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방법 논문

신장 근위 세뇨관 세포에서 미토콘드리아 분열/융합 역학 평가

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69268

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

이 논문에서

요약

이 기사에서는 Dendra2 광전환 형광을 통해 미토콘드리아 핵분열/융합 역학을 평가하기 위해 공초점 현미경 및 ImageJ를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 ATP 합성에서의 역할로 가장 잘 알려져 있으며 세포 대사의 주요 조절자 역할을 합니다. 미토콘드리아 역학은 미토콘드리아의 세포내 및 세포간 움직임과 분열/융합 과정을 이해합니다. 이러한 사건은 세포 항상성, 형태, 생체 에너지학, 품질 관리 및 스트레스 반응을 유지함으로써 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 기본이 됩니다. 반면, 미토콘드리아 역학의 조절 장애는 세포 형태와 기능에 영향을 미칩니다. 미토콘드리아 분열/융합 사건의 정확한 측정은 세포 건강을 나타낼 수 있습니다. 미토콘드리아 역학을 측정하는 현재 방법론은 초고해상도 현미경, 연결성을 위한 형광 기술(광표백 후 형광 복구(FRAP)), 시공간 제어를 위한 광유전학적 도구와 같은 고급 이미징을 사용합니다. 정량적 분석은 계산 도구를 활용하여 분열/핵융합 균형을 나타내는 길이, 수, 분기와 같은 매개변수를 측정합니다. 그러나 이러한 방법에는 기술과 정교한 도구가 필요합니다. 이 기사에서는 미토콘드리아 시토크롬 c에 태그된 dendra2 단백질의 광전환 특성을 사용하여 핵분열/융합 사건을 연구하기 위해 ImageJ(피지)에서 무료로 사용할 수 있는 도구와 결합된 공초점 현미경의 사용에 대해 설명합니다.

서론

미토콘드리아는 에너지 생산, 세포 사멸 및 신호 전달에 중요한 역할을 하는 역동적인 소기관입니다1. 미토콘드리아 형태는 미토콘드리아 구획의 크기와 모양을 말하며, 이는 세포 내 및 세포외 상태에 매우 민감하며 세포 건강을 유지하는 데 중요합니다2. 미토콘드리아의 형태는 미토콘드리아의 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있지만 미토콘드리아 모양의 변화는 세포 대사와 전반적인 건강에 영향을 미칠 수 있습니다3. 미토콘드리아 형태의 파괴는 신경퇴행성 장애, 암 및 대사 질환을 포함한 여러 질병과 관련이 있습니다4. 미토콘드리아 형태는 세포 항상성을 유지하고 다양한 대사 요구 사항에 반응하는 데 중요한 융합 및 분열/융합 사건에 의해 동적으로 조절됩니다 5,6.

