배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

요약

원형질막에서 트랜스-골지체 네트워크로의 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 수송은 막 항상성을 유지하고 신호 전달을 조절하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HeLa 세포에서 유도체화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 살아있는 세포 현미경으로 막관통 화물 단백질의 엔도사이틱 수송을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

초록

세포 표면에서 엔도좀 및 그 너머로 수용체 및 기타 막관통 단백질의 엔도사이토시스는 항상성, 생리학 및 기능에 매우 중요합니다. 엔도사이틱 흡수 및 역행성 단백질 트래피킹을 조사하기 위해 우리는 고정 및 살아있는 세포 이미징, 전자 현미경 및 자가방사선 촬영과 결합된 겔 전기영동을 통해 세포 표면에서 트랜스 골지 네트워크(TGN)로의 수송을 모니터링하기 위해 기능화된 나노바디로 구성된 다목적 툴킷을 구축했습니다. 우리는 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 mCherry(단량체, 비가교, 고친화성 단백질 결합제)를 표적으로 하는 유도체화된 나노바디를 개발했으며, 이는 해당 세포외 형광 태그를 지닌 관심 막 단백질을 발현하는 세포주에 첨가될 수 있습니다. GFP 또는 mCherry 태그가 지정된 막관통 리포터에 결합하면 나노바디는 리포터의 내인성 분류 경로와 병렬로 특이적으로 내재화되고 트래피킹됩니다. 이러한 나노바디는 형광 현미경 및 라이브 이미징에 의해 역행 수송을 추적하기 위해 선택된 형광단으로, 전자 현미경에 의해 미세 구조 국소화를 해결하기 위해 아스코르브산 과산화효소 2(APEX2)를 사용하고, TGN 도착 동역학을 정량적으로 평가하기 위해 티로신 황산화 모티프로 기능화되었습니다. 이 방법론적 연구에서 우리는 박테리아 발현 및 기능화된 나노바디의 정제를 위한 일반적인 프로토콜과 안정적인 GFP-리포터 세포주의 생성에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 트랜스페린 수용체(TfR)와 양이온 의존성 만노스-6-인산염 수용체(CDMPR)의 엔도사이틱 흡수를 분석하기 위해 mCherry 변형 항-GFP 나노바디(VHH-mCherry)를 사용하여 살아있는 세포 이미징에 대한 이 접근법의 유용성을 예시합니다.

서론

원형질막에서 다양한 세포내 구획으로의 수용체 및 기타 막관통(TM) 단백질의 엔도사이토시스는 막 항상성의 유지에 중요합니다 ^1,2. 클라트린 의존성 또는 독립적 엔도사이토시스에 의한 내재화 후, 단백질 화물은 먼저 초기 엔도좀을 채우고 엔도-리소좀 시스템을 따라 추가로 분류되거나, 원형질막으로 재활용되거나, 트랜스-골지체 네트워크(TGN)^로 역행적으로 배송됩니다^3,4,5. 엔도좀 및/또는 세포 표면에서 TGN으로의 재활용은 양이온 의존성 및 양이온 비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CDMPR 및 CIMPR)와 같은 다수의 막관통 화물 수용체의 기능적 주기의 일부이며, TGN에서 후기 엔도좀 및 리소좀으로 새로 합성된 리소좀 가수분해효소를 전달합니다 ^6,7,8, Wntless(WLS)는 Wnt 리간드를 세포 표면으로 운반합니다^9, 10,11,12 또는 TGN 13,14,15,16에서 췌장 상향 조절 인자(PAUF) 및 기타 CARTS 화물을 포함한 가용성 분비 화물 단백질을 호위하는 TGN46. 이러한 모든 화물 수용체는 새로운 클라이언트 단백질의 수집을 위해 TGN을 통해 통근하는 반면, 철 결합 트랜스페린을 내재화하는 트랜스페린 수용체(TfR)는 골지 반환 17,18,19,20,21에서 제외됩니다.

