방법 논문

레티놀 동위원소 희석 기법을 이용한 인간 대상 투여용 비타민 A 추적자 용량 조제

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DOI:

10.3791/69240

⸱

2026년 3월 31일

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

이 논문에서

요약

레티놀 동위원소 희석 기법에 필요한 안정 동위원소 표지된 비타민 A 제제는 식품 안전 기준을 충족해야 합니다. 프로토콜은 선택한 전달 시스템과 적용된 분석 플랫폼에 적합한 농도의 식물성 기름 용량 제조를 보여줍니다.

초록

레티놀 동위원소 희석(RID) 기법은 동위원소 표지된 비타민 A 추적자를 인간 대상자에게 투여하는 데 의존합니다. 여기서는 연구팀이 연구 및 인구 조사를 위해 비타민 A 안정 동위원소 추적자를 어떻게 준비할지 안내하는 방법을 제시합니다. 이 글은 추적자가 인간 섭취에 안전하도록 만들기 위한 준비, 재료, 장비 조달, 절차에 대해 개요를 제공합니다. 비타민 A 안정 동위원소 추적자는 상업적으로 얻을 수 있으며, 보통 중수소[2H] 또는 탄소-13[13C]로 표지되어 >95% 전면 이성질체와 >99% 동위원소 농축도를 가지고 있습니다. 비타민 A 안정 동위원소 추적소의 제제는 추적자를 식용 식물성 기름에 초음파 및 가열을 통해 녹이는 과정을 포함합니다. 추적자는 전달 시스템의 체적 한계 내에 충분히 있는 농도로 준비되어야 합니다. 마지막으로 추적자를 멸균 호박색 유리 바이알에 분리하고, 추적자 농도를 분광광도계로 확인합니다.

서론

비타민 A 결핍을 줄이기 위한 중재 프로그램의 효과적인 모니터링을 가능하게 하기 위해, 레티놀 동위원소 희석(RID) 방법은 다양한 인구 집단 1,2,3,4에서 전신 비타민 A 저장량(TBS) 정보를 제공하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 혈청 레티놀5, 혈청 레티놀 결합 단백질(RBP)6,7,8 및 수정 상대 용량 반응(MRDR) 검사9가 비타민 A 결핍증 확진에 자주 사용되지만, RID만이 전신 비타민 A 저장량을 아임상 결핍부터 독성까지 전 스펙트럼에서 정확히 정량화하는 유일한 방법입니다 3,10. 알려진 용량의 표지된 비타민 A를 투여하고 평형 후 혈장 내 희석 상태를 측정함으로써, RID 방법은 TBS와 간 비타민 A 저장량을 정확히 추정합니다11,12. 중요한 점은, RID 방법은 염증이 있는 집단에서도 신뢰성을 유지하여, 중복 보충 및 강화 프로그램에서 중재 효과 평가와 독성 위험 평가에 필수적이라는 점이다13,14.

RID 방법을 수행하기 위해서는 동위원소로 표기된 비타민 A를 경구 용량으로 투여해야 하며, 대부분의 경우 레티닐 아세테이트를 식용 식물성 오일에 용해한 것입니다. 대부분의 실험실은 상업 용 공급업체 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22에서 동위원소 표지된 비타민 A를 확보합니다. 거의 모든 상업적으로 이용 가능한 비타민 A 동위원소 추적자는 탄소-13 [13C] 또는 중수소 [2H]의 안정 동위원소를 사용하여 표지되어 있습니다(표 1). 적용된 동위원소 용량의 선택은 대량 표지된 레티놀의 혈청 또는 혈장 농도를 측정하는 데 사용되는 분석 장비에 따라 달라집니다. 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)과 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 [13C]와 [2H]22,23,24,25,26,27을 모두 분석할 수 있는 반면, 가스 크로마토그래피-연소-동위원소 비율 질량 분석법(GC-C-IRMS)은 표지된 레티놀 추적자만 [13C]만 분석할 수 있습니다 4,25,28. 선택한 분석 기기의 검출 한계, 대상 그룹(어린이 또는 성인), 조사 기간이 적용해야 할 용량3, 25, 29를 결정합니다. 현재까지 적용된 동위원소 용량은 3,4,30 소아에서 0.3 - 4.3 mg 레티놀 환산(RE; 1 - 15 μmol RE에 해당), 성인 2,3,31 소아에서는 0.6 - 10.0 mg RE(2 - 35 μmol RE에 해당)까지 다양했으며, 최근 연구에서는 어린이 0.3 - 0.6 mg RE(1 - 3 μmol RE)와 성인 0.6 - 2.0 mg RE(2 - 7 μmol RE)까지 낮은 용량을 적용했습니다. 비타민 A 용량이 높으면 비타민 A의 근본적인 반응학이 교란될 수 있다는 우려가 제기되었으나, 최근 구획 모델링을 이용한 분석 결과, 어린이에게 7 μmol RE, 성인에게 14 μmol RE까지 높은 동위원소 용량이 TBS 예측의 정확성에 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다29. 여기서는 식품 안전 문제를 고려하고 정확한 용량 농도를 얻으면서 RID 방법을 경구 적용할 동위원소 표지 추적자를 어떻게 준비하는지 시연할 것입니다. 동위원소 용량 준비는 RID 방법에 매우 중요합니다.

