다중 형광 면역분석법은 혈청학 검사의 참고 자료가 되고 있습니다. 그러나 이들의 적용은 복잡성과 시간이 많이 걸리는 비드-분석물 결합 공정으로 인해 제한됩니다. 이 보고서는 결과 도출 시간을 크게 단축하면서 표준 방법과 비교할 수 있는 반자동 재현 가능한 다중 마이크로스피어 비드 커플링 프로토콜을 제시합니다.
이 논문에서
요약
초록
절지동물 매개 바이러스(아르보바이러스)는 전 세계적으로 분포하는 모기 매개 병원체 그룹입니다. 2016년 미주 대륙에서 지카 바이러스(ZIKV)가 발생하여 이러한 감염이 대중에게 인식된 이후 아르보바이러스는 계속해서 상당한 공중 보건 부담을 가하고 있습니다. 이전에 풍토병이 없었던 지역에서 이들이 출현하는 것은 공중 보건 문제의 원인입니다. 아르보바이러스 감염의 감시 및 통제는 2024년 아르보바이러스 질병 퇴치를 위한 글로벌 전략 계획을 시작한 세계보건기구(WHO)의 현재 우선순위입니다. 멀티플렉®스 기술은 혈청학적 감시 분야에 혁명을 일으켜 최소한의 샘플 부피를 필요로 하면서 여러 항체를 동시에 측정할 수 있게 되었습니다. 다중 혈청학적 검사 개발에 대한 전문 지식을 바탕으로 아르보바이러스 항원에 대한 항체 검출을 위한 비드 기반 다중 분석이 개발되었습니다. 이 분석은 뎅기열(DENV), 황열병(YFV), 지카 및 치쿤구니야(CHIKV) 바이러스를 포함한 일반적인 아르보바이러스에 특이적인 여러 항원으로 구성됩니다. 반자동 방법을 사용하여 항원을 마이크로스피어 비드에 공유 결합했습니다. 이 새로운 프로토콜은 매우 효과적이어서 단일 실험에서 최대 96개의 항원을 결합할 수 있는 동시에 재현 가능한 결과를 보장합니다. MFI(Median Fluorescence Intensity) 데이터는 사용자 친화적인 형광 이미징 시스템을 사용하여 획득되었습니다. 풍토병 국가의 인간 혈청 샘플에 적용할 때 이 분석은 혈청 감시 노력을 위한 강력한 도구가 될 것으로 기대합니다.
서론
아르보바이러스는 매년 수천 명의 사망자를 초래합니다. 이 바이러스는 감염된 절지동물, 주로 모기와 진드기를 통해 인간에게 전염됩니다. 아르보바이러스 감염의 중증도는 무증상 감염부터 사망에 이를 수 있는 심각한 질병까지 다양합니다. 2024년 세계보건기구(WHO)는 뎅기열 바이러스(DENV)의 4가지 혈청형만으로 인한 사망자가 10,000명 이상을 기록했습니다1. 같은 해에 이 바이러스는 50,000명의 중증 사례를 포함하여 1,400만 명 이상을 감염시켰습니다1. DENV는 가장 두드러진 아르보바이러스이지만 이 그룹에는 전 세계적으로 여러 발병의 원인이 된 생명을 위협하는 다른 병원체가 포함되어 있습니다. 아프리카의 아르보바이러스 감염에 대한 최근 요약 검토에 따르면 DENV, 황열병 바이러스(YFV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 크림-콩고 출혈열 바이러스(CCHFV), 리프트 밸리 열병 바이러스(RVFV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 지카 바이러스(ZIKV)를 포함한 이러한 바이러스는 2023년 대륙 전역에서 최소 29건의 발병을 일으켰습니다2. 2022년 WHO 아프리카 지역 사무소가 발표한 보고서는 현재 지역 전체의 아르보바이러스 감시의 한계를 강조하면서 아르보바이러스 감시 및 통제 방법을 개발하는 것이 시급하다고 강조했습니다3.
아르보바이러스 감염의 임상 진단은 풍토병 지역에 존재하는 다른 병원체에 공통적인 발열, 관절통 및 전신 권태감과 같은 증상의 유사성으로 인해 어렵습니다4. 또한 바이러스의 동시 순환 및 잠재적 동시 감염으로 인해 병인학적 병원체의 구별이 어렵습니다5. 감별 진단에는 실험실 확인이 중요합니다. 인간 샘플에서 아르보바이러스를 검출하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 분자 진단 검사, 바이러스 항원 검출 및 바이러스 분리를 포함한 직접적인 방법은 병원체의 존재를 검출하는 반면, 혈청학적 진단과 같은 간접 방법은 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 측정합니다6.
