이 프로토콜은 젊은 RAC1/CED-10 돌연변이 Caenorhabditis elegans에서의 정량적 배변 검사를 상세히 다루며, 전염성 파킨슨병 병기를 연구할 수 있는 간단한 모델을 제공합니다. 이 방법은 다른 동물 모델의 한계를 극복하고 초기 파킨슨병리를 표적으로 하는 치료 전략 시험을 용이하게 합니다.
방법 논문
초기 파킨슨병 연구 도구로서 Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 돌연변이의 위장 운동성 평가
이 논문에서
요약
초록
파킨슨병(PD)은 가장 흔한 신경퇴행성 질환 중 하나로, 도파민성 신경세포가 크게 손실된 후 나타나는 운동 증상을 바탕으로 진단됩니다. 변비와 같은 비운동 증상이 가장 흔하며 질병 발병을 알리는 경우가 많습니다. 많은 동물 모델이 신경퇴행성 질환 연구에 사용되지만, 대부분은 후기 단계에 집중합니다. 신경퇴행의 정확한 시작 시기를 결정하기 어렵기 때문에, 단일 모델은 전체 질병 진행을 완전히 대표하지 않습니다. 포유류 모델은 수명이 길어 특히 시간과 비용이 많이 듭니다. 반면, 투명한 1mm 크기의 선충인 Caenorhabditis elegans(C. elegans)는 짧은 수명과 번식 주기(~3주 및 3일)를 가지며, 빠른 세대 교체 덕분에 더 빠르고 비용 효율적인 실험을 가능하게 합니다. C. elegans 의 배변 운동 프로그램은 Rho/rac GTPases가 참여하는 복잡한 유전적 네트워크에 의해 조절되는 리드미컬 주기로 구성되며, RAC1( C. elegans의 CED-10)도 그 중 하나입니다. 우리는 RAC1/CED-10 돌연변이체가 GABA 형태와 기능이 저하되어 배변 주기가 방해됨을 보인다는 것을 보여주었습니다. 여기서는 RAC1/CED-10 C. elegans 의 변비 초기 측정 실험 프로토콜을 제시합니다. 신경퇴행 전 초기 PD 증상을 예측하는 도구 외에도, 이 프로토콜은 약물 개입의 효능을 평가하는 초기 평가 지표로도 활용될 수 있습니다. 이러한 변화가 질병 특이성이 아니기 때문에, 이 모델은 다른 질병에서 조기에 발생하는 변화를 조사하는 데 유용한 도구를 제공한다고 믿습니다.
서론
파킨슨병(PD)은 두 번째로 흔한 신경퇴행성 장애이며 신경학적 장애의 주요 원인입니다 1,2. 병리학적 특징으로는 주로 α-시누클레인으로 구성된 루이체와 루이 신경돌, 그리고 흑질과 다른 뇌 영역에서의 신경 손실이있습니다.
임상적으로 PD는 운동 장애로 분류되지만 광범위한 비운동 증상도 특징지어집니다. 운동 장애는 흑질의 도파민성 신경 퇴행과 선조체 도파민 소모로 인해 발생합니다. 그러나 변비, 불안, REM 수면 행동장애4와 같은 비운동 증상은 종종 전구기(prodromal phase)에 나타나며, 이 시기에 신경퇴행이 외 구조(예: 뇌간, 후각계, 자율신경 경로)에 영향을 미칩니다5.
파킨슨병 연구에서 가장 큰 도전 과제는 임상 발병이 지연된다는 점입니다. 운동 증상은 일반적으로 도파민성 신경세포의 60%-80%가 손실된 후에야 나타나며, 이 시점에 이르면 치료 개입의 효과가 떨어집니다. 초기 비운동 증상(예: 자율신경 기능 장애)은 전부성 PD6의 바이오마커로 작용할 수 있으나, 비특이성 때문에 확정 진단을 복잡하게 만듭니다. 이러한 한계를 고려할 때, 동물 모델은 초기 PD 단계 연구, 증상 특성화 표준화, 그리고 현재 부족한 신경퇴행을 늦추거나 예방할 수 있는 신경보호 치료법 개발에 필수적입니다.
RAC1/CED-10 C. elegans 돌연변이가 초기 및 후기 PD의 주요 특징을 재현합니다.6. 우리는 이전에 RAC1 활성이 도파민성 뉴런의 생존과 기능에 중요하며, α 시누클레인 유발 독성으로부터 보호한다는 것을 입증했습니다7. 또한 RAC1/CED-10 돌연변이는 초기 PD와 유사한 표현형 변화를 보이며, 여기에는 지질 대사 조절 장애와 GABA 기능 장애가 포함되며, 후자는 배변 주기 방해로 나타난다6. 이 발견들은 RAC1/CED-10 돌연변이를 퇴행성 PD 병태생리학 연구를 위한 다루기 쉬운 모델임을 확립합니다.
