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방법 논문

오가노이드 연구를 위한 단일 세포 시드 인간 장 오가노이드

745 조회수

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DOI:

10.3791/69265

⸱

2026년 2월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

이 논문에서

요약

우리는 단일 세포 시드 환자 유래 장내 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시하여, 이질성을 줄이고 후속 분석법과 정밀 의학 응용을 위한 재현성을 향상시키는 표준화된 배양을 제공합니다.

초록

최근 오가노이드 기술의 발전으로 인해 원래 조직의 구조적, 기능적, 유전적, 후생유전학적 특징을 재현하는 환자 유래 장 오르가노이드(PDIO)의 개발이 가능해졌습니다. 그러나 기존의 통과 유래 오가노이드는 크기와 수가 불규칙하게 나타나기 때문에 동일한 조건에서도 결과가 일관되지 않습니다. 이를 해결하기 위해 여기서 '단일 세포 시드 PDIO'라고 부르는 표준화된 접근법이 확립되었습니다. 이 방법에서는 성숙한 PDIO를 효소적으로 단일 세포로 분리한 후, 96웰 플레이트의 개별 웰에 정해진 수로 시딩했습니다. 이 제어된 시딩은 PDIO의 크기와 수를 정규화했습니다. 통과 유래 오가노이드와 비교할 때, 단일 세포 시드 PDIO는 오르가노이드 수와 우물 내 크기 변동성이 감소하여 생성 효율 결정과 생존 가능성 분석의 재현성을 향상시킵니다. 더불어, 이 플랫폼은 전사체 분석과 단백질 발현 프로파일링을 포함한 후속 분석과 호환됩니다. 이 접근법은 종합적으로 실험의 일관성을 높이고 재현 가능한 PDIO 기반 연구의 실질적 토대를 제공할 수 있습니다.

서론

인간 장은 장내 미생물군, 장 상피, 면역 체계 간의 정교한 상호작용으로 정의되는 매우 복잡한 생태계입니다. 이 구성 요소들은 엄격하게 조절된 신호 전달 네트워크를 통해 장 항상성을 유지합니다. 예를 들어, 10조 개가 넘는 미생물로 구성된 장내 미생물군은 면역 세포와 상호작용하여 면역 체계의 활동을 조절하고 균형 잡힌 장 환경을 유지합니다2. 장 상피는 이 미생물군-면역계 교차 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다 3,4. 장내 줄기세포(ISC)는 상피 재생의 핵심 동인으로, 지속적으로 재생하고 분화하여 분비 세포 계통(판네스 세포, 고블릿 세포, 장내분비 세포, 터프트 세포), 흡수성 장혈구, 마이크로폴드 세포 등 특수 세포 유형으로 분화합니다 5,6. 이 세포들은 함께 작용하여 염증 자극으로부터 숙주를 보호하는 중요한 물리적 장벽과 기능적 인터페이스를 형성합니다.

최근 몇 년간 PDIO는 중개 연구 분야에서 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 이 3차원(3D) 배양은 환자 조직에서 분리된 ISC를 사용해 세포외기질(ECM)과 같은 세포외기질 내에 유지되며, ISC 지위를 재구성하는 정의된 성장인자와 함께 유지됩니다. 특히 PDIO는 기증 조직의 유전적 및 후생유전학적 특성을 유지하여 지속적인 증식과 재현 가능한 실험을 가능하게 합니다. Sato 등은 류신 풍부 반복 반응 포함 G 단백질 결합 수용체 5+ (Lgr5⁺)ISCs에서 PDIO를 처음 개발한 이후, 이후 연구들은 PDIO의 생성과 분화에 필수적인 성장 인자를 규명하여 실험실 전반에 걸쳐 널리 채택된 프로토콜로 이어졌습니다11, 12, 13. 그러나 후보 약물로 PDIO를 치료하는 실험 환경은 연구마다 상당히 다르며, 종종 충분히 설명되지 않습니다 (14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26), 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45, 46, 47. 더불어, PDIO는 일반적으로 기계적 교란을 통해 통과되어, 오가노이드 크기, 형태, 공간 배열에서 이질성을 초래합니다. 이러한 변동성은 약물 반응성과 기저 분자 메커니즘의 정확한 평가를 복잡하게 만듭니다. 이 한계를 해결하기 위해 최근 연구에서는 단일 세포 현탁 또는 분류된 단일 세포 45,48,49,50,51,52,53,54에서 유도된 PDIO가 개발되었습니다.