아르보바이러스에 대한 항체 반응을 검출하기 위한 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기에는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 보체 고정, 혈구응집 억제 및 마이크로스피어 면역분석법 6,7이 포함됩니다. 이 보고서는 아르보바이러스 항원에 대한 항체 반응을 검출하기 위한 다중 형광 마이크로스피어 기반 면역분석법(FMIA)을 제시합니다. 마이크로스피어 기반 분석법8은 혈청학에서 광범위하게 사용되며 몇 가지 장점을 제공하며, 가장 중요한 것은 최소한의 샘플 부피로 단일 반응에서 여러 분석물을 검출할 수 있다는 것입니다. 관심 있는 재조합 항원으로 코팅된 광학적으로 코딩된 마이크로스피어(자성 폴리스티렌 비드)는 간접 혈청학적 면역분석법에 사용됩니다. 그런 다음 결합된 비드를 샘플과 함께 배양하고 피코에리트린(PE) 형광단 리포터에 접합된 항인간 IgG 2차 항체를 사용하여 항원 특이적 항체를 검출합니다. MFI로 보고되는 방출된 형광을 검출하기 위해 여러 분석기를 사용할 수 있습니다.
분석의 원리는 Angeloni et al.8에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 관심 항원은 색상으로 구분된 마이크로스피어에 화학적으로 결합됩니다. 이를 위해 비드는 초기에 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS)로 처리되며, 이는 비드 표면의 카르복실기를 활성화하여 아민 반응성 화합물을 생성합니다. 그런 다음 이 중간 반안정 화합물을 관심 단백질과 혼합하여 단백질의 아민 부분이 비드에 공유 결합되어 표면에 관심 단백질로 코팅된 안정적인 마이크로비드를 생성합니다. 항원 결합 비드는 샘플과 함께 배양되어 항체가 특정 항원에 결합할 수 있도록 합니다. 항원 결합 항체는 형광 염료에 접합된 항면역글로불린 2차 항체를 사용하여 검출됩니다. 우리는 PE 표지 2차 항체를 사용합니다. MFI는 광 이미저를 사용하여 측정됩니다(기기에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있음). 이 기기는 두 개의 LED 조명, 빨간색 LED와 녹색 LED를 사용하며, 이는 비드의 내부 염료와 비드 표면의 리포터 형광을 별도로 여기시킵니다(9). 그런 다음 필터를 사용하여 색상에 따라 비드를 분류하고 분석물에서 방출되는 형광을 정량화합니다.
우리는 이전에 SARS-CoV-210 및 백신으로 예방할 수 있는 질병11 에 대한 항체 반응 검출 기술을 적용했으며 다중 분석이 혈청 유병률 및 감시 연구를 위한 귀중한 도구를 구성한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로젝트의 목표는 아프리카 지역의 샘플을 스크리닝하기 위해 분석을 적용하는 것을 목표로 아르보바이러스에 속하는 여러 항원에 대한 항체 반응 검출로 FMIA의 사용을 확장하는 것입니다.
멀티플렉스 기술을 사용한 아르보바이러스 멀티플렉스 분석은 비구조 단백질 1(NS1)12,13 또는 엔벨로프 도메인 III(EDIII)14와 같은 다른 항원 표적을 사용하여 다른 곳에서 설명되었습니다. 26개의 아르보바이러스 항원(NS1, EDIII, 바이러스 유사 입자(VLP) 및 해당 지역에서 동시 순환하는 병원체를 테스트하기 위한 여러 기타 항원 포함)을 포함하는 50-플렉스 분석이 제시됩니다. 이 분석을 통해 이러한 병원체에 대한 전파 강도를 평가할 수 있습니다. 분석 개발에 사용되는 재조합 항원의 요약은 표 1 에 제공된다.이 보고서에 제시된 프로토콜은 아르보바이러스 검출 최적화에 초점을 맞춘 광범위한 방법 개발 연구를 보완하기 위해 개발되었습니다.