여기서는 RAC1/CED-10 돌연변이에 대한 최적화된 배변 분석법을 설명하는데, 이는 장의 운동 이상을 정량적으로 포착하여 PD의 전구기 동안 위장관 특징을 체계적으로 연구할 수 있게 합니다.
프로토콜
참고: 야생형: N2 브리스톨이 사용되었습니다. 초기 PD RAC1/CED-10 모델: BR3579 균주는 유전자형 ced-10(n3246)으로 분류되었으며, 여기서는 RAC1/CED-10으로 명명되어 있습니다. 이 책은 독일 프라이부르크/브라이스가우 알베르트 루트비히 대학교의 랄프 바우마이스터 박사가 아낌없이 기증한 것입니다. 이 ced-10(n3246) 변종은 강한 대립유전자입니다. 변이인 ced-10(n3246)은 G-A로 전환되는 과정으로, CED-10의 글리신 60이 아르기닌(G60R)으로 변화하여 무효 변형 기능 8,9를 생성합니다. 이 대립유전자의 심각도는 다른 ced-10 대립유전자들에 비해 더 강하다. 연구 전반에 걸쳐 양성체가 사용되었다.
1. 벌레 유지 관리
- 선충 성장 배양액(NGM) 25mL를 150mm 페트리 접시에 붓고 한천이 굳어질 때까지 기다립니다. 각 플레이트에 500 μL 대 장 균 OP50 배양액을 씨앗 뿌려 한천 표면에 고르게 퍼뜨립니다. 박테리아 증식을 위해 30°C에서 하룻밤 배양합니다. 사용 24시간 전에 플레이트를 준비하세요.
2. 유충 발달 4 단계 (L4)에서 동기화된 벌레 획득
- L4 유충 발달 단계에서 동기화된 벌레로 장 운동성을 측정합니다. 이 발달 단계에서 벌레를 얻으려면, 아래에 설명된 표백 프로토콜( 11에서 변형됨)을 따르고 RAC1/CED-10 표현형11과 관련된 약간의 수정을 가해야 합니다.
- 1단계와 같이 준비한 대 장 균 OP50과 함께 NGM 플레이트에 임신한 성충 10마리를 추가하여 알을 낳고 벌레가 3일간 성장하도록 합니다. 또는 혼합 개체군이 포함된 NGM 플레이트에서 한천 조각을 새로운 NGM 플레이트로 옮기는 방법도 있습니다. 이 경우, 생애 주기 조절은 임신 중인 성체 10마리를 사용할 때만큼 정밀하지 않습니다. 80시간 후, 야생형의 경우 C . elegans 양성체와 임신한 성체가 혼합된 개체군이 관찰되었다. RAC1/CED-10 돌연변이체는 6시간 지연 발달6을 보였으므로, 임신 성체는 86시간에 나타났습니다.
참고: 임신한 성체는 알이 들어 있기 때문에 식별됩니다. - 10mL M9 세척판을 세척하여 15mL 튜브(해당 유전자형 표기)에서 임신한 성체를 회수합니다.
- 웜을 2000 x g (표준 테이블 원심분리기에서는 ~1500 rpm)에서 2분간 원심분리하여 웜을 펠릿으로 넣고, 상청액을 버린 후 신선한 M9 버퍼 10 mL를 추가합니다.
참고: 상온에서는 작동하지만, 10°C에서 원심분리하는 것이 더 나은 결과를 관찰했습니다. - 2.4단계를 3회 또는 완충제에 박테리아가 없어 보이는 (투명한 상정액)까지 반복하세요. 상청액이 약간 노란빛을 띠고 탁한 것으로 보아 박테리아의 존재를 추정할 수 있습니다.
- 총 3.5 mL에 M9 버퍼를 추가하세요.
참고: 저희 경험상, 멸균된 증류수나 심지어 수돗물도 이 단계에서 오염을 일으키지 않고 사용할 수 있습니다. 이후 표백 과정에서 미생물이 제거되기 때문입니다. 하지만 실험실 간 재현성을 보장하기 위해 M9 완충수나 멸균수를 권장합니다. - 5M NaOH 0.5mL와 표백제 1mL를 섞어 표백용액을 준비합니다. 사용 직전에 이 용액을 신선하게 만드세요. 혼합물 1.5mL를 벌레가 들어있는 원심분리관에 넣습니다.
- 해부 현미경으로 성인 조직의 파괴를 관찰하면서 표백 중에 관을 격하게 저어줍니다. 성체의 흔적만 남아 있을 때 반응을 멈추세요.