프로토콜

연구 1은 영국 임상 연구 네트워크(UKCRN: 7413)에 등록되기 전에 국가 연구 윤리 서비스 북동부 선덜랜드 위원회(REC 09/H0904/20)의 승인을 받았습니다. 연구 2는 필리핀 대학교 마닐라 연구 윤리 위원회(IRB ID: UPMREB 2016-282-01), UC 데이비스 기관심사위원회(IRB ID: 903681-2)에서 승인되었으며, ClinicalTrials.gov 에 등록되었습니다(ID: NCT03030339). 연구 2는 빌 앤 멜린다 게이츠 재단 지원의 GloVitAS 프로젝트의 일부였습니다(OPP1115464: 대규모 식품 강화 및 기타 개입으로 인한 비타민 A 독성 위험 평가). 게오르크 리에츠는 GloVitAS 프로젝트의 수석 연구원이었으며, 현장 연구의 실행을 감독했습니다. 연구 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 포함 및 제외 기준

  1. 연구 1의 기준은 다음과 같았습니다: 포함 기준: 18세에서 45세 사이의 건강한 남녀 자원자를 포함하라. 제외 기준: 임신, 흡연, 고혈압, 당뇨병, BMI >30, 간/신장/위장 질환, 지질 대사 장애, 그리고 연구 시작 3개월 전 종합비타민(비타민 A, C, E 포함) 또는 β-카로틴 보충제를 복용한 자원봉사자는 제외합니다.
  2. 연구 2의 기준은 다음과 같았습니다: 포함 기준: 연구 기간 동안 연구 지역에 머문 12-18개월 아동을 포함. 제외 기준: 고용량 비타민 A 보충제를 받지 않고 지역 시장에서 비타민 A 강화 식품에 노출되지 않은 지역에 거주한 아동은 제외합니다.

2. RID의 안정 동위원소 추적자 총 양 결정

  1. 각 피험자가 이성질 순도를 고려하여 투여해야 할 안정 동위원소 추적자의 양을 결정하세요. 생물학적 활성과 대사 경로가 기하학적 이성질체별로 크게 다르므로, >95% 전면 트랜스 순도를 가진 비타민 A 안정 동위원소 사용을 권장합니다. 레티놀 환가물(RE)을 기준으로 용량 수준을 계산하세요. 이 계산 방식의 예는 표 2에 제시되어 있습니다.
  2. 용량 수준에 전체 피험자 수에 곱합니다. 필요한 표본 크기에 따라 검정력 계산을 기준으로 기준으로 기준 전체 피험자 수를 기준으로 하되, 예상 탈락률에 따라 증가합니다(예: 표 2 참조). 피펫팅 손실을 최대 20%까지 고려하여 총 추적자 사용량을 늘립니다.
    참고: 일반적으로 동위원소 준비에는 과잉 성분이 포함되어야 하며, 바이알에서 모든 물질을 회수하는 것은 불가능합니다. 피펫 팁 외부에 남아 있는 오일의 점도로 인해 손실이 발생합니다. 전달 시 정확한 용량을 얻으려면, 피펫 팁 외부의 과도한 오일을 닦아내야 합니다. 피펫 팁을 오일에 너무 깊이 담그지 않으면 피펫팅 손실을 최소화할 수 있습니다.