엔도사이틱 및 역행 트래픽을 조사하기 위해 우리는 이전에 세포 표면에서 세포 내 구획까지 화물 단백질을 표지하고 추적하도록 설계된 나노바디 기반 툴킷을 구축했습니다¹⁷. 나노바디는 낙타과 연골 어류에서 자연적으로 발견되는 동종이량체 중쇄 전용 항체(hcAb)에서 파생된 새로운 종류의 단백질 결합제를 구성합니다^22,23. 이들은 hcAb의 가변 중쇄 도메인(VHH)을 나타내며 기존 항체(예: IgG)에 비해 많은 이점을 제공합니다: 단량체, 작은(~15kDa), 용해도가 높고, 이황화 결합이 부족하고, 박테리아적으로 발현될 수 있으며, 고친화성 결합을 위한 선택이 용이합니다²⁴. 이 나노바디 툴킷의 다양성과 광범위한 적용 가능성을 향상시키기 위해 우리는 기능화된 항-GFP 나노바디를 사용하여 세포외 또는 내강 도메인에서 GFP 태그로 태그된 단백질을 표면 표지하고 추적했습니다. 나노바디와 mCherry, 아스코르브산과산화효소 2(APEX2) 또는 티로신 황산화 서열의 재조합 접합을 통해 선의의 막관통 화물 단백질의 역행성 트래피킹은 고정 및 살아있는 세포 형광 현미경, 전자 현미경 또는 자가방사선 촬영을 사용한 생화학적 분석으로 분석할 수 있습니다. 티로실단백질 설포트랜스퍼라제 TPST1 및 TPST2에 의해 촉매되는 티로신 황산화가 트랜스-골지/TGN에 국한된 번역 후 변형이라는 점을 감안할 때, 이 전략은 세포 표면에서 골지체 구획으로의 수송 역학 및 동역학을 직접 평가할 수 있게 합니다 25,26,27. 보다 최근에는 유도체화된 항-mCherry 나노바디를 포함하도록 기능화된 단백질 결합제의 레퍼토리를 확장했습니다. 이 시약은 생화학적 분석을 통해 MPR, 특히 CDMPR^17,28의 기계 의존적 수송 경로를 TGN으로 해부하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.

이전 연구는 주로 자가방사선 촬영에 의한 TGN 도착을 생화학적으로 평가하기 위해 티로신 황산화 서열로 변형된 나노바디의 적용에 초점을 맞췄지만¹⁹, 이 방법 기사에서는 엔도사이틱 트래피킹의 살아있는 세포 이미징을 위한 형광 표지, 기능화 나노바디(VHH-mCherry) 및 리포터 세포주의 생성을 설명합니다. 추가 골지체 상주 형광 리포터 단백질과 함께 이 프로토콜은 선택된 화물 단백질의 엔도좀-TGN 수송의 생세포 이미징을 정량적으로 분석하기 위한 강력한 워크플로우로 추가로 조정될 수 있습니다.

이 프로토콜을 적용하기 전에 연구자는 표적 단백질이 일반적으로 표준 분자 복제 접근법에 의해 생성되는 GFP 태그 융합 구조로 발현되는지 확인해야 합니다. 기능화된 나노바디는 표면 표지 실험에 충분한 수율로 박테리아에서 쉽게 생산될 수 있으며, 낮은 나노몰 범위의 작동 농도는 대부분의 살아있는 세포 이미징 분석에 적합합니다. 사용자는 또한 수송 동역학이 화물 단백질마다 다를 수 있으므로 엔도사이틱 또는 엔도좀-TGN 트래피킹의 최적 시각화를 위해 라벨링 지속 시간 또는 이미징 빈도를 조정해야 한다는 점을 고려해야 합니다.

프로토콜

1. VHH-mCherry를 이용한 박테리아 변형

참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 바와 같이 기능화된 항-GFP 나노바디의 발현, 정제 및 분석에 최적화되었습니다¹⁷. 다음 단계는 VHH-mCherry에 맞게 조정되었으며 이전 방법론 보고서¹⁹와 일치합니다.