통상, 마이크로스피어 비드에 대한 항원의 결합(또는 고정)은 단일 튜브8 (수동 결합)에서 수행된다. 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 번거로우며 재현성 오류가 발생하기 쉽습니다. 이 기사에서는 비드에 대한 항원의 화학적 결합과 관련된 연속적인 단계를 수행하기 위해 자동화된 기기를 사용하는 프로토콜을 보고합니다. 이 원고에서는 새로운 프로토콜의 검증을 위해 수행된 단계를 보고합니다. 새로운 프로토콜의 검증은 수동 방법 또는 자동 프로토콜로 준비된 항원 결합 비드를 사용하여 50-플렉스 FMIA로 측정된 IgG 반응을 비교하여 수행되었습니다. 이 방법의 추가 검증은 아프리카 및 프랑스 코호트의 인간 혈청 샘플을 분석하여 수행되었습니다.
자동 비드 커플링 프로토콜은 빠르며, 한 번의 실행에서 최대 96 개의 분석물을 동시에 결합 할 수 있습니다. 더 중요한 것은 배치 간 변동이 감소하면서 확립된 수동 프로토콜을 사용하여 얻은 결과와 비슷하다는 것입니다.
프로토콜
인간 샘플의 사용에 대해 적절한 윤리 승인을 받았습니다. 샘플은 이전 연구에서 익명화된 잔류물이었습니다. "표준 풀" ORPAL 샘플 사용에 대한 프로토콜은 수리남 국가 윤리 위원회(CMWO(Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), 의견 번호 VG 25-17)의 승인을 받았습니다. 마다가스카르 샘플의 사용은 런던 위생 및 열대 의학 대학의 윤리 위원회(28541) 와 마다가스카르 Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale(135MSANP/SG/AMM/CERBM )의 PvSTATEM 프로젝트의 일환으로 승인되었으며, 세네갈 샘플의 사용은 세네갈 국가 보건 연구 윤리 위원회(CNERS Sénégal)에서 진행 중인 Dielmo 및 Ndiop 프로젝트의 일환으로 승인되었습니다. 이 샘플에서 NTD에 대한 항체를 측정하기 위한 승인은 CNERS Sénégal(N 00000007 MSAS/CNERS/Sec)에 의해 부여되었습니다. 프랑스 풍토병이 아닌 샘플은 프랑스 병원 실험실 내의 일상적인 의료 검사에서 추출되었으며 프랑스 데이터 보호 위원회(Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes)의 기존 규정 및 지침에 따라 처리되었습니다. 인간 혈청 샘플은 아르보바이러스 유병률이 높은 지역의 피험자와 순진한 프랑스 인구로부터 채취되었습니다. 혈청 샘플은 56°C에서 30분 동안 배양하여 사용하기 전에 열 비활성화되었습니다. 샘플이 비활성화되지 않은 경우 안전 캐비닛 아래에서 조작하십시오. 대부분의 재조합 항원은 사내에서 합성된 EDIII 재조합 단백질을 제외하고 상업적으로 얻어졌습니다. 이미징 기반 분석기기기(9 )가 데이터 수집에 사용되었다. 사용된 시약 및 장비는 재료표에 나와 있습니다.
1. 커플링을 위한 최적의 항원 농도 결정
알림: 광표백을 방지하려면 절차 전반에 걸쳐 마이크로스피어 비드가 빛에 노출되는 것을 최소화하십시오. 벌크 커플링 전에 수동 커플링 프로토콜을 사용하여 각 항원에 대한 커플링 농도를 최적화합니다. 프로토콜은 Angeloni et al.8에서 채택되었습니다. 완충액 및 용액은 보충 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.
- 커플링에 사용할 비드 영역을 선택합니다. 20초 동안 완전히 소용돌이치십시오. 최소 60 초 동안 튜브를 초음파 처리합니다.
- 200μL(2.5M 비드)의 비드를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 200μL 100mM 일염기성 인산나트륨/0.125x Triton으로 비드를 세척합니다.
- 튜브를 마그네틱 튜브 분리기에 60초 동안 놓습니다. 구슬을 건드리지 않고 조심스럽게 상청액을 제거합니다.
- 모노염기성 인산나트륨 완충액을 첨가합니다. 마그네틱 랙에 60초 동안 그대로 둡니다. 상청액을 제거합니다.
- 80 μL의 100 mM 일염기성 인산나트륨, 0.125x Triton, 10 μL 설포-NHS 및 10 μL EDC를 포함하는 완충액으로 비드를 활성화합니다.
- 일염기성 인산나트륨 -설포-NHS -EDC를 튜브에 첨가합니다. 롤러에 실온에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
- 250μL PBS(1x) 및 0.125x Triton으로 비드를 세척합니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
- 항원을 결합합니다.