3. 안정 동위원소 추적자를 용해시키는 데 필요한 식물성 기름 양 결정

  1. 피실험자별로 사용할 식물성 기름과 용량을 결정하세요(표 2). 피험자 투여 시 투여 시스템에 따라 첨가된 오일의 양을 결정하세요.
    참고: 비타민 E 함량이 높아 해바라기유를 사용하며, 이는 비타민 A 제제의 안정성을 돕습니다32,33. 하지만 다른 집단에서는 지역 식단 기준을 충족하기 위해 다른 식물성 기름도 사용되어 왔습니다. RID는 안정적인 동위원소 표지된 추적자의 정확한 전달에 의존하기 때문에, 식용 오일로 준비된 용량 적용을 위해 양방향 피펫을 사용하는 것이 권장됩니다. 최근 연구들은특히 어린이에게 투여할 경우 최대 250 μL의 용량을 사용했습니다.
  2. [mg/mL] 식물성 기름 내 안정 동위원소 추적자의 용량 농도를 계산합니다. 필요한 식물성 기름의 총 부피를 결정하세요. 계산된 부피와 식물성 기름의 상대적 밀도를 바탕으로 필요한 기름의 무게를 계산하세요(예시 표 2 참조).
    참고: 정확성을 위해 안정적인 동위원소 추적자 준비를 위해 오일의 무게를 측정하는 것이 권장됩니다. 필요한 총 오일 부피가 계산되면 안정 동위원소 표지된 추적자를 주문할 수 있습니다. 동위원소 추적자를 연구팀이 동위원소 표지된 추적자가 담긴 병에 직접 무게를 재 수 있도록 충분한 용량의 병에 담아 배송하도록 요청하는 것이 중요합니다.

4. 식품 조리를 위한 전용 구역에서 안정 동위원소 표지 추적자 제제

  1. 안정 동위원소 추적자의 미리 정해진 양이 담긴 호박색 병의 뚜껑을 조심스럽게 열고 분석 저울에 올려놓은 후 0으로 타르를 맞추세요.
  2. 멸균된 10 mL 주사기를 사용해 원하는 무게에 도달할 때까지 (± 0.1 g 정확도로 오일을 드롭 단위로 첨가합니다.
    참고: 일부 레티닐-아세테이트 결정이 호박 병 뚜껑 안에 갇혀 있을 수 있으므로, 병을 매우 조심스럽게 열어야 합니다. 식물성 오일을 호박색 병에 넣은 후, 뚜껑을 조심스럽게 다시 병에 덮고, 손으로 조심스럽게 흔들어 뚜껑 안에 남아 있는 레티닐 아세테이트 결정들을 다시 떠올립니다.
  3. 병을 초음파 출력: 14 W/L, 작동 주파수 44 kHz의 소닉 워터 욕조에 넣습니다. 물이 물에 실수로 들어가는 것을 방지하기 위해 병 안의 기름 수준보다 높지만 뚜껑 높이보다 낮게 채우세요.
  4. 병을 15분간 초음파 처리한 후 손으로 조심스럽게 섞고, 그 후 15분 더 초음파 세척을 하세요. 소파 수조의 온도가 50 °C를 넘지 않도록 주의해야 합니다.
    참고: 해바라기유를 사용해 준비했을 때, 50°C에 30분간 노출되었을 때 시 스 레티노이드로의 이성질화가 일어나지 않는다는 것을 발견했습니다( 그림 2 참조). 그러나 준비 과정은 HPLC로 분석하여 열 이성질화 정도를 평가해야 합니다.
  5. 병을 50°C의 뜨거운 물에 30분간 넣어 미세결정이 완전히 녹아들게 하세요.
  6. 실험실에서 200배 배율의 광학 현미경으로 미세결정 존재를 확인하기 위해 20 μL 오일 샘플을 채취하세요. 미세결정이 존재한다면 초음파 검사와 가열 과정을 반복하세요.
  7. 완전히 용해되면, 전체 오일 준비물을 2 - 4 mL 멸균 유리 호박 바이알에 분할 분담합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 양방향 피펫을 사용하세요.
    참고: 유리 호박 바이알에 첨가되는 안정동위원소 추적자의 부피는 일일 모집률에 따라 조절할 수 있습니다. 예를 들어, 하루 5명의 피험자가 모집되고 용량 부피가 150 μL이라면, 바이알은 5회 용량과 피펫팅 손실을 반영할 수 있는 충분한 부피를 담아야 합니다: 5 x 150 μL x 1.2 = 900 μL.
  8. 안정 동위원소 농도를 3배로 측정합니다. 안정 동위원소 표지된 트레이서를 준비하는 동안, 순수 식물성 오일 200 μL(분광광도 블랭크 준비용)과 안정 동위원소 200 - 350 μL 용량을 별도로 2 mL 호박 바이알에 비축하세요.
    1. 투여 농도가 0.5 mg RE≤ 경우, 350 μL의 안정 동위원소를 별도의 2 mL 호박 바이알에 저장해 두세요. 0.5 mg RE> 용량의 경우, 안정 동위원소 용량 200 μL를 별도의 2 mL 앰버 바이알에 보관하세요.
  9. 동위원소 표지된 추적자의 산화 가능성을 지연시키기 위해 바이알을 불활성 가스(Ar)로 덮고, 단단히 닫은 후 동위원소 농도, 투여량(이후 결정), 준비일, 프로젝트 이름이 적힌 냉동상자에 보관합니다. 크라이오박스는 -20°C 식품 냉동고에 보관하여 배송 전까지 보관하세요. 이러한 조건에서 추적자 용량은 최소 2년간 안정적입니다.

