구 제안에 따라 실험 동물의 관리 및 사용 가이드에 설명된 절차에 따라 사육, 유지 및 사육되었습니다. C57BL/6J 마우스는 이 연구에서 설명된 모든 실험에 사용되었습니다. 새끼는 출생 후 4일째에 모델에서 시작되었으며 무게는 1.8-2.3g 사이였습니다. 이 체중 범위를 벗어난 동물은 제외되었습니다. 실험 코호트는 균형 잡힌 성별 분포를 가졌으며 수컷과 암컷이 각각 치료받은 동물의 약 50%를 차지했습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 쥐 NEC 모델

참고: 장내 세균 스톡은 가장 심각한 형태의 NEC를 가진 영아로부터 장내 내용물을 얻어 생성되며, NEC 총계는13,16입니다. 장용 내용물을 37°C에서 16시간 동안 1 x g로 하룻밤 배양하고, 4°C에서 10분 동안 3000 x g로 원심분리하고, 50% 글리세롤에 재현탁한다. 20μL 분취량을 냉동 바이알에 피펫팅하고 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관합니다. 이 프로토콜에서 선택된 배양 시간은 워크플로 효율성을 위해 선택되었습니다. 이러한 시점은 전체 모델에 영향을 주지 않고 개별 실험실 일정을 수용하기 위해 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 최대 40마리의 마우스 용량에 최적화되어 있지만 필요에 따라 확장할 수 있습니다.