- 총 부피 1mL, 1x PBS 및 0.125x Triton의 다양한 농도(연속 희석)의 항원을 준비합니다. 최소 2가지 농도의 항원을 테스트합니다.
- 활성화된 비드에 항원 용액을 첨가하십시오. 실온에서 어두운 곳에서 2시간 또는 롤러에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 500 μL PBS-TBN 및 0.125x Triton에서 결합 비드를 세척합니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
- 결합된 비드를 1mL의 PBS-TBN 및 0.125x Triton에 재현탁합니다.
참고: 결합된 비드를 사용하기 전에 최소 24시간 동안 4°C에서 보관하십시오. 결합된 비드는 24시간 후 테스트와 비교하여 결합 직후 테스트했을 때 MFI의 가변성을 보였습니다. - 후속 대규모 커플링에 사용할 최적의 농도를 선택하십시오. 표준 풀에서 면역분석에 서로 다른 결합 비드를 사용합니다. 선형 표준 곡선을 얻은 가장 낮은 농도를 선택합니다.
참고: 표준 풀에 대한 항체 반응의 선형성의 예는 결과 섹션, 그림 1에 제공됩니다.
2. 대규모 자동 비드 커플링
- Pro Magnetic COOH 비드를 준비합니다.
- 필요한 비드 계산: 샘플당 500개의 비드를 사용하면 5000개의 샘플에 250만 개의 비드가 충분합니다.
- 앞서 설명한 대로 커플링에 사용할 비드 영역을 준비합니다.
- 원하는 양의 비드를 할당된 우물로 옮깁니다. 250만 개의 비드에 200μL의 비드(표준 Luminex 농도는 1.25e7 비즈/mL)를 사용했습니다.
- 항원을 준비합니다. 이는 정확한 양의 항원을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.
- 최적화 후 필요한 항원의 양을 계산합니다. 각 항원에 사용되는 농도는 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.
- 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 적절한 양의 관심 항원을 1x PBS/0.125x Triton과 완전히 혼합하여 총 1mL로 혼합합니다.
- 시약으로 플레이트를 준비합니다. 다음과 같이 96-깊이 웰 플레이트를 준비합니다. 부피는 웰당 250만 개의 비드 커플링에 대해 계산됩니다.
- 플레이트 1(팁 빗): 팁 빗을 로드합니다.
- 플레이트 2(비드): 0.125x Triton 8μL와 관심 비드 영역 200μL를 추가합니다.
- 플레이트 3(Wash1): 200μL의 100mM 일염기성 인산나트륨/0.125x Triton을 추가합니다.
- 플레이트 4(활성화): 80 μL의 100 mM 일염기성 인산나트륨 / 0.125x Triton + 10 μL 설포-NHS + 10 μL EDC를 추가합니다.
- 플레이트 5(Wash2): 250μL의 1x PBS/0.125x Triton을 추가합니다.
- 플레이트 6(커플링): 1mL의 항원 용액을 할당된 웰로 옮깁니다.
- 플레이트 7(Wash3): PBS-TBN/0.125x Triton 500μL를 추가합니다.
- 플레이트 8(최종 플레이트, 결합 비드 포함): PBS-TBN 1mL + 0.125x Triton을 추가합니다.
- 자동화된 프로세서에서 커플링 사이클 실행을 설정하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 기계를 켜고 프로토콜을 설정하십시오. 필요한 소프트웨어는 PC에서 다운로드할 수 있습니다(15). 실행별 매개변수는 보충 표 2에 자세히 설명되어 있습니다.
- 기계에 할당된 슬롯에 플레이트를 로드합니다. 프로토콜을 선택합니다. 주기를 시작합니다. 이 프로그램을 완료하는 데 소요되는 예상 시간은 2:50 시간입니다.
- 주기 종료
- 제조업체의 지침에 따라 기기를 끄십시오. 지시에 따라 플레이트를 내리십시오. 플레이트 8에 구슬(갈색 펠릿)이 포함되어 있는지 육안으로 확인합니다. 또한 실행 보고서가 기기에서 내보내집니다.
- 보관을 위해 플레이트 8에서 개별 1.5mL 튜브로 결합된 비드를 옮깁니다. 결합된 비드를 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
- 구슬을 세어보세요.
참고: 셀 카운터가 사용되었습니다. 혈구계를 사용한 수동 계산은 Luminex 요리책 매뉴얼8을 참조하십시오.- 완전히 소용돌이 결합 비즈. 10 μL를 세포 계수 챔버로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 mL당 비드 수를 읽으십시오.