5. 실험실에서 안정 동위원소 추적자 농도 측정

  1. 안정 동위원소 추적자를 3개의 부피 플라스크에 n-헥산으로 희석하세요. 트레이서 용량을 추가하기 전에 n-헥산을 보정선 아래 1cm 정도 채우세요.
    1. 안정 동위원소 추적자의 희석 효과를 추적자 용량 농도에 의해 결정합니다. 안정 동위원소 추적자의 용량 농도가 0.5 mg RE≤ 경우, 안정 동위원소 용량 100 μL을 n-헥산과 함께 50 mL 부피 플라스크에 희석합니다. 용량 농도가 0.5에서 2 mg RE 사이라면, 50 mL 부피 플라스크에 안정 동위원소 용량 50 μL을 n-헥산과 함께 투여합니다. 용량 농도가 > 2 mg RE라면, 안정 동위원소 용량 50 μL을 100 mL 부피 플라스크에 n-헥산을 넣습니다.
    2. 50 또는 100 μL의 오일을 헥산에 직접 분사하고, 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 50 또는 100 mL 용량의 플라스크에 추가 헥산을 첨가하여 만듭니다. 플라스크를 10번 뒤집어 오일과 헥산을 섞으세요.
      주의: 헥산은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기 캐비닛에서 다루어야 합니다. 폐기물 헥산은 승인된 계약자가 전문 처리를 위해 전용 용기에 수집합니다.
  2. 분광광도 블랭크 플라스크는 안정 동위원소 추적자와 같은 부피의 식물성 오일(50 또는 100 μL)을 피펫팅하여 헥산에 분사하여 준비합니다. 적용된 희석액(50 또는 100 mL)이 안정 동위원소 추적자와 동일한지 확인하세요. 플라스크를 10번 뒤집어 오일과 헥산을 섞으세요.
    참고: 안정 동위원소 추적자 또는 순수 오일을 피펫팅할 때는 100 μL 양방향 피펫을 사용합니다. 정확한 피펫 추출을 위해서는 팁을 보풀 없는 종이로 아래로 닦아 외부에 남은 트레이서/오일을 제거하는 것이 중요합니다. 직접 교체용 피펫 팁을 닦을 때는 종이가 팁 입구에 닿지 않도록 주의해야 하며, 팁 내부에서 오일이 빨려 나갈 수 있습니다.
  3. 325 nm 파장의 분광광도계를 사용해 헥산에 포함된 식물성 오일을 분광광도 블랭크로 사용하여 석영 큐벳 내 안정 동위원소 추적자 농도를 측정합니다(예시 표 3 참조).
    1. 헥산의 식물성 기름을 분광광도 블랭크로 측정을 시작하세요. 각 측정마다 쿼츠 UV 쿠벳을 n-헥산으로 3번 세척해 청소하세요. 모든 샘플을 측정한 후에는 순수 n-헥산으로 큐벳을 조심스럽게 세척하세요.
  4. 평균 AU 값을 사용하여 안정 동위원소 추적자의 농도를 결정하고, Beer-Lambert 법칙을 사용하여 동위원소 특이적 몰 소멸 계수를 적용합니다. 이를 바탕으로 투여당 필요한 준비된 안정 동위원소 추적자의 부피를 계산합니다(아래 대표적인 결과 및 표 3의 예시를 참조).