본 글에서는 보완적이고 실용적인 방법 중 하나로, 기존 ECM과 배지를 사용하여 단일 세포 현탁에서 표준화된 PDIO를 생성하는 "단일 세포 시드 PDIO"를 소개하여 정확하고 재현 가능한 분석을 가능하게 합니다. 간단히 말해, 성숙한 PDIO에서 분리한 단일 세포를 정의된 세포 밀도에서 ECM에 삽입하였고, 그 결과 배양 결과는 2주간 모니터링하며 개체 수, 크기, 형태를 정량화했습니다. 각 ECM 돔에는 알려진 셀 입력이 내장되어 있어, 유정당 오가노이드 수가 일관되어, 각 오가노이드 라인49,54의 재생 용량 값을 산출할 수 있습니다. 돔형 마트리젤은 내재된 불안정성과 제한된 확산 때문에 Wnt3a 농도의 공간적 구배로 인해 크기 이질성을 발생시키지만, 단일 세포 시드 PDIO에서의 웰 간 크기 변동성은 통과 유래 오가노이드보다 현저히 낮다49,54. 하지만 이 접근법에는 여전히 실질적인 한계가 있습니다. 형광 활성화 세포 분류가 없으면 일부 오가노이드가 이중항 또는 삼중항에서 생성될 수 있으며, 이는 PDIO 내에서 고유한 생물학적 이질성을 초래합니다. 또한, 생성 효율의 차이로 인해 각 오가노이드 계통별로 최적의 단일 세포 수를 경험적으로 결정해야 한다. 마지막으로, 완전히 분화된 단일 세포 시드 PDIO는 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR), 웨스턴 블롯, 면역조직화학 등 후속 분석을 수행하였습니다.

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프로토콜

실험에 필요한 모든 재료와 시약은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 시약 및 재료의 준비

  1. 오가노이드 배양판을 37°C 인큐베이터에서 90분 이상 예열합니다.
    참고: 배양판을 예열하면 ECM이 굳어지고 돔 형태를 유지하는 데 도움이 됩니다. ECM 중합에 최소 필요한 시간은 90분입니다. 접시를 12시간 이상 미리 데워두는 것이 강력히 권장됩니다.
  2. 오르가노이드 배양지로 0.5% 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 보충한 오르가노이드 배양지(EXP)를 사용하세요.
  3. 단일 세포 시드 PDIO의 분화를 위해서는 성장 인자를 보완한 기저 배지(DIF)를 사용한다(표 1). 기저 배지는 고급 DMEM/F12에 0.5% PS, 0.25% 겐타미신 황산염, 1% 글루타민을 보충하며, 다음과 같은 성장 인자와 함께 구성됩니다: 노긴(100 ng/mL), R-스폰딘-1(1 μg/mL), Wnt3a(100 ng/mL), 표피 성장 인자(EGF; 50 ng/mL), N-아세틸-L-시스테인(1 mM), [Leu15]-가스트린 I 인간 (10 nM), A 83-01 (500 nM), 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-I; 200 ng/mL), 섬유아세포 성장 인자(FGF; 100 ng/mL), 그리고 B-27 보충제(1배) (표 1).
    참고: PS와 겐타미신은 생물학적 위험이 있으므로 장갑과 안구 보호구를 착용하여 다루어야 합니다.
  4. 세포 회수 용액(CRS)을 신선하게 준비하고, 세척 버퍼(DMEM 고포도당 1% BSA), 1 mM Y-27632, EXP, DIF를 사용하고, 사용 전까지 얼음에 보관하세요.
    참고: EXP와 DIF를 최소 20분 이상 실온에 평형으로 맞추고 나서 미리 예열된 배양판에 첨가하세요.
  5. ECM은 얼음 위에 해동하고 항상 차갑게 보관하세요.
    참고: ECM은 얼음 위에서 해동해야 하며, 조기 중합을 방지하기 위해 항상 차갑게 보관해야 합니다.
  6. 효소 해리 시약을 실온에 평형으로 맞추세요. 적용 전에 37°C 수조에서 시약을 예열하세요.
    참고: 효소 해리 시약은 자극 물질이므로 적절한 개인 보호 장비를 착용하여 다루어야 합니다.