참고: 표백 처리는 성충과 유충을 용해시키지만, 배아는 달걀껍질이 표백제로부터 보호해 생존 능력을 유지합니다. 이 단계는 생존자를 얻는 데 매우 중요합니다. 시간이 너무 오래 지나면 모든 벌레가 죽을 수 있어요. 보텍스 사용을 강력히 권장하지만, 큐티클 손상 정도를 3분마다 확인하세요. RAC1/CED-10 돌연변이체는 표백에 더 민감합니다. 성인 조직의 분해 상태를 2분마다 관찰하며 8분을 넘지 마세요. - 반응을 멈추려면 M9 완충제를 넣어 튜브(~15 mL)를 채우세요. 2,000 x g 에서 1분간 빠르게 원심분리기(치료 중일 수 있으니) 상청액을 버리세요.
- 앞서 설명한 대로 M9 버퍼를 튜브에 채우고 원심분리하여 펠릿을 3번 세척하세요. 최종 세척 후에는 상원액을 조심스럽게 제거하여 약 0.1mL가 남게 합니다.
- 이 계란들을 새로운 15mL 튜브에 넣고 M9를 5mL에 추가하세요. 상온에서 부드럽게 회전시키며 배양하세요. 적절한 통기가 이루어져야 합니다.
참고: 2.9단계를 제외한 모든 단계에서 M9 대신 수돗물을 사용한 좋은 동기화 결과를 얻었습니다. - 24시간 후에는 회전을 멈추고, 10°C에서 2,000 x g 의 원심분리기로 1분간 벌레를 먹이세요.
- 해당 유전자형의 펠릿 벌레 30-50 μL 플레이트를 150cm NGM 플레이트에 OP50 씨앗으로 시딩하고 해당 유전자형을 표지합니다. 여러 RAC1/CED-10 벌레가 죽은 것으로 보였는데, 이는 RAC1/CED-10 유전자형의 고유한 특성(개인 관찰)입니다. 따라서 이 돌연변이체들의 양을 두 배로 배제하고 다음 날 모니터링하세요.
참고: 판금된 벌레의 양은 표백 프로토콜의 수확량에 따라 달라집니다. 접시당 벌레 수가 250마리 이상 이상 먹지 마세요. 음식이 빨리 떨어져 벌레가 굶주릴 수 있습니다. 발달 시간 차이를 현명하게 활용해 야생형 벌레의 첫 배변 주기와 그 후 RAC1/CED-10 벌레의 배변 주기를 기록할 시간을 확보할 수 있습니다(다음 섹션 참조). - 34시간 부화 후 L4 단계의 야생형 벌레를 확인하세요. RAC1/CED-10 벌레도 40시간6분 내에 동일한 발달 단계를 달성할 것입니다. L4 벌레와 L3 및 젊은 성충을 구분하려면 크기(~650 μm)를 측정하고 달과 같은 외음부 구조를 확인해12.
3. 장 운동성 기록
- 플레이트를 3mL M9로 세척하여 L4 웜을 두 개의 1.5 mL 원심분리관에 회수하세요.
- 2,000 x g 에서 1분간 원심분리기(그림 1A), 상청액을 버리고 신선한 M9 완충액 1mL를 추가합니다. 이 과정을 3번 반복하세요.
- 이 세척된 벌레들을 OP50 없이 NGM 판에 도금합니다(그림 1B). 이 세척과 마지막 도금 단계로 과도한 박테리아를 제거하세요.
- 벌레를 개별적으로 12웰 플레이트에 5 μL OP50 박테리아가 시딩된 상태로 옮깁니다(그림 1C). 20°C에서 1시간 동안 벌레가 적응할 수 있도록 하세요.
참고: 이 판들은 씨앗을 뿌리고 지렁이를 넣기 전에 건조되었습니다. 이 플레이트들은 미리 준비하지 않는 것이 좋습니다. 박테리아가 과도하게 증식하면 배변 과정을 시각화하기 어려울 수 있기 때문입니다. - 12웰 판을 현미경 아래에 놓고 벌레 하나를 위치시키고 기록을 시작하세요. 15분 동안 배변 주기 기록 (15 사이클; 그림 1D). 12비트 해상도와 초당 60프레임(fps) 프레임 레이트를 제공하는 카메라로 5배 대물렌즈를 사용해 영상을 찍으세요. Windows의 Snipping Tool을 사용해 비디오 획득을 수행합니다. 첫 배변 주기를 감지하면 녹음을 시작하세요.
참고: 현미경이 컴퓨터에 연결되어 있다면, 스니핑 툴로 화면을 직접 녹화할 수 있습니다. 배변 주기 모니터링을 위해 컴퓨터 크로노미터를 강력히 권장합니다. 배변 주기가 끝날 때마다 Laps 버튼을 클릭하세요.