- 세포 카운터에서 이미지를 시각화하여 집계를 확인합니다. 응집되지 않은 비드의 대표적인 이미지는 보충 그림 1 을 참조하십시오.
- 응집체가 있는 경우 최소 5분 동안 철저히 소용돌이치고 초음파 처리합니다. 반복 계산
참고: 비드 계수 후, 항체 반응의 선형성을 평가하기 위해 표준 풀에서 결합된 비드의 면역분석을 수행하여 결합 효율을 평가했습니다.
표 1: 50-플렉스에 포함된 항원 패널. 이 분석에는 아르보바이러스 감염 및 동시 순환 병원체를 검출하기 위한 여러 항원이 포함됩니다. 125만 개의 비드를 결합하는 데 사용되는 항원의 양이 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
3. 다중 면역분석법
알림: MFI 측정 프로토콜의 자세한 단계는 해당 설명서9에 나와 있습니다. 비드가 빛에 노출되고 광표백의 위험을 최소화하기 위해 모든 용액과 샘플은 비드를 냉장고에서 꺼내기 전에 준비됩니다.
- 플레이트 레이아웃을 설정합니다. 96웰 플레이트를 사용했으며 첫 번째 행에 표준 풀의 연속 희석액과 블랭크(완충액만)를 포함했습니다.
- 별도의 비결합 플레이트에 PBT 완충액으로 샘플과 표준물질을 희석합니다. 샘플에는 1:200 희석액(최종 농도 1:400)을 사용했습니다. 표준 곡선의 경우 표준 혈청 풀의 1:50 희석액(최종 농도 1:100)과 10개의 2배 연속 희석액을 사용했습니다.
- 총 부피 50μL/웰에서 사용할 결합 비드의 양을 결정합니다. 웰당 각 비드의 500개 비드를 사용하고 PBT 완충액으로 부피에 맞게 조정했습니다.
- 결합된 비드를 30초 동안 완전히 소용돌이치게 혼합합니다. 최소 60 초 동안 초음파 처리하십시오.
- 각 분석물에 대해 동일한 비드를 보장하기 위해 멀티플렉스 프리믹스에 추가할 각 결합 비드의 부피를 계산합니다. 비드의 부피는 다음과 같이 계산되었습니다: 웰당 비드의 부피 = 웰당 비드 수/비드 수.
참고: 프리믹스에 필요한 비드 및 완충액 부피의 계산에 대한 예는 보충 표 3에 나와 있습니다. - 적절한 비드 항원 부피를 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- PBT로 볼륨을 조절합니다.
- 프리믹스를 완전히 섞습니다.
- 프리믹스 50μL를 이미징 마이크로플레이트(예: ps, f-바닥 플레이트)에 분배합니다.
- 희석된 샘플 50μL를 비드에 첨가합니다.
- 플레이트 셰이커에서 실온, 700rpm에서 30분 동안 혼합합니다.
- 다음과 같이 플레이트를 세 번 세척합니다(수동 세척).
- 플레이트를 실온에서 60초 동안 마그네틱 랙에 놓습니다. 플레이트를 랙에 단단히 잡고 상층액을 버리십시오.
- 100 μL PBT 완충액을 추가합니다. 마그네틱 랙에 60초 동안 그대로 둡니다. 세탁을 반복하십시오.
참고: 대안적으로, 플레이트 와셔(16 )를 사용할 수 있다. 와셔는 다음과 같이 설정되었습니다: 1사이클 담그기, 3주기(흡인, 분배 및 담그기) 및 마지막 사이클 흡인.
- 상청액을 버리고 희석된 2차 항체 50μL를 추가합니다.
- 공급업체의 지침에 따라 2차 항체의 원액을 준비하십시오. 2차 항체의 1/120 희석액을 사용하였다. 2차 항체의 부피는 다음과 같이 계산되었습니다: 부피 2차 항체 = 총 부피/희석 계수.
- 2차 항체를 적절한 부피의 PBT 완충액과 혼합합니다. 철저히 섞는다. 세척된 비드에 희석된 2차 항체 50μL를 첨가합니다.
- 실온, 700rpm에서 15분 동안 셰이커에서 배양합니다.
- 앞서 설명한 대로 세 번 세탁하십시오.
- 150μL PBT 완충액에 비드를 재현탁합니다.
- 셰이커에서 실온, 700rpm에서 5분 동안 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 기기를 설정하십시오9.