미토콘드리아 역학은 소기관이 다양한 스트레스 요인과 대사 요구 사항에 반응하는 데 도움이 됩니다7. 여기에는 지속적인 분열/융합, 세포 내 또는 세포 간 미토콘드리아의 이동이 포함됩니다. 미토콘드리아는 분열/융합 사건을 통한 형태 변화를 통해 세포 에너지 요구에 적응합니다8. 이러한 과정은 미토콘드리아 모양을 결정하고 에너지 출력, 활성 산소종(ROS) 생성 및 미토콘드리아 품질 관리와 같은 미토콘드리아 기능에 영향을 미칩니다 7,9,10. 또한, 미토콘드리아 분열/융합은 기능적 미토콘드리아 네트워크를 유지하는 균형 메커니즘입니다11. 융합은 미토콘드리아 내용물의 교환을 허용하여 국소 손상에 대한 보완 및 완충을 촉진하는 반면, 핵분열은 미토파지를 통해 손상된 미토콘드리아의 분리 및 제거를 가능하게 합니다 7,12. 또한, 분열은 미토콘드리아의 손상된 구성 요소를 분리하는 데 도움이 되며, 이는 선택적 자가포식 과정인 미토파지에 의해 제거됩니다13. 반면에 융합은 미토콘드리아 내용물을 보완하여 손상된 구성 요소를 희석할 수 있습니다14. 미토콘드리아 분열/융합의 핵심 플레이어는 미토콘드리아 외부 막 융합에 필수적인 미토푸신(MFN1/2)입니다15,16 (OPA1): 이 다이나민 유사 GTPase는 내부 미토콘드리아 막 융합을 담당합니다16. 핵분열 단백질은 다이나민 관련 단백질 1(Drp1), 분열 촉진 단백질13,17을 포함합니다. 미토콘드리아 분열 1 단백질(Fis1), 미토콘드리아 분열 인자(Mff) 및 미토콘드리아 분열 조절자1 유사(MTFR1L). 미토콘드리아 미세구조를 연구하기 위해 초고해상도 EM과 같은 여러 기술이 사용되었습니다18. STED 및 MINFLUX 초고해상도 현미경(나노경)과 결합된 단일 분자 형광 제자리 혼성화(smFISH)는 개별 미토콘드리아 mRNA 및 관련 단백질을 시각화하는 데 사용되었습니다18. 단일 분자 국소화 현미경(SMLM) 기술은 막 간격의 변화를 추적합니다19. 확률론적 광학 재구성 현미경(STORM) 초고해상도 현미경을 통해 미토콘드리아 내막 복합체를 연구할 수 있습니다20. 그러나 이 첨단 장비의 사용은 쉽게 접근할 수 없습니다. 공초점 현미경은 접근하기 쉽고 전문 지식이 덜 필요합니다. 또한, 미토콘드리아 표적 형광 단백질의 개발은 미토콘드리아 융합을 시각화하고 정량화하기 위해 광활성화성 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하고 있기 때문에 살아있는 세포의 미토콘드리아 역학 연구를 크게 발전시켰습니다21.

미토콘드리아 분열 및 융합을 연구하기 위해 세포는 DNA에 결합하고 DNA 손상을 유도하여 미토콘드리아 매개 세포사멸로 절정에 달하는 시스플라틴과 같은 약물에 스트레스를 받거나 노출됩니다23. 이 연구에서 우리는 미토콘드리아가 풍부하고 재생 능력이 높기 때문에 시스플라틴 처리된 신세뇨관 세포의 분열 및 융합 사건을 연구하기 위해 광활성화 가능한 미토콘드리아 마우스의 광전환 가능한 태그가 지정된 Dendra2 미토콘드리아를 사용했습니다. 그러나 이 프로토콜은 광전환 가능한 태그가 지정된 Dendra2 미토콘드리아가 있는 모든 세포 유형에서 사용할 수 있습니다(그림 1A-C).

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프로토콜

모든 동물 작업은 Temple University의 Temple University Institutional Animal Care and Use Committee(Animal Protocol-5183)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. Dendra2 단백질을 발현하는 미토콘드리아를 가진 Pham 마우스를 구입했습니다.

1. 세포배양배지의 제조

  1. 비드24 를 사용하여 사구체 내피 세포에서 분리한 후 프로토콜에 따라 신장 근위 세뇨관 세포를 분리합니다(그림 1A). Bouchareb 등은 마그네틱 비드를 사용하여 형광 미토콘드리아(mito-Dendra2)를 발현하는 형질전환 마우스의 신장에서 사구체 내피 세포(GEC)를 분리하고 배양하는 방법을 개발했습니다. GEC를 분리한 후 펠릿에 남아 있는 세뇨관을 분리하여 배양합니다.
  2. 5% FBS(열 비활성화), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 10mL의 DMF-12가 있는 10cm 접시에서 신장 근위 세뇨관 세포를 배양합니다. 세뇨관이 세뇨관 밖으로 이동할 때까지 2-3일 동안 세뇨관을 키웁니다.
  3. 2일 동안 굶주린 후(FBS 없이 DMF-12 사용) 형태에 따라 세뇨관 세포를 선택합니다.
    참고: 실험을 위해 50-70% 합류 세포가 있는 디스크를 사용하십시오. 파종하기 전에 혈구계로 세포 수를 계산하십시오.
  4. 실험을 위한 세포 파종: 실험 요구 사항에 따라 웰당 1-5 × 105 세포의 밀도로 유리 바닥 배양 플레이트에 세포를 파종합니다. 시스플라틴을 첨가하기 전에 세포가 밤새 부착되어 성장하도록 하십시오.
    참고: 시스플라틴은 위험한 화학 요법 약물이므로 인력과 환경을 보호하기 위해 안전 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다. 이를 위해 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛, 개인 보호 장비(PPE), 오염 제거, 유출 제어 및 폐기물 처리(유해 약물 폐기물-화학 요법) 지침에 따르십시오: 이중 장갑, 구글을 착용하고 작업 표면의 오염을 제거하고 유출 키트를 워크스테이션 근처에 보관하고 폐기물 용기에 명확하게 라벨을 붙입니다. DMSO의 경우 PPE를 착용하고 흄 후드에서 작업하며 유출 오염 제거 및 폐기 절차를 따르십시오.