그림 1: 장 운동성 측정을 위한 실험 프로토콜의 개략도. (A) 발달 단계의 동기화된 벌레들. 이 벌레들은 M9으로 3번 채취되어 세척했습니다. (B) 세척된 벌레는 OP50 없이 NGM 판으로 도금됨. (C) 지렁이를 OP50과 함께 12웰 플레이트에서 개별적으로 채취하여 20 °C에서 1시간 기어가게 했습니다. 이 기간 동안 벌레들은 새로운 매체에 적응하고 이동 스트레스에서 이완됩니다. (D) 개별 벌레를 15분간 기록하여 장 운동성을 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
4. 배변 주기 분석
참고: C. elegans의 배변 운동 프로그램은 복잡한 유전적 네트워크에 의해 조율되는 리드미컬한 주기로 구성되어 있습니다. 이 프로그램은 세 번의 연속적이고 뚜렷한 근육 수축으로 구성되며, 각각은 해부 현미경으로 쉽게 감지할 수 있습니다. 첫 번째 단계는 후방 체벽 근육(pBoc)의 수축으로 이어지며, 이어서 전방 체벽 근육(aBoc)이 수축하며, 마지막으로 장근육 수축(EMC)이 이루어져 장 내용물이 배출됩니다(Exp)13 (그림 2).
- 20°C에서 실험을 수행하세요. 모든 영상이 녹화되면 데이터 분석을 시작하세요.
그림 2: C. elegans RAC1/CED-10 돌연변이의 배변 주기. RAC1/CED-10 돌연변이 선충의 C. elegans 배설 주기를 도식적으로 표현한 것. pBoc은 후방 체벽 근육의 수축을 의미하며; aBoc은 전방 체벽 근육의 수축을 나타내며, EMC + EXC는 장 내용물의 배출에 해당합니다. 야생형 방해받지 않은 먹이 동물에서는 이 운동 프로그램이 45초마다 매우 높은규칙성으로 시작됩니다. 벌레는 머리가 왼쪽을 향하고 꼬리가 오른쪽을 향하도록 배치되어 있습니다. 배설(EXC)은 주황색으로 강조되어 있습니다. 이 수치는6에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
5. 비디오 분석
- 비디오 플레이어 프로그램으로 영상 하나를 열어보세요.
참고: 저희는 Windows Media Player Legacy v12를 사용했습니다. 다른 비디오 플레이어 프로그램도 사용할 수 있습니다. - 스프레드시트 파일을 준비하세요. 제공된 템플릿 파일(보충표 1)을 열어보세요. 지정된 필드에 비디오 파일 이름과 웜 크기(선택 사항)를 입력한 후 비디오 재생을 시작하세요.
- 첫 번째 배설물을 정의하고 기록하세요. 시간 0을 벌레를 현미경 아래에 놓는 순간 기록이 시작되는 순간으로 정의하세요. 벌레의 항문 부위를 관찰하고 첫 번째 배설 사건을 확인하세요. 이 사건의 시간(s) 단위로 스프레드시트의 첫 배출(First Excretion)으로 표시된 셀에 기록하세요.
참고: 첫 배설 시간은 벌레마다 다릅니다(예: 벌레 1 = 5초, 벌레 2 = 26초, 벌레 3 = 34초). 이는 기록 전 마지막 배설 시기가 알려지지 않기 때문입니다. - 이후 배설 사건 기록: 재생을 계속하며 각 배설을 순서대로 기록하세요(배설 2, 배설 3 등). 총 16회가 배출될 때까지 계속하세요.
- 주기 간격 계산: 템플릿은 연속된 배설 사이의 간격을 자동으로 결정합니다(예: 배설 2 - 배설 1; 배설 3 - 배설 2; ...). 이 간격들을 사이클 길이로 사용하세요.
- 총 사이클 시간 산정: 16개의 이벤트가 기록되면, 템플릿은 웜이 15사이클을 완료하는 데 필요한 시간을 계산합니다. 이 값은 스프레드시트의 총 시간 셀에 표시됩니다. 이 과정을 각 지렁이에 대해 반복하세요.
참고: 현재 C. elegans의 배변 주기를 신뢰성 있게 감지하는 자동화 소프트웨어는 없습니다. WMicrotracker와 같은 플랫폼은 이동 매개변수(속도, 이동 거리, 벌레 수, 체형14,15)를 정량화하는 데 효과적이지만, 항문 부위를 모니터링하고 수축 또는 배설 사건을 식별하는 데 필요한 해상도를 제공하지는 못합니다. 따라서 인두에서 펌핑16 검사에서 관찰된 한계와 유사하게 수동 점수 산기가 여전히 필요합니다.