2. 냉동 보존된 PDIO의 해동 및 회수

  1. 액체 질소 탱크에서 오가노이드가 들어 있는 냉동 튜브를 회수하세요. 튜브 캡을 약간 풀고 37°C 물욕에서 60-90초간 녹입니다.
    참고: 해동 후 즉시 튜브를 얼음으로 옮기세요.
  2. 세척 완충제가 포함된 넓은 보어 피펫 팁을 미리 적셔 크라이오비얼 튜브에서 50mL 튜브로 오가노이드를 옮깁니다.
  3. 크라이오비얼을 세척 완충제 1mL로 헹구고 남은 내용물을 50mL 튜브로 옮깁니다. 이 세척 과정을 두 번 반복하세요.
  4. 원심분리기 290 × g에서 4 ° C에서 7 분간 돌립니다. 튜브 바닥에 보이는 펠릿이 형성되도록 하세요.
  5. 상정액을 흡인하세요.
  6. 넓은 구경의 프리-습윤 피펫 팁을 사용해 ECM에서 재현탁합니다.
  7. 미리 예열된 24웰 플레이트에 ECM을 점화하고 37°C에서 10분간 배양합니다.
    참고: 웰당 30 μL ECM을 사용하세요.
  8. EXP를 추가하고 우물을 멸균된 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS) 또는 증류수로 둘러싸세요.
    참고: 우물당 500 μL EXP를 사용하세요. EXP 배양은 처음 3일간 10 μM Y-27632를 보충한 후 Y-27632 없이 EXP로 전환했습니다.

3. PDIO 통과

  1. 사용한 경험치를 흡입하세요.
  2. 와이드보어 피펫 팁을 세척 완충제로 미리 적셔 ECM을 제거하기 위해 세포 해리 시약 1mL를 넣고, 내용물을 15mL 튜브로 옮깁니다.
  3. 튜브를 흔들기 위에서 실온에서 10분간 부화시키세요.
  4. 300 × g 에서 4°C에서 7분간 원심분리기.
  5. 상청액을 디캔트하고 세척 버퍼 1mL를 추가하세요. 20번 재정지하세요.
  6. 세척 완충액 1mL를 추가하고 20번 재현탁한 후 50mL 튜브로 옮깁니다.
  7. 300 × g 에서 4°C에서 7분간 원심분리기.
  8. 상정액을 흡인하세요.
  9. 넓은 구경의 프리-습윤 피펫 팁을 사용해 ECM에서 재현탁합니다.
  10. 미리 예열된 24웰 플레이트에 ECM을 점화하고 37°C에서 10분간 배양합니다.
    참고: 웰당 30 μL ECM을 사용하세요.
  11. EXP를 추가하고 우물을 멸균 1배 PBS 또는 증류수로 둘러싸세요.
    참고: 우물당 500 μL EXP를 사용하세요. EXP 배양은 처음 3일간 10 μM Y-27632를 보충한 후 Y-27632 없이 EXP로 전환했습니다.