2. 시스플라틴을 이용한 스트레스 유도

  1. 시스플라틴 배지의 준비
    1. DMSO에 용해시켜 50mM의 시스플라틴 원액을 준비합니다.
    2. 유리 바닥 배양 플레이트에 1-5 x 106 개의 근위 관형 세포를 플레이트하고 DMF-12 배지 2mL를 추가합니다.
      알림: 모든 유리 바닥 배양 디스크를 사용할 수 있습니다.
    3. 실험 플레이트에 최종 농도 2μM의 시스플라틴을 첨가하여 DMSO의 최종 농도로 0.004%를 갖습니다.
      참고: 1,998μL의 FBS 유리 DMF-12 배지에 희석된 2μL의 50mM 시스플라틴을 준비하고 실험 플레이트에 80μL를 추가합니다.
    4. 세포를 24시간 동안 배양합니다.

3. 이미징

  1. 공초점 현미경 사용
    1. 레이저를 405 nm(Dendra2 광변환), 488 nm(변환되지 않은 Dendra2 여기) 및 561 nm(광 변환 Dendra2, Alexa 594)로 구성합니다.
    2. 레이저를 켜고 안정화 시간을 허용합니다(~10분).
  2. 핵분열 및 핵융합 사건 연구
    1. 레이저를 405 nm(Dendra2 광변환), 488 nm(변환되지 않은 Dendra2 여기) 및 561 nm(광 변환 Dendra2, Alexa 594)로 구성합니다.
    2. 배양 디스크를 배양 챔버에 넣습니다.
    3. 챔버 주위에 물을 추가하고 온도를 37°C로 설정합니다. CO2 의 공급은 유지되어야 합니다.
    4. 배양 챔버가 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 온도 변화는 세포에 스트레스를 줍니다.
    5. 미토콘드리아 이미징을 위해 더 높은 배율과 해상도를 사용하여 세포를 시각화합니다.
    6. 왼쪽 상단 모서리에 있는 드롭다운 메뉴를 열고 FRAP 옵션을 선택합니다(그림 2A-D).
    7. 광표백이 수행될 LAS X 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
      참고: 관심 영역은 개별 미토콘드리아가 분석될 때 결과에 영향을 미치지 않는 모든 크기로 그릴 수 있습니다.
    8. 낮은 레이저 강도에서 일련의 사전 표백 이미지를 획득하여 기준선 형광 강도를 설정합니다. 광 전환(0.00), 48nm(0.20) 및 56nm(0.20)를 위한 Setlasersto405nm파장을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.
      참고: 레이저 파장 뒤의 괄호 안의 값은 광표백에 영향을 미치지 않으므로 임의의 값으로 설정할 수 있는 레이저 강도를 나타냅니다.
    9. 세포를 광표백하려면 고강도 레이저 펄스를 적용하여 ROI를 표백합니다. FRAP 레이저를 405 nm (4.00), 488 nm (0.00) 및 561 nm (0.00)로 설정합니다. 59회 반복 동안 사전 표백을 5.140초로 설정하고 표백 후 원하는 타이밍으로 설정합니다(그림 2B)(표백 후 및 표백 후 레이저 강도는 괄호 안에 언급됨).
    10. 표백 후 이미징의 경우 낮은 레이저 강도로 이미지를 계속 획득하여 10분 동안 형광 회복을 관찰합니다. FRAP 레이저는 405nm(0.00), 488nm(0.50) 및 561nm(0.50)로 유지합니다.
      참고: 표백 시간은 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 우리 손에서는 관형 세포와 판막 간질 세포(VIC)의 미토콘드리아에 유사한 표백 시기가 사용되었습니다. FRAP가 종료되면 표백 후 이미지를 획득하는 것 외에도 이미지 또는 살아있는 세포 이미징(그림 3 및 보충 비디오 1)을 수행할 수 있습니다.