결과

총 동위원소 추적자 선량 크기 계산
100명의 표본 크기로 구성된 연구에서, 합성에 필요한 [13C10]레티닐 아세테이트의 총 양을 계산했습니다(표 2). 이 양은 필요한 샘플 크기(n = 100), 예상 소모(n=15; 15% 소모), 피펫팅 손실(20%), 그리고 [0.4mg RE; 적용된 질량분석기 감도, 실험 시간 및 피험자 연령군 기준] 1회당 레티닐 아세테이트 농도에 대한 파워 계산을 기반으로 합니다. 필요한 총 RE 양(55.2 mg RE)은 [13C10]레티닐 아세테이트(63 mg)의 요구량으로 변환됩니다.

원하는 농도로 [13C10]레티닐 아세테이트를 용해시키기 위해 필요한 해바라기유의 부피를 계산하기 위해, 먼저 투여량 용량을 150 μL/용량(0.15 mL/용량)으로 설정했습니다. 그 다음, 해바라기유 1mL에 포함된 [13 C10]레티닐 아세테이트 농도를 계산합니다(표 2). [13C10]레티닐 아세테이트(63 mg)의 요구량을 필요한 농도로 나누면 필요한 해바라기유의 총 부피가 됩니다. 마지막으로, 해바라기유의 무게는 해바라기기름의 상대적 밀도를 이용해 결정됩니다.

오일 내 [13C10]레티닐 아세테이트의 정확한 목표 선량 농도는 Beer-Lambert 법칙에 기반한 분광광도계를 이용해 안정 동위원소 추적자 농도를 측정하여 확인되었습니다(표 3). 측정 중 안정 동위원소 추적자의 희석(희석 인자 500)을 고려하면 오일 내 레티닐 아세테이트 농도는 2.58 μmol/μL [13C10]입니다. 따라서 0.4 mg RE 용량에 필요한 최종 안정동위원소 추적자의 부피는 155 μL로 결정되었다(표 3).

추적자 용량의 잠재적 이성질화 검사
얻은 추적자 용량의 이성질체 순도는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 시스 이성질체 검사를 통해 결정되었습니다. 그림 2). 이를 위해 5.1.2단계의 희석된 트레이서 용액에서 샘플을 질소 가스에 건조한 후 잔류물을 100% 에탄올로 재용해하여 주입했습니다. Liu 등34 의 방법을 사용하여 3개의 반복 샘플에 대한 HPLC 분석을 수행하여 시스-이성질체화 여부를 확인하였습니다( 그림 2 참조). 트레이서 용량의 순도는 연구 기간 내내 모니터링하여 용량이 저하되지 않도록 해야 합니다.

추적자 용량 농도가 시간에 따른 용량 비율에 미치는 영향
서로 다른 용량 수준을 적용하면 섭취량의 비율이 시간이 지남에 따라 달라지며, 이는 분석 플랫폼이 모든 대상에서 요구되는 시점에 [13C10]레티놀을 검출하는 능력에 영향을 줄 수 있습니다. 성인(그림 3A) 또는 어린이(그림 3B)에서 1 mg 또는 0.4 mg 레티닐 아세테이트 투여 후 0.4mg [13 C 10]레티닐 아세테이트보다 더 높은 용량 비율이 나타났으며, 적용된 LC-MS/MS가 [13C 10]를 검출하는 능력이 확인되었습니다 [13C10]입니다]투여 후 최대 28일까지 피험자에게 레티놀을 투여했습니다. 이는 다양한 시점에서의 선량 비율 정보가 적용된 용량 수준이 적용된 분석 플랫폼의 검출 수준보다 높은 신호를 얻을 수 있을 만큼 충분히 높은지 결정하는 데 매우 중요하며, 이 정보는 이상적으로는 대표 샘플을 이용한 파일럿 연구 중에 얻어야 함을 확인시켜 줍니다.