  1. 박테리아 배양 준비
    1. 실험 0일 15:00에 NEC totalis 가 있는 영아로부터 배양한 장내 박테리아 20μL 분취량을 2mL의 Luria-Bertani(LB) 국물이 들어 있는 15mL 배양 튜브에 추가합니다. 37°C, 1 x g의 궤도 셰이커에서 통풍 위치에 있는 튜브 뚜껑과 함께 박테리아 배양액을 16시간 동안 밤새 배양하고, LB 오염을 평가하기 위한 대조군으로 2mL의 LB 국물만 들어 있는 배양 튜브를 동시에 배양합니다.
      1. 박테리아 배양과 투명한 LB 전용 대조군 사이의 탁도를 비교하여 하룻밤 배양을 육안으로 확인합니다. 박테리아 배양이 탁하게 보이고 대조군이 명확하게 유지되는 경우에만 진행하십시오.
    2. 실험 1일, 07:00에 접종된 하룻밤 배양액 125μL를 25mL의 LB 국물이 들어 있는 통풍 뚜껑이 있는 T75 세포 배양 플라스크에 분취합니다. 총 4개의 T75 플라스크를 준비하고 37°C, 1 x g의 궤도 셰이커에서 2시간 동안 똑바로 세운 자세로 배양하여 박테리아 배양을 확장합니다.
      참고: 하룻밤 배양은 NEC 모델의 실험일 0, 1 및 2일에 준비됩니다.
  2. 새끼를 실험 그룹에 할당
    1. 실험 1일차 07:00에 출생 후 4일째 새끼의 체중을 측정합니다.
      참고: 최적의 중량 범위는 1.8-2.3g 사이이며 이상값은 실험에서 제거해야 합니다.
    2. 실험 마우스를 분유 수유 및 댐 수유 코호트로 그룹화하고 분유 수유 마우스의 평균 체중을 계산합니다. 지정된 분유 수유 마우스를 댐에서 분리하고 37°C로 예열된 유아 인큐베이터에 보관된 새 케이지에 넣습니다. 댐에서 먹이를 준 새끼를 댐과 함께 원래 케이지에 보관하십시오.
      참고: 신생아 마우스는 주변 온도의 변화에 특히 민감합니다. 댐에서 분리된 후 일관된 온도 조절을 유지하기 위해 분유를 먹인 새끼는 37°C로 설정된 온도 조절이 가능한 유아 인큐베이터에 보관됩니다. 이 접근법은 추가적인 열 개입 11,17,18,19를 사용하지 않고 생리학적 온도를 보존하는 확립된 NEC 프로토콜과 일치합니다.
    3. 실험 2일과 3일에 반복하여 분유를 먹인 마우스의 무게를 측정하고 매일 07:00 수유 시점 이전의 평균 체중을 계산합니다.
  3. 박테리아 배양의 광학 밀도(OD) 측정
    1. 37°C 및 1 x g에서 2시간 배양한 후, 실험 1일, 2일 및 3일에 확장된 배양액이 있는 4개의 T75 플라스크를 궤도 셰이커에서 제거합니다. 4개의 T75 플라스크의 내용물을 결합하고 잘 섞은 다음 박테리아 배양액 1mL를 큐벳에 피펫으로 넣습니다.
      1. 큐벳에 멸균 LB 국물 1mL를 첨가하여 블랭크 용액을 준비합니다. 분광 광도계를 사용하여 600nm(OD600nm)에서 박테리아 배양의 광학 밀도를 측정합니다.
        참고: 목표 OD600nm 는 0.6 ± 0.02입니다. 박테리아 배양의 OD600nm 가 목표값보다 낮으면 1.3.1단계에 설명된 대로 배양을 계속합니다. 0.6 ± 0.02의 목표 OD600nm 에 도달할 때까지. OD600nm 가 0.6 이상이면 멸균 LB 국물로 박테리아 배양액을 희석합니다.
    2. 박테리아 배양액 80mL를 50mL 원심분리기 튜브 2개에 옮기고 4°C에서 10분 동안 3000 x g 으로 원심분리합니다. 각 튜브 바닥에 눈에 보이는 펠릿을 확인하여 성공적인 배양을 확인합니다.
  4. 공식 준비
    1. 실험 1일, 2일, 3일에 09:00에 분유 준비를 시작합니다. 유아용 조제분유 16mL와 강아지 우유 8mL를 멸균 50mL 원심분리기 튜브에 2:1 비율로 혼합합니다.
    2. 펠릿 박테리아 배양물이 들어 있는 두 개의 50mL 원심분리기 튜브에서 상청액을 제거합니다(단계 1.3.2).
    3. 두 펠릿 각각을 2mL의 포뮬러 믹스에 완전히 재현탁하고 재현탁액을 포뮬러 믹스로 옮겨 24mL의 NEC 포뮬러를 만듭니다.
      참고: NEC 공식의 최종 박테리아 농도는 4에서 5 x 109 CFU/mL 사이여야 합니다.
    4. 6개의 공급 시점(10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00) 각각에 대해 6개의 50mL 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다.
    5. NEC 포뮬러 4mL를 표지된 각 튜브에 피펫팅합니다.
    6. LPS(5mg/mL) 스톡의 일회용 분취량 6개를 준비하고 -20°C에서 결합력이 낮은 마이크로튜브에 보관합니다. 각 시점에서 수유하기 직전에 NEC 공식에 LPS(농도는 참고 참조)를 추가합니다.
      참고: NEC 공식에 추가되는 LPS의 양은 새끼 체중 그램당 5μg의 LPS 복용량을 사용하여 매일 07:00에 계산된 분유 수유 새끼의 평균 체중을 기준으로 합니다. 최종 LPS 농도는 체중에 따라 다릅니다. 예를 들어, 사료 공급량이 80μL이고 평균 강아지 코호트 체중이 2g인 경우 공식의 LPS 농도는 0.125mg/mL가 됩니다.
  5. 먹이
    참고: 실험 1일째에, NEC 모델에 배치될 마우스는 댐에서 분리된 후 3시간 동안 금식합니다. 첫 번째 NEC 분유 공급은 10:00에 있으며 3:22까지 00시간마다 계속됩니다. 실험 2일과 3일에는 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 및 22:00에 마우스에게 먹이를 줍니다. 실험 4일째에는 마우스에게 먹이를 주지 않습니다.
    1. 마우스에게 먹이를 주기 직전에, 15초 동안 LPS의 1개 분취량을 해동하고 소용돌이치게 합니다. 준비된 NEC 포뮬러의 4mL 튜브에 마우스의 평균 체중을 기준으로 적절한 양의 LPS를 첨가하고(계산은 단계 1.4.6 참조) 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.