참고: 이미저 기기와 함께 제공된 xPONENT 소프트웨어(17 )가 사용되었다. 형광 판독 설정은 다음과 같이 설정되었습니다: 수집량은 50μL로 설정되었고, 최소 측정값은 50개의 비드이며, XY 히터 없이 분석 유형은 없음으로 설정되었습니다.
4. 데이터 분석
- 유효성 검사 실행
- 최소 비드 수에 도달했는지 확인합니다. 통계적으로 유효한 MFI8을 얻기 위해 웰당 최소 35개의 비드가 권장됩니다.
- 블랭크 및 음성 대조군 샘플 MFI 값이 최소인지 확인하십시오.
- 표준 곡선을 플로팅하여 표준에 대한 MFI 값을 확인합니다. 이들은 블랭크 및/또는 음성 대조군 샘플보다 높습니다.
- 샘플 데이터 분석
- 데이터를 CSV 파일로 내보내고 R 소프트웨어를 사용하여 외부에서 분석합니다.
결과
프로토콜의 검증을 위해 따르는 프로세스를 설명하기 위해 우리는 플라비바이러스(DENV1 NS1 단백질), 알파바이러스(CHIKV VLP 단백질) 및 부냐바이러스(RVFV NP)의 세 가지 아르보바이러스 계열을 나타내는 세 가지 항원을 선택했습니다. 항원은 사전 노출 인구(ORPAL), 프랑스(비노출) 인구 혈청 및 아프리카(세네갈 및 마다가스카르)의 2개 코호트의 표준 풀에서 테스트되었습니다.
항체 반응의 희석 선형성
비드 커플링에 사용할 항원의 농도는 ORPAL 풀의 연속 희석액을 사용하여 결정되었습니다. 선형 표준 곡선을 얻은 최저 농도로 최적의 농도를 선택했습니다(데이터는 표시되지 않음). 그림 1 은 각 항원에 대한 최적의 농도에서 선택된 아르보바이러스 항원의 선형성을 보여줍니다. 커플링의 품질 관리를 위해 결합된 비드의 각 배치는 미리 선택된 농도를 사용하여 ORPAL 표준 풀에서 희석 선형성에 대해 테스트되었습니다.
표준 수동 커플링 분석과의 비교 가능성
새로운 자동 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터와 잘 확립된 수동 결합을 평가하기 위해 수동 결합과 자동 결합으로 얻은 결과에서 생성된 표준 곡선을 비교했습니다. 그림 2 는 두 분석의 평행 선형성을 보여줍니다. MFI 값은 항원에 따라 다릅니다.
비드 커플링 배치 변형
동일한 커플링 배치에서 테스트의 재현성이 평가됨에 따라 커플링 배치 변동은 Levey-Jennings 차트18을 사용하여 평가되었습니다. 대표적인 항원 및 대조군 BSA 결합 비드를 사용하고 ORPAL 표준 풀에서 테스트했습니다. 그림 3 은 각 항원에 대해 서로 다른 날짜에 테스트된 19개의 서로 다른 플레이트의 MFI를 보여줍니다. 결과 MFI는 세 가지 항원과 대조군에 대해 평균 ± 3 SD 범위 내에 속합니다.
다중화가 MFI에 미치는 영향
분석의 성능을 추가로 평가하기 위해 여러 항원의 다중화가 측정된 항체 반응에 영향을 미치는지 여부를 테스트했습니다. 반응은 ORPAL 표준 풀을 사용하여 단일 항원(또는 단일 플렉스 비드)과 비교되었습니다. 도 4 는 MFI를 단일 항원에서 측정했을 때 또는 50개의 항원을 포함하는 프리믹스로부터 얻은 결과 사이에 강한 상관관계(R = 0.99, p < 2.2e-16)를 보여줍니다.
아프리카 인구의 인간 혈청 샘플에서 항체 반응
다양한 코호트의 샘플에 대한 분석의 적용 가능성을 평가하기 위해 우리는 아르보바이러스에 노출될 가능성이 높은 아프리카 인구의 인간 혈청 샘플의 항체 반응을 아르보바이러스에 노출될 가능성이 낮은 프랑스 코호트의 항체 반응과 비교했습니다. 총 1,596개의 샘플이 마다가스카르, 1,428개는 세네갈, 84개는 프랑스 코호트에서 테스트되었습니다. 그림 5 는 서로 다른 코호트에 대한 밀도 플롯을 보여줍니다. 세네갈 코호트의 경우, CHIKV VLP에 대한 반응에 대해 데이터의 명확한 이중 모드 분포가 관찰되어 모집단에서 CHIKV에 대한 두 가지 뚜렷한 반응을 시사합니다. 세네갈 코호트에서 DENV1 NS1 및 RVFV NP에 대해서도 미묘한 바이모달 꼬리가 관찰되는 반면, 프랑스와 마다가스카르 코호트 사이에는 차이가 없습니다.