4. 단세포 씨앗 PDIO 배양

  1. 사용한 경험치를 흡입하세요.
    참고: 항생제가 포함된 폐기물(예: PS나 겐타미신이 포함된 사용한 배지)은 폐기 전에 오토클레이빙(autoclaved)해야 합니다.
  2. 멸균 1x PBS 1mL로 세척하세요.
  3. 와이드보어 피펫 팁을 세척 버퍼와 함께 미리 적셔 300 μL CRS를 추가해 ECM을 분리한 후 내용물을 50 mL 튜브로 옮깁니다.
  4. 300 × g 원심분리기, 4 °C에서 5분간 원심분리기(그림 1A).
  5. 상원액을 흡인하고, 세척 완충액 3mL를 추가한 후 20번 재현탁합니다.
    참고: 이 단계는 기계적으로 오가노이드를 교란시킵니다.
  6. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기(그림 1B).
  7. 상청액을 흡인하고 10 μM Y-27632가 포함된 5mL의 사전 가열된 효소 해리 시약을 추가합니다. 2-3번 휘저어 37°C 수조에서 20분간 배양하고, 5분마다 튜브를 흔들어 주세요.
    참고: 잔해 집합체는 일반적으로 부화 후 10분 이내에 나타납니다. 효소 해리 시약의 총 처리 시간을 20분 이내로 제한하세요. 25분을 초과하지 마세요. 과소화는 단일 세포의 수율과 생존력을 크게 저하시킵니다.
  8. DMEM 고혈당 10mL를 추가하세요.
  9. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기(그림 1C).
  10. 상정액을 흡인하고 세척제 1mL를 추가하세요. 20번 재정지하세요.
    참고: 효소 해리 시약을 포함한 폐기물은 기관 생물안전 지침에 따라 별도로 수집하여 0.5-1% 표백제로 최소 30분 이상 비활성화해야 합니다.
  11. 40 μm 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브로 여과합니다(그림 1D).
    참고: 이 단계는 성숙한 오가노이드에서 단일 세포를 분리하는 데 매우 중요합니다. 단일 세포를 분리하기 위해 40 μm 셀 체를 사용해야 합니다.
  12. 트리판 블루를 사용해 세포 수를 세세요. 계산된 부피를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    참고: 사전 가열된 96웰 플레이트에서 웰당 3,000-4,000 셀을 플레이트합니다.
  13. 300 × g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 원심분리기(그림 1E).
  14. 피펫으로 상청액을 제거하세요.
  15. 넓은 구경의 사전 젖은 피펫 팁을 사용해 세포를 ECM(100-500 셀/μL)에 재현탁합니다.
  16. ECM을 미리 예열된 96웰 플레이트에 점팅하고 37°C에서 10분간 배양합니다.
    참고: 웰당 10 μL ECM을 사용하세요.
  17. 유정에 DIF를 추가하세요. 우물 주변에는 멸균된 1배 PBS 또는 증류수로 둘러싸세요.
    참고: 웰당 150 μL DIF를 사용하세요. DIF 배양은 3일간 10 μM Y-27632를 보조한 후 Y-27632 없이 DIF로 전환하였습니다. 매체를 3일마다 바꾸고 총 10일 동안 유지 하세요.

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결과

단일 세포 시드 PDIO를 생성하기 위해, NYU 그로스만 의과대학 기관심사 위원회(염증성 장 질환 환자의 점막 면역 프로파일링) 하에 2.8mm 표준 생검 겸자를 사용해 감시 대장경 중 동의한 건강한 대상자로부터 점막 핀치 생검을 수집했습니다. S12-01137). 그 후, 성숙한 PDIO에서 분리된 6,000개 세포를 ECM에 분리하여 단일 세포 시드 PDIO를 생성한 뒤, DIF에서 배양했습니다. 오가노이드는 단일 세포에서 발생하여 6일째에 싹 모양 구조를 형성하기 시작했습니다(그림 2). 이 접근법의 장점을 평가하기 위해, 기계적 교란에 의해 생성된 통과 유도 PDIO와 1,000, 3,000, 5,000 세포를 시딩한 PDIO를 EXP 또는 DIF13에서 구축하고 배양하였습니다. 오가노이드 형성은 해리된 단일 세포의 입력 수에 비례했다(