    2. 1mL 주사기에 NEC 포뮬러를 채우고 신생아 말초 삽입 중심 카테터(PICC) 라인을 부착합니다. 주사기 또는 PICC 라인에 기포나 공기가 없는지 확인하십시오.
    3. PICC 라인으로 경구 위관을 통해 새끼에게 NEC 공식을 투여합니다.
      1. 목 밑부분의 느슨한 피부로 각 강아지를 부드럽게 제지하고 마우스를 똑바로 세운 자세로 잡습니다. 겸자를 사용하여 PICC 라인의 원위 끝을 구인두와 식도로 안내하여 PICC 라인의 끝을 위 안에 배치합니다.
        알림: PICC 라인의 삽입 거리는 입가에서 위장의 우유 반점 상단까지의 거리와 같습니다. 그런 다음 영구 마커를 사용하여 PICC 라인에 최적의 삽입 지점을 명확하게 표시해야 합니다.
      2. PICC 라인 삽입 중에 상당한 저항이 느껴지면 PICC 라인을 제거하고 위치를 변경한 다음 조심스럽게 삽입을 다시 시도하십시오.
      3. 8μL의 NEC 포뮬러를 위장에 천천히 분배하고 흡인의 징후가 있는지 먹이는 동안 강아지를 면밀히 모니터링합니다. 성공적인 위 분만을 확인하기 위해 흰 우유 반점이 나타나는지 관찰하십시오.
      4. PICC 라인을 제거합니다. 강아지에게 힘든 호흡이나 구토가 있는지 관찰하십시오. 강아지가 분유를 역류시키면 보푸라기가 적은 실험실 물티슈로 입과 코를 닦으십시오.
    4. 모든 수유 시점에서 이 과정을 반복합니다.
    5. 하루에 두 번 13:00 및 19:00 수유 시간 직후 10분 동안 새끼를 저산소증에 노출시킵니다.
      1. 하루에 두 번 먹이를 준 후 95%의 질소와 5%의 산소가 들어 있는 가스 탱크에 연결된 저산소증 챔버에 새끼를 넣습니다. 탱크 밸브를 열고 휴대용 모니터를 사용하여 밀폐된 저산소증 챔버 내의 산소 수준을 모니터링합니다. 저산소증 챔버가 5%± 0.5% 산소에 도달하면 새끼를 이 산소 수준에서 10분 동안 유지합니다.
        알림: 유속은 20분 동안 일정하고 제어된 속도로 5%에서 2%로 산소를 감소시키도록 최적화되어야 합니다.
    6. 수유 사이에 새끼 쥐에게 호흡 곤란, 창백한 변색 또는 무호흡증의 징후가 있는지 관찰하십시오. 이러한 징후가 나타나면 영향을 받은 강아지를 저산소증실에서 제거하고 회복 여부를 주의 깊게 관찰하고 필요한 경우 IACUC 정책에 따라 강아지를 안락사시킵니다.
    7. NEC 모델의 전체 72시간 기간 동안 예정된 시점에서 경구 위관 영양 공급과 저산소증 노출을 계속합니다.
      참고: 실험 1일이 월요일 10:00에 시작되는 경우 72시간 종점은 목요일 10:00에 발생합니다. 이것은 모델의 4일차로 지정됩니다. 마우스는 모델의 4일째 07:00에 먹이를 주지 않으며, 조직 수집을 위해 이 마지막 10:00 시점에 안락사됩니다.
  6. 동물을 안락사시키고 조직을 수집합니다.
    1. 모델 4일차 아침에 각 강아지의 체중을 측정하고 성별을 기록한 다음 IACUC 지침에 따라 안락사시킵니다.
    2. 안락사 후 각 강아지의 혈액을 응고 활성제와 젤이 들어 있는 혈청 분리 튜브에 채취합니다.
    3. 혈청을 분리하기 위해 4°C에서 20분 동안 16,000 x g 에서 원심분리합니다. 혈청을 표지된 1.7mL 튜브에 피펫팅하고 -80°C에서 보관합니다.
    4. 복벽과 복막을 통해 1-2cm 정중선 절개를 하여 위장관을 노출시킵니다. 팽창, 홍반, 장벽 내 가스 축적(장 기압증) 및 눈에 보이는 기포를 포함한 NEC의 특징이 있는지 노출된 장을 검사합니다.
    5. 원위 직장을 통해 십이지장을 식별하고 절제합니다. 얼음 위의 페트리 접시에 티슈를 놓습니다. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 장을 헹굽니다.
    6. 맹장을 식별하고 근위부로 절단하여 맹장과 결장을 소장에서 분리합니다. 원위 회장에서 시작하여 공장을 향해 작업하는 조각을 분리합니다. 전사 분석을 위해 RNA 용해 완충액과 1.5mm 산화 지르코늄 비드가 들어 있는 튜브에 1cm 조각을 얼음 위에 놓습니다.
      1. 24G 뭉툭한 끝 바늘에 부착된 PBS가 들어 있는 주사기로 1.5cm 조각을 세척한 다음 1mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1cm 장의 스냅 냉동 및 단백질 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다. 1cm 크기의 장 조각을 스냅 냉동하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
    7. 비드 비터(5.50m/s, 1.0분, 사이클 = 1.0, 일시 정지 체류: 10초, 4°C)에서 RNA 용해 완충액으로 수집된 조직을 처리하여 조직을 균질화한 다음 -80°C에서 보관합니다.
  7. 조직 고정
    1. 4% PFA로 수집된 조직 조각을 4°C의 로커에 놓아 24시간 동안 고정합니다. 24시간 후, 각 튜브에서 4% PFA를 제거하고 1mL PBS로 교체하여 조직을 세척합니다. 튜브를 4°C에서 15분 동안 로커로 되돌립니다. PBS 세척을 한 번 반복합니다.
      1. PBS를 제거하고 각 튜브에 1mL의 50% 에탄올을 첨가한 다음 튜브를 4°C에서 15분 동안 로커로 되돌립니다. 50% 에탄올을 제거하고 70% 에탄올 1mL를 첨가하고 조직이 파라핀 조직학 블록으로 처리될 수 있을 때까지 4°C에서 보관합니다.
        참고: 추가 장 분절 또는 대변 샘플은 추가 분석을 위해 필요에 따라 수집될 수 있습니다.