6. 주기 길이 측정
- 두 번의 연속된 배설 사이의 시간으로 주기 길이를 점수 매김하세요. 표 1 과 식1에 설명된 대로 다음 사이클의 종료 시간을 한 사이클의 종료 시간을 빼서 계산합니다.
사이클 길이 (n) (초 단위) = 배설 시간 (n+1) - 배설 시간 (n) 식 1
주기 길이 (1st) = 66초 ((시간 배출 2 = 71초) - (시간 배출 1 = 5초)) - 각 데이터 세트에 대해 통계 분석 소프트웨어를 사용해 배변 주기의 평균 기간, 표준편차(SD), 평균의 표준오차(SEM)를 계산합니다.
7. 배변 주기의 리듬성 또는 규칙성
- 변동 계수(CV)는 상대적 변동성을 설명하는 데 사용되며, 데이터가 평균에 비해 어떻게 분포되어 있는지를 설명합니다. 이전에는 C. elegans6에서 배변 주기의 규칙성을 나타내는 지표로 사용된 바 있습니다. 식2를 적용하여 모든 웜의 CV를 계산합니다.
방정식 2 - 각 C. elegans 균주에 대해 통계 분석 소프트웨어를 사용해 평균 CV, 표준편차(SD), 표준오차(SEM)를 계산하세요.
8. 통계 분석
- 세 개의 독립 복제 실험을 수행하며, 각 조건마다 다섯 마리의 벌레를 분석합니다. 데이터 정규성을 샤피로-윌크 검정(α=0.05)으로 평가하며, 이는 n< 50에 권장됩니다.
- 주기 길이 측정이 정규분포를 따르지 않았기 때문에, 분석은 작은 표본 크기에서 중앙값 차이를 감지하는 데 적합한 비모수 Mann-Whitney 검정으로 수행되었습니다. 반대로 CV(%)는 정규분포를 이루며; 불균등한 분산을 고려하기 위해 웰치 보정을 적용한 비쌍 t-검정을 사용해 분석합니다.
- 모든 통계 분석을 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하세요. 두 개 이상의 변형을 포함하는 실험의 경우, 샘플 분포를 연속적으로 검증하는 일방향 분포 분석(ANOVA)과 같은 대체 검정을 적용합니다.
결과
기술된 비디오 기반 검사법은 초기 PD의 C. elegans RAC1/CED-10 모델에 도입되어 장 운동성을 정량적으로 평가하였습니다. RAC1/CED-10 돌연변이체의 발달 지연을 고려하여, 동기화된 개체군은 야생형 대조군과의 단계 일치 비교를 위해 조정되었습니다. L4 단계에서 개별 벌레가 기록되었고, 15회의 연속 배변 주기를 분석하여 주기 길이와 규칙성을 판단하였다. 이 접근법은 장 운동 기능의 정확하고 고해상도 측정을 가능하게 하며, C. elegans의 초기 PD 표현형과 관련된 미묘한 비운동 변화를 감지할 수 있게 합니다.
RAC1/CED-10 동물의 동기화 실험 발달 지연
C. elegans RAC1/CED-10 돌연변이6에서 관찰된 발달 지연을 고려할 때, 야생형 동물과 병행하여 수행되는 동기화 실험은 시간적 조정이 필요합니다. 이 지연을 반영하고 비디오 녹화 시 단계 일치 비교를 보장하기 위해, RAC1/CED-10 동물은 야생형 대조군보다 같은 날 6시간 먼저 도색되었습니다.
파킨슨병과 관련된 배변 변화를 조사하기 위한 RAC1/CED-10 벌충
변비는 운동-PD 진단 20년 전부터 발견될 수 있어, 질병 발병을 알리는 초기 식별 신호 중 하나입니다17. 우리는 이전에 RAC1/CED-10 모델이신경퇴행 6 발병 전 L4 발달 단계에서 비운동적 변화를 보이며, 장 운동성 변화가 그 중 하나임을 보여주었습니다. 프로토콜에 설명된 대로, 개별 벌레는 L4 단계에서 기록되었습니다. 그림 3 은 대표적인 RAC1/CED-10 벌레를 보여줍니다.
그림 3: RAC1/CED-10 돌연변이 동물의 C . elegans 배변 주기 이미지. RAC1/CED-10 돌연변이체의 배변 주기 이미지. 벌레는 머리를 아래로 향합니다. 꼬리 부위는 수평 상자로 강조되어 있으며,6 에서 설명하고 그림 2에 도식화된 배변 운동 단계의 순서를 보여줍니다: (A) 이완된 전경로, (B) 후방 체내 수축(pBoc), (C) 전체 수축(aBoc), (D) 장근 수축과 배출(EMC+EXC). 주기 기간은 아래에 표시되어 있습니다. 화살표는 배출된 물질을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
장 운동성 분석에 사용되는 두 가지 매개변수는 주기 길이와 주기 규칙성13입니다. 먼저, 각 벌레의 15회 사이클을 측정했으며, 이는 그림 4에 나타난 것입니다.