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그림 1: 비타민 A 추적제 투여 준비 흐름도. 안정 동위원소 선량 준비를 수행하는 주요 단계로는 필요한 양 결정, 획득한 추적자 용량의 농도, 용량 순도 확인이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 레티닐 아세테이트의 이성질화 조사를 위한 추적자 용량의 HPLC 크로마토그램. [13C10]레티닐 아세테이트의 잠재적 이성질화는 각 단계별 HPLC 분석을 통해 동위원소 용량에 대해 평가하였다. 분석은 Liu 등34의 방법을 사용하여 다이오드 배열 검출이 포함된 HPLC에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: [13C10]레티닐 아세테이트 섭취 후 혈장 레티놀 용량 분율의 관찰 평균. (A) 45명의 영국 성인,16명, (B) 112명의 필리핀 어린이에서 각각 1mg 또는 0.4mg 레티닐 아세테이트 용량을 투여받은 분율. 용량 비율 = {혈장 [13C]의 레티놀 농도(μmol/L) X 추정 혈장 부피(L) / [13C]용량(μmol). 데이터는 SEM± 기하평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

안정 동위원소공급업체/제조사
[D4]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소
[D6]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소
[D8]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소
[13C3]-레티닐 아세테이트부헴 BV/레시아켐 GmbH
[13C4]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소
[13C8]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소
[13C10]-레티닐 아세테이트부열 BV/레시아켐 GmbH/케임브리지 동위원소 연구소

표 1: 상업적으로 이용 가능한 안정적인 비타민 A 동위원소 추적자. 다양한 공급업체에서 나온 13개의 C 및 2H 표지 레티닐 아세테이트 추적제 목록.

매개변수
표본 크기 [n]:100
이직률 [n] (%):15 (15%)
피펫팅 손실:20%
MW [13C10]레티닐 아세테이트:338.5 μg/μmol
MW [13C10]레티놀:296.46 μg/μmol
용량:자원자당 0.4 mg 레티닐 아세테이트 RE [13C10]를 투여
계산
총 필요한 RE 양:= mg RE x 샘플 크기 x 소멸 x 피펫팅 손실
= 0.4 mg 레비 x 100 x 1.15 x 1.2
= 55.2 mg RE
총 [13C10]레티닐 아세테이트의 필요량:= mg RE x MW [13C10]레티닐 아세테이트 / MW [13C10]레티놀
= 55.2 mg RE x 338.5 μg/μmol / 296.46 μg/μmol
= 63.0 mg [13C10]레티닐 아세테이트
오일 내 레티닐 아세테이트의 용량 농도:[13C10]레티닐 아세테이트 [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]레티닐 아세테이트 / MW [13C10]레티놀) / 0.15 ml
= (0.4 mg RE x 338.5 μg/μmol / 296.46 μg/μmol) / 0.15 ml
= 3.04 mg/ml
필요한 해바라기유 총 양:= 총 [13C10]레티닐 아세테이트 무게 / 용량 농도 내 오일 내
= 63.0 mg / 3.04 mg/ml
= 20.7 ml 오일
필요한 해바라기유 무게:= 해바라기유 총 부피 x 상대 밀도 해바라기유
= 20.7 ml x 0.92 g/ml
= 19.0 g 해바라기유

표 2: 안정 동위원소 추적자 선량 크기 계산 예시. 추적자 용량 및 식물성 오일 양을 결정하기 위한 매개변수 및 계산 표시.

매개변수
헥산에서 [13C10]레티닐 아세테이트의 몰 소광 계수(E1%1cm):52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
희석 계수:500 (50mL 헥산 100μL 오일 준비)
측정된 평균 흡광도:0.917
MW [13C10]레티놀:296.46 μg/μmol
계산
헥산에서 [13C10]레티닐 아세테이트의 농도(mol/L):농도(mol/L) = 흡수 / E1%1cm x 큐벳 길이(1cm)
= 0.917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1.739 x 10-5 mol/L
농도를 μmol/μL로 변환하기:농도(mol/L) = 농도(μmol/μL)
1.739 x 10-5 mol/L는 1.739 x 10-5 μmol/μL에 해당합니다
희석 보정:오일 내 1.739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8.697 x 10-3 μmol/μL
μL당 무게(μg/μL):= [13C10]레티닐 아세테이트 μmol/μL 오일 내 × MW [13C10]레티놀
= 8.697 x 10-3 μmol/μL x 296.45 μg/μmol = 2.58 μg/μL
용량당 부피:= 부피 (μL/ 400 μg 용량) = 400μg / 2.58 μg/μL = 155 μL

표 3: 안정 동위원소 추적자 용량 농도 결정. 경구 투여에 필요한 추적자 용량 농도와 필요한 용량을 결정하기 위한 매개변수 및 계산.