2. Lamina propria 면역 세포 분리

참고: 이 프로토콜은 약 1주일 생후 신생아 마우스로부터 고유층 세포를 분리하는 데 최적화되어 있습니다. 스펙트럼 유세포 분석을 위해 참조 샘플이 필요한 경우 이유식(출생 후 3-4주)을 사용할 수 있습니다. 이유식 샘플의 경우 프로토콜에 지정된 모든 시약 부피를 두 배로 늘립니다.

  1. 시약 준비
    1. 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)을 함유한 Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS W/O)가 없는 행크의 균형 염 용액 1개를 준비하고 실온에서 보관합니다.
    2. 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 PBS + 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에 용해시켜 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 제조하고 4°C에서 보관합니다.
    3. 고유층 세포 분리를 수행하기 전날, HBSS W/O에 5mM EDTA, 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 1mM 디티오스레이톨(DTT)을 첨가하여 사전 소화 용액을 준비합니다.
    4. Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(RPMI)에 10% FBS 및 mg/mL 콜라게나제 IV를 보충하여 고유층 세포 분리를 수행하기 직전에 소화 용액을 준비합니다.
      참고: HBSS W/O는 미리 준비하여 실온에서 보관할 수 있습니다. FACS 완충액은 미리 준비하고 4°C에서 보관해야 합니다. 사전 소화 및 소화 용액은 고유층 분리를 수행하기 직전에 신선하게 준비하고 얼음 위에 보관해야 합니다.
  2. 소화를 위한 장 조직 수집 및 준비
    1. 맹장을 찾아 근위부로 횡단하여 맹장과 결장을 제거합니다. 원위 소장(회장)의 2-3cm를 절제하고 페트리 접시의 얼음처럼 차가운 HBSS W/O에 놓습니다(1.6.5단계부터 재개).
    2. 주사기에 부착된 24G 뭉툭한 끝 바늘을 사용하여 집게로 조직을 안정화하면서 얼음처럼 차가운 HBSS W/O로 장 내강을 완전히 세척합니다. 세척 후 장 내강에 대변이 없는지 육안으로 확인하십시오.
    3. 가는 집게나 가위를 사용하여 장 분절에 남아 있는 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.
    4. 장을 세로로 잘라 열린 다음 가로로 1-1로 절편합니다. cm 세그먼트.
  3. Lamina propria 해리
    1. 얼음 위에서 냉각된 1mL의 사전 소화 용액이 들어 있는 1mL 원심분리 튜브로 장 분절을 옮깁니다.
    2. 조직 해리를 촉진하기 위해 샘플을 37°C에서 20분 동안 연속 회전으로 배양합니다.
    3. 튜브를 부드럽게 휘끈 다음 5mL 원심분리기 튜브 위에 놓인 10μm 세포 스트레이너를 통해 내용물을 붓습니다.
      참고: 10μm 스트레이너를 통해 수집된 여과액에는 상피내 림프구(IEL)가 포함되어 있으며 원하는 경우 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.
    4. 조직 조각을 37°C로 예열된 10mL의 분해 용액 10mL가 들어 있는 새로운 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 후, 샘플을 37°C에서 연속 회전시키면서 40분 동안 배양합니다.
    5. 전체 샘플을 자동화된 조직 해리 튜브로 옮기고 시계 방향과 시계 반대 방향 사이를 번갈아 가며 각각 15초씩 4개의 회전 주기로 구성된 해리 프로그램을 실행합니다.
      참고: 자동 조직 해리기의 대안은 두 개의 현미경 슬라이드의 반투명 팁을 사용하여 장 조직을 수동으로 분쇄하는 것입니다. 이 방법을 사용하는 경우 과도한 기계적 응력을 피하기 위해 부드럽고 균일한 압력을 가하면 세포 생존력이 크게 감소할 수 있습니다.
    6. 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이치게 한 다음 조직 해리 튜브에서 샘플을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 흡인한 다음 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 mL에 세포를 재현탁합니다.
    8. 10μm 세포 스트레이너를 5mL 원심분리기 튜브에 놓습니다. 재현탁된 세포 현탁액을 필터를 통해 옮긴 다음 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 mL를 추가로 세척합니다.
    9. 세포 수를 계산하고 트리판 블루 또는 생존율 염료를 사용하여 생존율을 평가합니다. 유세포 분석에 필요한 부피를 30× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 다운스트림 응용 분야에 세포를 즉시 사용하여 생존력과 마커 발현을 보존하십시오.