그림 4: 야생형(A)과 RAC1/CED-10 개체(B)의 주기 주기 시간. 세트 1, 2, 3은 독립적인 복제를 나타냅니다. 각 점은 한 번의 배변 주기를 나타내며, 한 마리의 지렁이에는 15개의 배변 주기가 있습니다. B의 분홍색 W2는 15사이클을 완료하지 못해 추가 분석을 위해 폐기되었습니다. W = 벌레. 이 그림에서는 통계 분석이 이루어지지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
개별 웜은 서로 다른 실험 복제 간에 W(W1, W2 등)로 지정되었다(Set = 1, 2, 3). 각 벌레(W)마다 15분 동안 15회의 측정이 이루어졌습니다. 야생형 동물을 대상으로 한 첫 번째 실험 세트(그림 4A, 세트 1)에서는 한 마리의 벌레가 L4가 아닌 젊은 성체였기 때문에 제외되었습니다. RAC1/CED-10의 경우, 데이터 처리 후 15분 이내에 15사이클을 완료하지 못해 한 마리의 웜이 폐기되었습니다. 따라서 RAC1/CED-10 웜이 꽤 불규칙했기 때문에 몇 사이클이 완료되었는지 확인하려면 클럭 애플리케이션을 사용하는 것을 권장합니다.
이 개별 값을 바탕으로 야생형 벌레와 RAC1/CED-10 돌연변이체의 주기 길이 평균 및 표준편차가 계산되었습니다(표 1 및 그림 5). 이전에 발표된6, RAC1/CED-10 벌레는 야생형 벌레보다 주기가 길고 덜 규칙적입니다. 야생형 벌레는 RAC1/CED-10 돌연변이(55초± 12초)보다 주기가 짧± 46초를 보인다.
표 1: 개별 벌레의 배설 주기 측정값을 대표하는 데이터셋. 표는 세 마리의 동물로부터 수집된 대표성 데이터를 요약한 것입니다. 각 웜에 대해 데이터셋에는 비디오 파일 식별자, 몸 크기(μm), 개별 배설 사건에 해당하는 시간점(s 단위), 15개의 연속 사이클에 걸친 계산된 주기 길이, 그리고 총 녹화 시간이 포함됩니다. 주기 길이는 연속된 배설 시간점을 뺄 것으로 계산되었습니다(예: 벌레 VID_154028의 경우 첫 번째 주기 길이는 66초였으며, 계산은 71-5초였습니다). 나머지 항목들은 두 개의 추가 벌레에 대한 유사한 측정값을 보여주며, 데이터셋 내 전형적인 변동성의 예를 제공합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: 배변 주기 매개변수. (A) 배변 주기 길이 및 (B) 야생형 및 RAC1/CED-10 벌레의 평균 CV. 데이터는 SD± 평균을 나타냅니다. N=3 n=5. 배변 주기 길이에 대해 비모수 Mann-Whitney 검정을 적용하였다. 평균 CV 데이터에는 웰치 보정이 적용된 비짝 t-검정이 적용되었습니다. p < 0.001 * p < 0.05. 통계 분석 정보는 8단계를 참조하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
주기 규칙성은 실험18 내 각 벌레의 변동 계수의 평균인 평균 변동 계수(CV)를 사용하여 계산됩니다. 그림 5B 는 야생형 동물에 비해 RAC1/CED-10 돌연변이 동물의 변동성이 더 크다는 것을 보여줍니다. 야생형의 평균 CV는 6% ± 2%인 반면, RAC1/CED-10 돌연변이의 11% ± 6%입니다.
보조 표 1: Caenorhabditis elegans의 배변 주기 길이 계산 템플릿. 사용자는 각 웜 파일 이름을 첫 번째 열에 입력해야 하며, 선택적으로 웜의 몸체 길이를 기록할 수 있습니다. 각 배설 이벤트(배설 1-16)에 해당하는 시간(s)은 비디오 재생을 통해 결정된 순서대로 순차적으로 입력합니다. 템플릿은 연속된 배설 간격(배설 시간 N - 배설 시간 N-1)을 자동으로 계산하며, 이는 배변 주기 길이를 나타냅니다. 16개의 배설 이벤트가 입력되면, 15개의 완전한 사이클을 완료하는 데 필요한 총 시간이 자동으로 계산되어 총 시간(mm:ss) 셀에 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
전발성 PD 연구를 위한 강력한 모델로서의 C. elegans
대부분의 신경퇴행성 질환 모델이 후기 병리에 집중하는 반면, 초기 질병 발병을 연구하는 것은 기술적으로 여전히 도전적입니다. 쥐, 쥐, 영장류 같은 전통적인 포유류 모델은 긴 수명 주기와 높은 비용에 의해 제약을 받습니다. 미세선충 C. elegans는 3주 수명, 3일 번식 주기, 유전적 다루기 덕분에 이러한 한계를 극복하여 신경퇴행의 효율적이고 대규모 연구에 이상적인 시스템입니다.