4. 이미지 분석

참고: 미토콘드리아는 Dendra2 단백질로 태그가 지정되어 있기 때문에 광표백을 겪을 때 dendra2 단백질의 돌이킬 수 없는 형태 변화로 인해 561nm 레이저를 통해 검출된 적색 형광이 증가합니다. 빨간색 미토콘드리아가 표백되지 않은 녹색 미토콘드리아와 융합하면 조합이 노란색을 띠게 됩니다. 이 현상을 이용하여 동적 핵분열/핵융합 사건을 측정할 수 있습니다.

  1. 병합된 빨간색과 녹색 미토콘드리아 프로파일링
    1. RGB 프로파일러 플러그인을 설치하여 선택 항목에서 빨간색 및 녹색 신호를 프로파일링합니다.
      알림: 웹 사이트의 지침에 따라 피지 섹션에 플러그인을 추가하십시오.
    2. ImageJ를 엽니다(그림 4A).
    3. 파일 메뉴에서 분석할 파일을 찾아 엽니다(그림 4B).
    4. 색상 모드 합성을 선택하고 자동 크기 조정 옵션을 선택한 다음 분석할 비디오를 엽니다(그림 4C).
    5. 분석할 직사각형 영역을 선택합니다(그림 4D).
    6. 선택한 사각형 영역 근처를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제 를 선택합니다(그림 4E).
    7. 모든 이미지 스택을 복제하는 복제 하이퍼 스택 옵션을 선택합니다(그림 4F).
    8. 복제된 스택을 RGB 형식으로 변환하려면 이미지를 선택하고 이미지 드롭다운에서 RGB 옵션을 선택합니다(그림 4G-H).
    9. RGB 이미지가 복제되어 하나의 프레임만 선택됩니다(그림 4I).
    10. 이미지의 미토콘드리아가 구부러져 있으면 길이를 따라 선을 그립니다. 그런 다음 편집 메뉴로 이동하여 선택 항목을 선택하고 곧게 펴기를 클릭합니다(그림 5A).
    11. 이미지의 제목을 선택하고 선 너비를 20픽셀로 설정합니다(그림 5B).
    12. 미토콘드리아를 곧게 펴고 나면 관심 있는 미토콘드리아를 따라 선을 그려 직선과 일직선이 되도록 합니다(그림 5C).
    13. RGB 프로파일러 플러그인을 엽니다(그림 5D).
    14. 활성화되면 플러그인은 그려진 선을 따라 빨간색과 녹색 형광 강도를 보여주는 플롯을 생성합니다. 각 피크의 높이는 형광 강도에 정비례합니다(그림 5E).
      참고: 미토콘드리아 형태는 또한 미토콘드리아 분석기 플러그인25를 사용하여 계산할 수 있습니다. 노출에 사용되는 영역을 선택하고 선택한 영역의 임계값을 분석한 다음 미토콘드리아 형태 및 2D 분석을 측정합니다. 면적 둘레 및 기타 매개변수를 선택할 수 있습니다.

5. 융합 이벤트 분석

  1. 융합 전 기준선 설정: 미토콘드리아 융합 전에 적색 형광(561nm)이 하나의 미토콘드리아에 국한되고 녹색 형광(488nm)이 인접한 미토콘드리아에 국한되어 있는지 확인합니다. 해당 강도 플롯은 최소한의 겹침으로 빨간색과 녹색의 두 개의 별개의 피크를 표시해야 합니다.
  2. 융합 후 이벤트 확인: 융합 후 빨간색 신호(Dendra2 매트릭스 함량을 나타냄)가 인접한 녹색 미토콘드리아로 퍼져 내용물 혼합을 나타냅니다. 이제 강도 플롯에 겹치는 빨간색과 녹색 피크가 표시되어 융합 이벤트를 확인합니다.
  3. 융합 사건의 평가는 살아있는 세포 이미징에서 융합을 위해 건강한 미토콘드리아와 광표백된 미토콘드리아를 신중하게 선택하여 결정할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 빨간색/녹색 비율의 변화는 융합 사건을 나타냅니다.