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결과

이 프로토콜에 설명된 NEC의 신생아 쥐 모델은 질병의 주요 특징을 복제합니다. Kaplan-Meier 생존 분석(그림 1A)은 댐 먹이를 먹인 대조군에 비해 NEC 치료군에서 생존율이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(9/21 대 8/8; p = 0.0063). 모델에 노출된 마우스의 장을 육안적으로 검사한 결과(그림 1B) 장 팽창, 기포 및 눈에 보이는 장폐렴 (장벽 내 가스 축적)을 포함하여 NEC의 특징적인 특징이 입증되었습니다. H&E 염색을 통한 조직학적 평가는 NEC 유사 장 손상이 있는 동물에서 융모 파괴의 고르지 못한 영역의 존재와 정상적인 장 구조의 파괴를 추가로 확인했습니다. 또한, 염증 유전자 발현에 대한 분자 분석은 인간 질병과도 관련된 주요 전염증성 마커의 강력한 상향 조절을 입증했습니다...

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토론

이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 NEC의 신생아 쥐 모델을 고유층 면역 세포 분리와 통합하여 장 염증 동안 점막 면역 반응을 조사하기 위한 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. 인간 NEC 사례의 장내 마이크로바이옴, 저산소 스트레스 및 분유 수유와 같은 임상적으로 관련된 노출을 결합함으로써 이 모델은 인간 질병에서 관찰되는 복잡하고 다인성 병인을 요약합니다10,13. 이 접근 방식은 동일한 장 조직의 전사 및 단백질체 분석과 함께 상세한 면역 표현형 분석을 가능하게 하여 NEC 병태생리학에 대한 고유한 통찰력을 제공하고 잠재적인 치료법을 평가합니다. 여기에서는 결과를 최적화하고 모델의 번역 관련성과 성공적인 실행을 극대화하기 위해 연구자가 해결해야 하는 주요 고려 사항과 제한 사항에 대해 논의합니다.

이 프로토콜에는 실...

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공개 사항

저자는 이 원고와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 원고는 R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, Chan Zuckerberg Initiative Grant 번호 2022-316749, Yang Biomedical Scholar Award 및 University of North Carolina at Chapel Hill 소아과의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Syringe for formula feeding
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator for mice
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
ParaformaldehydeThermo ScientificJ

참고문헌

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