C. elegans의 RAC1/CED-10 돌연변이는 초기 PD 발병 기전 연구에 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 첫째, 정확한 시간적 해상도 덕분에 신경퇴행성 사건을 명확히 정의된 발달 단계에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 둘째, 이 모델은 유전적 다루기 용이성, 낮은 유지보수 요구, 그리고 고처리량 호환성을 통해 탁월한 실험적 다양성을 제공합니다 6,7. 셋째, C. elegans는 내인성 α-시누클레인 상동체가 없기 때문에, RAC-1/CED-10 모델에서도 중요한 이점을 제공합니다. 연구자들은 α-시누클레인 간섭 없이 전임상 PD 기전을 조사할 수 있으며, 이는 더 진행된6단계를 의미합니다. 이로 인해 이 모델은 초기 병원성 사건을 연구하고 이후 α-시누클레인 발현을 통합하여 진행된 발병 기전을 조사하는 데 탁월한 도구로 자리매김합니다. 마지막으로, CED-10의 인간 RAC1과의 상동성의 진화적 보존은 직접적인 번역적 관련성을 보장합니다10,20.
여기서 설명한 C. elegans 모델은 약리학적 분석에 매우 적합합니다17,21. RAC-1/CED-10 돌연변이는 발달 지연을 보이기 때문에, 초기 단계에서 눈을 실명시키는 것이 불가능하며, 야생형에 비해 신원을 숨길 수 없기 때문입니다. 그러나 약리학적 선별 검사에서는 데이터를 수집하는 실험자와 분석자가 모든 실험 변수를 알지 못하는 이중 맹검 설계를 채택함으로써 편향을 최소화할 수 있습니다.
변비는 전부형성기에 거의 모든 PD 환자에게 영향을 미치며, 종종 운동 증상 이전에 나타납니다5. C. elegans 는 이 초기 위장 기능 장애를 연구하는 데 독특한 이점을 제공합니다. 침습적 개입이 필요한 포유류 모델과 달리, 선충의 투명성과 단순함 덕분에 매우 고정관념적인 배변 운동 프로그램을 비침습적이고 실시간으로 관찰할 수 있는데, 이는 장 운동 결함을 정량화하는 데 중요한 특징입니다. C . elegans 의 짧은 생활사와 정밀한 배설 리듬은 기능 장애에 대한 신속하고 재현 가능한 분석을 가능하게 합니다. RAC1/CED-10 돌연변이체에서는 배변 시기의 편차가 전발성 PD6에서 관찰되는 변비 유사 표현형을 반영합니다. 이 발견들은 복잡한 포유류(예: 생쥐, 영장류)에서의 후속 검증을 위한 기초 틀을 제공하며, RAC1 신호가 장기능장애와 직접적으로 연관됨을 입증합니다.
기계적 관련성 외에도 RAC1/CED-10 모델은 번역적 유용성도 제공합니다. 배변 검사법은 간단하고 재현 가능하며 확장 가능하여 초기 약물 선별에 적합합니다. 주기 타이밍이나 규칙성을 정규화하는 화합물은 포유류 모델에서 빠르게 우선순위를 정할 수 있어 치료 후보에 비용 효율적인 필터를 제공합니다. 위장 기능 장애는 여러 신경퇴행성 질환에서 흔하기 때문에, 이 검사법은 파킨슨병 외에도 적용될 수 있으며, 발견 도구이자 전임상 연구로 가는 중개 역할을 합니다.
프로토콜의 핵심 단계
우리는 전구성 PD와 관련된 주요 비운동 표현형인 RAC1/CED-10 돌연변이체의 장 운동 이상을 연구하기 위한 정교한 방법론을 제시합니다. 확립된 배변 분석법 18,22를 기반으로 하지만, 이 프로토콜은 RAC1/CED-10 돌연변이체가 제기하는 고유한 도전 과제를 해결하여 견고하고 재현 가능한 결과를 보장합니다.