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결과

일차 세뇨관 상피 세포를 효소 분해에 의해 마우스 신장에서 분리하고 5% CO2 이하에서 37°C에서 5% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 DMF-12에서 배양했습니다. 80% 컨플루언에 도달하면 세포를 트립신화하고(0.25% 트립신-EDTA) 웰당 5 × 104 세포의 밀도로 콜라겐으로 사전 코팅된 유리 바닥 배양 플레이트에 파종했습니다.

배양 배지는 0.004% DMSO(v/v; 시스플라틴 용매 부피와 일치)가 보충된 DMF-12에서 최종 농도 μM의 시스플라틴을 포함했습니다. 세포는 웰당 2mL에서 24시간 동안 처리에 노출되었습니다. 처리 후 배지를 신선한 화합물이 없는 배지로 교체했습니다. 세포 형태는 위상차 현미경을 통해 평가되었습니다. 이 기사에서는 화학 요법 치료 후 미토콘드리아 분열 및 융합 사건을 결정하기 위해 공초점 현미경 및 Im...

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토론

미토콘드리아 분열/융합은 미토콘드리아 항상성과 세포 생존력을 유지하는 중요한 동적 과정입니다26. 이러한 과정을 적절하게 평가하려면 미토콘드리아 형태, 역학 및 기능을 시각화하고 정량화하기 위한 고급 이미징 기술이 필요합니다27,28. 미토콘드리아 분열/융합을 측정하기 위해 다양한 기술이 사용되었습니다. 정교한 도구 중 일부에는 살아있는 세포에서 미토콘드리아 크리스타 역학을 시각화할 수 있는 STED(Stimulated Emission Depletion) 나노경이 포함됩니다29. 구조화 조명 현미경(SIM)은 미토콘드리아 이하 구조의 다색 이미징에 사용되었습니다30. 확장 현미경은 미토콘드리아 크리스타(mitochondrial crista...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 국립 보건원 보조금 번호 5R01DK135470-03, ISAC-NIH 보조금 5U24DK128851-03 및 미국 심장 협회 박사후 연구원의 연구 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>세포 배양 
DMEM/F12 기저 배지와 nbsp;(깁코/캣. 번호 11320033 ) 근위 관 세포 배양 및 nbsp;
태아 소 혈청(FBS) 5-10% 보충제 (바이오웨스트/분류 번호 S181B)와 nbsp;배양 배지 풍부화 
페니실린-스트렙토마이신 100X (깁코/캣. 번호 15140122)와 nbsp;항생제 보호 및 nbsp;
콜라겐 IV와 nbsp;코팅 ( 시그마-C5533-5M)  이비디 플레이트 코팅  
트립신-EDTA 0.25% 용액 (깁코/캣. 번호 25200056)와 nbsp;셀 분리대 
인산 완충 식염수(PBS) (깁코/캣. 번호 10010023 )와 nbsp;세포 세척 & nbsp;
<강>치료 
시스플라틴 2 & 마이크로; M 작업 집중 및 nbsp;(셀렉 케미컬/Cat. 번호 S1166)와 nbsp;스트레스 유도  그리고 nbsp;
디메틸 설폭사이드(DMSO)와 nbsp;차량 제어 (피셔 사이언티픽/캣. 번호 D1391)와 nbsp;시스플라틴 용매 조절 및 nbsp;
Imaging 
페놀 적색 프리 미디엄  실시간 영상 촬영  (깁코/캣. 번호 21041025) 및 nbsp;배경 형광 감소  
분자생물학 
트리졸&레그; 그리고 nbsp;RNA 추출 (깁코/캣. 번호 15596018)와 nbsp;총 RNA 분리 수 
SYBR 그린 마스터 믹스 qPCR 화학 및 nbsp;(Thermo Scientific/Cat. 번호 K0221)와 nbsp;미토콘드리아 역학 유전자 발현(DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1)과 nbsp;
형광 공구 
덴드라2 미토콘드리아 매트릭스 태그 Jacson 연구소(PhAM삭제) 광 전환 가능한 리포터(405nm 변환, 488/561nm 이미징)  
Microscopes 
공초점 현미경  라이카 DMi8 생세포 영상 및 FRAP 405nm/488nm/561nm 레이저  
이미지 J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
RGB 프로파일러 플러그인 https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. 핵융합 사건 분석(적색/초록 신호 겹침) 

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