토론

인간 연구에 사용되는 안정 동위원소 추적자는 일반적으로 안전한 것으로 간주되며, 적용된 농도에서 생물학적 또는 생리학적 부작용이 보고되지 않았습니다25,35. 하지만 안정 동위원소 추적자는 경구 투여가 필요하기 때문에 추적자 용량이 식품 안전 기준을 충족하는 것이 필수적입니다. 이는 안정 동위원소 표지된 비타민 A 공급업체와 제조업체가 공급 동위원소7, 20, 24에 대해 식품 안전 검사를 실시하도록 요구함으로써 달성할 수 있습니다. 마찬가지로, 동위원소 준비와 저장은 식품 준비를 위한 전용 구역에서만 이루어져야 합니다. 더불어, 안정 동위원소 제조에 사용되는 모든 장비는 동위원소 제조에만 전념해야 하며, 식품 준비 구역에만 보관되어야 합니다.

레티닐 아세테이트 표지된 동위원소는 이전에 에탄올로 용해된 후 질소 가스에서 건조된 후식물성 기름에 녹인 경우가 있습니다. 여기서는 초음파 검사와 열의 조합을 이용해 동위원소 표지된 추적자를 식물성 기름에 용해시키는 방법을 제시합니다. 이 방법은 식품 조리 구역에서 수행하기 더 쉽지만, 트레이서를 식물성 기름에 녹이기 위해 열을 가할 때는 주의가 필요합니다. 올트랜스레티놀은 열처리 과정에서 13-시스-레티놀로 이성질화되며, 온도가 높아질수록37이 가속화됩니다. 빛 노출을 통해 레티놀의 이성질화가 더욱 증가합니다. 더불어, 레티놀의 안정성은 식물성 기름의 지질 산화 특성에 의해 영향을 받습니다32,38. 식물성 기름 내 α-토코페롤 함량이 비타민 A 유지에 긍정적인 영향을 미치고, 해바라기유는 α-토코펠롤33 함량이 가장 높기 때문에, 추적자 투여량 준비에 해바라기유를 사용하기로 결정했습니다. 트레이서를 용해하기 위해 최대 50°C까지 열을 가한 결정은 화장품 내 레티놀 결정체를 유의미한 손실 없이 용해시키는 데 열을 가할 수 있다는 점에 근거했습니다. 설명된 프로토콜 하에서 레티닐 아세테이트의 유의미한 분해는 관찰되지 않았지만, 열처리 직후 추적자 용량의 시스 이성질체화를 확인하는 것이 매우 중요합니다(그림 2). 또한 트레이서 용량의 안정성을 연구 전반에 걸쳐 모니터링하여 적용된 추적자 용량 농도를 확인할 것을 권고합니다.

추적자는 필요한 용량을 투여하는 데 사용되는 전달 시스템의 부피 한계 내에서 충분히 높은 농도로 준비되어야 합니다. RID는 안정적인 동위원소 표지 추적자의 정확한 전달에 의존하기 때문에, 용량 적용에는 양 위치 피펫을 사용하는 것이 권장됩니다. 과거에는16, 20, 40 성인에게 최대 1 mL 용량을 적용한 적이 있지만, 100에서 250 μL 사이의 용량은 영유아와 어린이가 잘 견디는 것으로 나타났기 때문에 더 쉽게 적용할 수 있습니다. 또는 캡슐17 형태로 투여할 수도 있으나, 오일 누출을 방지하고 연구 대상 내에서 수용 가능하도록 특별히 설계된 캡슐을 선택하는 것이 필수적입니다. 마지막으로, 적용 용량 수준은 대상 인구의 연령29, 적용된 분석 플랫폼의 저수치 감지 능력3, 그리고 목표 인구의 전체 저장 상태에 따라 달라지며, 높은 전체 저장 용량일수록 혈장 분율이 낮아집니다.