RAC1/CED-10 돌연변이체의 주요 적응은 다음과 같습니다:
동기화 조정: RAC1/CED-10 돌연변이는 야생형 균주에 비해 번식력이 감소한 것으로 나타났다(개인 관찰). 자손 수확량 감소를 보상하기 위해 동기화 시 다음과 같은 조정을 적용합니다: 플레이트 청크 방법 - 야생형 균주에 사용되는 부피의 약 2배에 달하는 더 큰 접종량을 사용하여 발달 변이성 증가를 고려합니다. 임신 성체 방법 - 15-20명의 성인(표준 10명 대비)을 이식하여 이후 실험에 필요한 배아 수를 확보합니다.
표백제 민감성: RAC1/CED-10 돌연변이체의 배아는 차아염소산염 처리에 대한 민감도가 증가합니다. 손상을 최소화하기 위해 야생형 프로토콜에 비해 표백제 노출 시간을 20%-30% 줄이고, 치료 후 현미경으로 배아의 무결성을 확인하세요.
발달 지연 고려사항: RAC1/CED-10 돌연변이체는 야생형 벌레보다 성숙 속도가 더 느립니다10. 녹화의 적절한 동기화를 위해 야생형 벌레를 대상으로 비디오 분석을 시작하여 시간적 기준을 설정하고, 돌연변이들을 연대기적 나이가 아닌 일치하는 형태학적 단계(예: 외음부 형태)로 기록해야 합니다.
작업 흐름 근거: 야생형 C. elegans 를 대상으로 초기 실험을 수행하면 환경 변동성을 조절하고 정상적인 배변 리듬에 대한 참고 자료를 제공합니다. RAC1/CED-10-10 돌연변이체의 발달 지연으로 인해, 기록 일정은 엄격한 연령 일치가 아닌 단계 일치 비교를 우선하도록 조정되어야 합니다.
균주별 시기 고려사항: 돌연변이의 발달 지연은 유전형별 발달 단계를 맞추는 데 중점을 두어 유연한 실험 일정이 필요하며, 단순히 연령에 의존하기보다는 유전자형 간 발달 단계를 맞추는 데 중점을 둡니다.
선충 모델의 한계
C. elegans는 포유류 시스템의 해부학적 복잡성과 경로 중복성(일부 번역 연구의 한계)은 없지만, 단순함 덕분에 이산적인 생물학적 기능을 연구하는 데 유리하다. 장 운동성에 집중하면 이 강점을 활용할 수 있는데, 선충의 유선형 생리 구조 덕분에 특정 기능 매개변수를 정밀하게 분석할 수 있습니다. 치료적 검증을 위해 보완적인 포유류 연구가 필요하지만, C. elegans는 보존된 생물학적 과정의 기전적 연구를 위한 탁월한 플랫폼을 제공합니다21,23.
또한 우리 모델은 변비가 전염 증상으로 나타날 수 있는 초기 전임상 파킨슨병(PD) 연구에 유용한 내인성 α-시누클레인이 부족합니다. 배변 주기 길이는 객관적이고 고처리량의 측정값을 제공하지만, 위장 기능 장애의 한 측면만을 반영하며 질병에 특이적인 것은 아닙니다.
이 검사법은 인간 PD에서 관찰되는 진행성 α-시누클레인 응집, 복합 신경퇴행, 연령 관련 전신 병리를 포착하지는 못하지만, 도파민성 및 GABA 기능 변화와 Rac1 신호전달6의 교란을 관찰하여 이 모델의 기전적 중요성을 강조합니다. 따라서 초기 PD 관련 신경위장 기전과 보존된 경로를 해부하는 데 여전히 가치가 있습니다.
공개 사항
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감사의 글
A.M.J.는 바르셀로나 자치대학교의 생명공학 박사과정 틀 내에서 박사학위(FPU18/05190)를 인정합니다. AL과 AMJ는 MCIN/AEI//10.13039/501100011033/FEDER의 PID2021-122645OB-100 및 PID2024-1576370B-100 자금 지원을 인정합니다. 또한 연구개발 CEX2019-000917-S(FUNFUTURE), CEX2023-001263-S(MATRANS42), 카탈루냐 자치정부 2021S00446, 그리고 101057527유럽연합의 Horizon Europe 연구 및 혁신 프로그램(NextGEM)이 포함됩니다. EDC는 재단(FESS)과 카탈루냐 생명 및 연예 과학 연구소(IRIS-CC)가 지원하는 APR-2024 보조금(PMI24006)의 지원을 인정합니다.
재료
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| 박토펩톤과 nbsp; | VWR | 90000-264 | NGM 판 준비 |
| 블리치 | 어떤 가정이든 | 표백 과정에 대해 | |
| CaCl2 | 라브켐 | CACH-02P-1K0 | NGM 판 준비 |
| 원심분리기 소르발 ST8 | 소르발 | 15194923 | |
| 콜레스테롤 | 시그마-올드리치 | C8667-25G | NGM 판 준비 |
| 시계 | 창문 | v 11.2503.4.0 | |
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