그림 1: ORPAL 표준 풀에서 테스트된 항체 반응의 선형성. 선택된 아르보바이러스 항원이 예시로 나타난다. 중앙값 형광 강도(MFI)는 y축(로그 눈금)에 표시되고 x축에는 표준 풀의 연속 희석이 표시됩니다. 패널의 모든 항원은 샘플에 대한 대량 테스트에 앞서 표준 풀에서 사전 테스트를 거쳤습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 커플링 방법에 의한 항체 반응의 평행 선형성. ORPAL 표준 풀(x축)의 연속 희석에서 테스트된 대표 항원(패싯)의 MFI(y축) 로그. 색상은 자동화(빨간색, 녹색, 파란색) 및 수동(보라색)과 같은 다양한 결합 방법을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 플레이트 간 변동. BSA 결합 비드(대조군), DENV1 NS1, CHIKV VLP 및 RVFV에 대한 Levey_Jennings 플롯은 1:400 농도의 ORPAL 표준 풀에 대해 표시됩니다. 결과는 서로 다른 날짜에 실행된 19개의 플레이트를 나타냅니다. MFI는 y축에 표시되고 테스트 수는 x축에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 및 다중 분석에 대한 항체 반응의 상관관계. 표준 풀을 1:400의 최종 농도로 희석하고 단일 항원 코팅 비드와 병렬로 50-플렉스 항원을 포함하는 프리믹스에서 테스트했습니다. 분석에는 Pearson 상관 관계가 사용되었습니다. 3가지 대표적인 항원을 예로 제시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 풍토병 및 비풍토병 샘플 코호트에 대한 분석 적용. 이 분석은 마다가스카르(녹색), 세네갈(파란색) 및 프랑스(빨간색)의 샘플에서 테스트되었습니다. 샘플은 1:400의 최종 농도로 희석되었습니다. X축은 동일한 농도(1:400)에서 표준 풀 MFI에 대한 샘플 MFI의 비율로 계산된 정규화된 MFI(nMFI)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 비드 응집의 대표 이미지의 예. 패널 (A)은 응집되지 않은 비드를 보여주고, 패널 (B)은 비드 응집체를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 버퍼 표. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: KingFisher Apex 비즈 커플링 프로토콜 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: 프리믹스의 비드 부피 계산 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
FMIA의 사용은 혈청학적 검사의 환경을 변화시켰습니다. 이 분석의 강점은 한 번의 반응에서 여러 항원에 대한 항체 반응을 평가하여 결과까지 시간을 단축하고 테스트 비용을 절감할 수 있다는 것입니다. 이는 혈청학적 감시에서 특히 중요합니다. 그러나 FMIA 분석의 일상적인 사용은 반응당 단일 항원을 처리해야 하는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리는 수동 비드 커플링 단계로 인해 방해를 받습니다. 이 보고서는 항원을 비드에 화학적 결합하는 자동화된 방법을 제시합니다. 자동화를 통해 단일 실행에서 최대 96개의 항원을 동시에 결합할 수 있어 처리량이 많은 항원 결합에 필요한 시간이 크게 단축됩니다.
그림 1 은 항원이 비드에 성공적으로 결합되었음을 보여줍니다. 결과는 또한 새로운 자동 프로토콜과 잘 확립된 수동 프로토콜 사이의 강력한 병렬성을 보여주며(그림 2), 평가된 항원에 대한 IgG 반응을 검출하는 데 있어 열등하지 않은 정확도를 나타냅니다. 플레이트 간 결과(그림 3) 및 비드 커플링 배치 변형(그림 2)은 커플링을 위해 자동화된 방법을 사용할 때 데이터의 비교 가능성을 보여줍니다. 멀티플렉스 MFI와 싱글플렉스 MFI 사이의 높은 상관관계(그림 4)는 많은 수의 항원을 멀티플렉싱해도 이 분석에 사용된 개별 항원 세트에 대한 항체 반응에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.