위 예시에서 나타난 것처럼, [13C10]레티닐 아세테이트를 해바라기유 내 2.58 μg/μL 농도로 사용하면 155 μL 해바라기유에 0.4 mg RE 추적자를 공급할 수 있으며, 이는 250 μL 양방향 피펫을 사용해 정확하게 전달할 수 있습니다. 전달 시스템의 체적 한계 내에 농도를 얻으려면, 추적자를 용해시키는 식물성 기름을 안정 동위원소 추적자가 담긴 병에 0.1g까지 정확히 측정하여 정확히 무게를 측정하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어, 총 63mg [13C10]레티닐 아세테이트를 해바라기유 3.04 mg/mL 농도로 제조하고, 해바라기유의 비중이 25 ◦C에서 0.92 g/mL라면, 추적자가 든 병에 19.0 g(20.7 mL x 0.92 g/mL)의 오일을 무게를 젬어야 합니다. 안정 동위원소 추적자의 최종 농도는 분광광도계 측정값을 사용해 확인되지만, 동위원소 추적자와 도포된 오일의 정확한 무게 측정은 각 투여량에 대한 선택된 투입량에 가까운 농도를 보장합니다.

오일 제제를 예상되는 일일 필요량에 따라 분할 배치하여 바이알 내 모든 용량이 개봉 후 2주 이내에 사용되도록 하는 것이 권장됩니다. 사용 중에는 기름 준비물을 현장에서 얼음 포장에 보관하고, 투여가 완료된 후 가능한 빨리 다시 냉동하는 것이 가장 좋습니다. 오일 준비물은 반복적인 냉동 및 해동 사이클에 영향을 받지 않지만, 사용하지 않을 때는 항상 빛으로부터 보호하고 냉동해야 합니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 RID 방법을 위한 추적자 용량의 정밀한 준비 및 품질 관리를 상세히 다루어 정확한 용량, 안정성 및 안전성을 보장합니다. 이 방법은 추적자 요구량을 계산하고, 식물성 기름에서의 용해도를 최적화하며, 분광광도법과 HPLC를 이용해 순도와 농도를 검증합니다. 엄격한 취급 및 보관 지침은 정확한 동위원소 기반 평가를 위한 신뢰할 수 있는 추적자 무결성을 보장합니다.

공개 사항

저자들은 선언할 것이 없다.

감사의 글

이 작업은 빌 & 멜린다 게이츠 재단(프로젝트 번호: OPP1115464)과 비엔나의 국제원자력기구(IAEA, 프로젝트 번호 E4.30.30)로부터 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
용량 분할을 위한 2ml 호박색 유리 바이알피셔11573690연구 표본 크기와 매일 투여받는 자원자 수에 따라, 예를 들어 4ml와 같은 더 큰 앰버 바이알을 사용하는 것이 더 효율적일 수 있습니다
100ml 부피 플라스크피셔11323644파이렉스 붕규산염 유리 클래스 A 인증 부피 플라스크
50ml 부피 플라스크피셔11313644파이렉스 붕규산염 유리 클래스 A 인증 부피 플라스크
분석 체중계  피셔13592970
모세관 피스톤(피펫 팁) CP100 10x96 TIPACK길슨FD148314
모세관 피스톤 CP1000ST 2x91길슨F148180
6x96 CP250ST 모세관 피스톤길슨F148714
종이 크라이오박스스타랩A9623-8181
헬마 큐벳 UV 쿼츠SLSCEL1600
헥산 95% n-헥산 HPLC 인증 HPLC피셔H/0406/17
2ml 호박색 유리병 뚜껑피셔11573542
Microman E M1000E 피펫 (양식 변위)길슨FD10006
Microman E M100E 피펫 (양성형)길슨FD10004
Microman E M250E 피펫 (양대식)길슨FD10005
현미경니콘이클립스 E400
현미경 유리 슬라이드 시그마41122601
초음파 수욕VWRUSC100T
분광광도계써모피셔 사이언티브A51119600C
안정 동위원소 표지된 레티닐 아세테이트 추적자부헴 BV해당 없음RID 방법에는 다양한 안정 동위원소를 사용할 수 있습니다. 상용 동위원소 목록은 표 1에 나와 있습니다.
교반하지 않은 물욕SLSSLS1176
식물성 기름어떤 식료품점이든해당 없음동위원소 투여량을 준비할 때는 충분한 유통기한을 가진 신선한 식물성 오일을 사용하는 것이 중요합니다.
Volac 언플러그드 유리 파스퇴르 피펫 150mmSLSPIP4150

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