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토론

PDIO는 개별 환자의 유전적·후생유전학적 특성을 충실히 보존함으로써 정밀 질병 모델링, 약물 선별, 재생 의학에 큰 가능성을 지니고 있습니다. 그러나 오가노이드 생성 및 특성 분석의 표준화가 어려워 실용적 응용이 종종 제한됩니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 연구들 45,48,49,50,51,52,53,54에서 단일 세포 현탁에서 유래한 PDIO를 이용한 접근법이 도입되었습니다. 단일 세...

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공개 사항

조던 E. 악셀래드는 Biofire Diagnostics, Genentech, Janssen, Takeda로부터 연구 연구비를 받았습니다; AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda, Vedanta로부터의 컨설팅 수수료, 사례금, 자문위원회 수수료. K.C.는 미국 특허 10,722,600호와 임시 특허 62/935,035호 및 63/157,225호의 발명가입니다.

감사의 글

이 연구는 한국 정부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970, RS-2025-02214844, 경구장)의 지원을 받았습니다; 보건복지성의 자금 지원을 받은 한국보건산업발전원(KHIDI)을 통한 한국보건기술연구개발 프로젝트(RS-2024-00406488, 경구장); 국립보건원(NIH) 보조금 DK093668 (켄 캐드웰); K23DK124570 (조던 E. 악셀라드); 크론병 및 대장염 재단 (조던 E. 악셀라드). 연구비 지원자들은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 관여하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
[Leu15]-가스트린 I 인간시그마-올드리치G91450-0.1 mg
15 mL 원뿔형 튜브SPL50015
20X PBS, pH 7.4바이오세상P2007-7.4
50 mL 원뿔관SPL50050
83-01토크리스2939-10mg
고급 DMEM/F-12깁코12634010
액시젠 1000 및 마이크로; L 피펫 팁, 와이드보어, 투명, 멸균 없음악시겐T-1005-WB-C
액시젠 200 & 마이크로; L 피펫 팁, 와이드보어, 투명, 멸균 없음악시겐T-205-WB-C
B-27 보충제(50X) 혈청 무첨가깁코17504044
소 혈청 알부민로슈10735078001
코닝 96웰 클리어 폴리스티렌 마이크로플레이트코닝3599
코닝 셀 복구 솔루션코닝354253
코닝 ECM 매트릭스(코닝 매트리겔) 코닝356231
Costar 24웰 클리어 TC 처리된 다중 웰 플레이트코닝3526
DMEM 고혈당 및 안정글루타민 및 피루브산나트륨바이오웨스트L0103-500
젠타미신깁코15750060
부드러운 세포 해리 시약스템셀100-0485
인간 FGF-염기성 (FGF-2/bFGF) (154 aa) 재조합 단백질깁코100-18B-100UG
인간 IGF-I, 동물성 없는 재조합 단백질깁코AF-100-11-500UG
인간 노긴 단백질아크로바이오시스템비-H5219-1mg
인간 R-스폰딘 1 / RSPO1 (21-146) 단백질아크로바이오시스템RS6-H4220-1mg
인테스티컬트 오가노이드 성장 배지 (인간)스템셀6010
L-글루타민 100X바이오웨스트X0550-100
마우스 EGF 재조합 단백질깁코315-09-100UG
N-아세틸-L-시스테인시그마-올드리치A9165-5 g
페니실린-스트렙토마이신 용액 100X바이오웨스트10022-100
재조합 인간 Wnt3a 대리모아크로바이오시스템WNE-W5253-50ug
TrypLE(효소 해리 시약)은 효소를 발현하며(1X), 페놀 적색 및 nbsp 없음;깁코12604013
Y-27632 이하이드로클로라이드토크리스1254-10MG

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