분석의 검증을 위해 풍토병 및 비풍토병 코호트 모두의 샘플을 테스트했습니다(그림 5). 아프리카에서는 아르보바이러스에 대한 혈청유병률 연구가 여전히 부족하지만, 이용 가능한 데이터 19,20,21,22는 개별 국가 간 및 국가 내에서 다양한 IgG 혈청유병률이 있는 미묘한 그림을 시사합니다. 특히, 기존 데이터는 마다가스카르에 비해 세네갈에서 세 가지 바이러스(치쿤구니야, 뎅기열, 리프트 밸리)의 유병률이 더 높다는 것을 시사합니다(예:19). 이러한 유병률은 다른 코호트와 비교할 때 세네갈의 다양한 항원에 대한 명확하고 뚜렷한 반응을 보인 이 보고서의 관찰과 일치합니다. 이는 상대적으로 높은 혈청유병률의 맥락에서 항체 프로필을 구별하는 분석의 능력을 뒷받침합니다. 마다가스카르 코호트에 대해 관찰된 데이터는 샘플 수집 사이트(22)에서 보고된 바이러스의 낮은 유병률로 설명될 수 있는 반면, 비풍토병 코호트에 대한 데이터의 비교 가능성은 프랑스 코호트의 작은 표본 크기에 의해 부분적으로 설명될 수 있습니다. 또한 지역 간에 보고된 변동성은 데이터 세트에서 관찰된 차이를 설명할 수 있습니다. IgG 혈청유병률을 평가하기 위한 광범위한 연구가 필요합니다. 그러나 이 보고서에 제시된 데이터는 개발된 분석이 평가된 아르보바이러스 항원에 대한 IgG 반응을 검출하는 데 특이적이며, 풍토병 지역의 데이터와 동일한 집단 내에서 미묘하고 뚜렷한 반응을 구별하는 데 특이적임을 보여줍니다.
주요 기술적 과제에는 매우 소량의 사용에도 불구하고 균질한 항원 용액을 달성하고, 프리믹스에서 비드 영역의 등몰 표현을 보장하고, 비드 응집을 최소화하는 것이 포함되었습니다. 96웰 플레이트에서 균질한 용액을 얻는 데 어려움을 극복하기 위해 모든 항원 용액을 플레이트에 분배하기 전에 1.5mL 튜브에 완전히 미리 혼합하는 단계를 구현했습니다. 또한 결합된 비드를 계산하고 동일한 수의 비드 영역이 프리믹스에 추가되도록 볼륨을 조정하는 단계가 추가되었습니다. 비드 혼합을 용이하게 하고 프리믹스의 응집을 최소화하기 위해 초음파 처리 단계도 포함되었습니다.
이 제한된 연구에서는 모든 샘플이 비드 결합 후 1개월 이내에 테스트되었기 때문에 결합된 비드의 안정성과 분석 성능에 미치는 영향은 평가되지 않았습니다. 이 평가는 이 보고서의 범위를 벗어났으며 향후 연구에서 평가될 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고 이 보고서는 아르보바이러스를 포함한 다양한 병원체에 대한 항체 반응을 검출하는 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 아르보바이러스 감염의 혈청학적 감시는 질병을 통제하는 데 매우 중요하며, 이러한 바이러스에 대한 항체 반응을 검출하기 위한 재현 가능하고 신속한 방법의 가용성은 이러한 감염의 부담을 완화하기 위한 전파 및 표적 개입의 이질성을 평가하려는 전 세계적인 노력의 상당한 발전을 나타냅니다. 또한 이 보고서의 초점은 아르보바이러스에 있지만 이 프로토콜은 광범위한 항원에 광범위하게 적용할 수 있으며 해당 분야에서 상당한 발전을 나타냅니다.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 각 연구 현장의 연구 참가자와 지역사회 보건 종사자들에게 진심으로 감사드립니다. 또한 샘플 수집, 데이터 수집 및 실험실 분석에 대한 헌신적인 노력에 대해 모든 실험실 및 현장 직원에게 감사드립니다. 이 작업은 Wellcome Trust의 아프리카 전역 아르보바이러스 전파 강도 및 기후 변화에 대한 개입의 영향(xSTAR) 보조금 재구성[228185/Z/23/Z]의 지원을 받았습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자가 승인한 원고 버전에 CC BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다. 또한 샘플 사용 허가를 해주신 Rob Van Der Pluijm(파리 파스퇴르 연구소 전염병 역학 및 분석), Maylis Douine 및 Alice Sanna(Clinique Antilles-Guyane 조사 센터, 카이엔 병원 센터)에게 감사드립니다.
재료
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| 아자이드나트륨 | 시그마 | S2002 | |
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