1. 단백질 발현에 적합한 화학 적격 박테리아(50-100μL)(예: 대장균 Rosetta BL21(DE3) 세포)를 얼음 위에 올려 해동합니다.
   참고: 표준 실험실 프로토콜에 따라 화학 적격 박테리아 세포를 준비합니다. 이를 위해 NEB의 상업적으로 이용 가능한 BL21(DE3) 셀을 사용할 수 있습니다.
2. 기능화된 VHH-mCherry 구조물을 암호화하는 플라스미드 50ng를 추가합니다(Addgene #109421). 박테리아 발현 동안 나노바디 리포터의 효율적인 부위 특이적 비오티닐화를 보장하기 위해 박테리아 비오틴 리가아제 BirA(Addgene #109424)를 암호화하는 플라스미드의 3배 초과(150ng)와 공동 형질전환합니다. 튜브를 4x-5x로 부드럽게 넘겨 세포와 플라스미드 DNA를 혼합합니다.
   참고: 비오틴 수용체 펩타이드(BAP)에 의한 비오티닐화가 필요하지 않은 경우 BirA-암호화 플라스미드와의 공동 형질전환이 필요하지 않습니다.
3. 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계에서는 동요하지 마십시오.
4. 열충격 박테리아 세포를 수조 또는 가열 블록에 42°C에서 정확히 20초 동안 배치합니다.
5. 실온(RT) 루리아 국물(LB) 배지 1mL를 첨가하고 형질전환된 박테리아를 써모셰이커(250-500rpm)에서 37°C에서 1시간 동안 배양하여 항생제 내성 유전자의 표현형 발현을 허용합니다.
   참고: 1L LB 배지를 준비하려면 효모 추출물 5g, 트립톤 10g, NaCl 10g을 넣고 물로 부피를 채우고 오토클레이브로 멸균합니다.
6. 11,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화하고 펠릿을 100μL의 신선한 LB 배지에 재현탁합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합하십시오.
7. 부유 박테리아를 적절한 항생제(예: 50 μg/mL 카나마이신, BirA와 공동 형질전환된 경우 50 μg/mL 카르베니실린도 포함, 단계 1.2 참조)를 포함하는 예열된 LB 플레이트에 도금합니다.
8. 항생제가 보충된 LB 플레이트를 37°C에서 거꾸로 13-15시간 동안 배양합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 콜로니가 성장한 플레이트는 4°C에서 보관할 수 있으며 건조를 방지하기 위해 투과성 필름으로 밀봉할 수 있습니다.

2. 세균 액체 배양 및 VHH-mCherry 발현 유도

1. 형질전환 플레이트에서 단일 박테리아 콜로니를 선택하고 항생제가 보충된 20mL의 LB 배지가 들어 있는 삼각 플라스크에 접종합니다. 37°C에서 13-15시간 동안 진탕 인큐베이터에서 배양합니다(항생제 선택에 관한 단계 1.7 참조).
2. 다음날, 하룻밤 동안 20mL 박테리아 배양액을 해당 선택 항생제와 함께 1L의 LB 배지가 들어 있는 신선한 플라스크에 희석합니다.
3. 배양액이 600nm(OD₆₀₀)에서 0.6-0.7의 광학 밀도에 도달할 때까지 37°C에서 계속 배양합니다.
   참고: 단백질 발현을 유도하기 전에 배양액을 RT 또는 16°C로 냉각시키십시오.
4. 1 mL의 1 M 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 VHH-mCherry(및 BirA, 공동 발현된 경우)의 발현을 유도하여 유도제의 최종 농도(1:1000 희석)를 달성합니다. BirA 발현 플라스미드와의 공동 형질전환이 수행된 경우, 또한 배양액에 20mM D-비오틴 스톡 용액 10mL를 보충하여 성장 배지에서 200μM D-비오틴의 최종 농도를 산출합니다. 이것은 VHH-mCherry 구조에 존재하는 비오틴 수용체(BAP) 에피토프의 생체 내 비오티닐화를 촉진합니다.
   참고: D-비오틴 스톡을 ddH₂O에서 제조하고 500 mM NaH₂PO₄를 점진적으로 첨가하여 가용화합니다.
5. 최적의 단백질 접힘 및 수율을 촉진하기 위해 IPTG 유도 1L 배양액을 16°C에서 13-15시간 동안 배양합니다.
   참고: 다른 형광 태그가 있는 새로 설계된 나노바디 구조물의 발현 조건은 연구자의 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다.
6. 배양액을 1L 원심분리 병으로 옮기고 4°C에서 5,000 x g 에서 45분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상청액을 적절한 액체 생물폐기물에 버리고 정제 단계를 진행합니다.
   참고: 이 시점에서 박테리아 펠릿을 -80°C에서 보관하여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. VHH-mCherry 펠릿은 일반적으로 분홍색으로 나타나며 이는 형광 융합 단백질의 적절한 접힘을 나타냅니다.

3. VHH-mCherry의 IMAC 기반 정제

1. 필요한 경우 얼음 위에서 냉동 박테리아 펠릿을 해동합니다(2.6단계 참조).
2. 박테리아 세포 펠릿에 얼음처럼 차가운 결합 완충액 30mL(1x PBS에 20mM 이미다졸)를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 완전히 재현탁합니다. 현탁액을 라벨이 부착된 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
3. 재현탁된 세포에 200 μg/mL 리소자임, 20 μg/mL DNase I, 1 mM MgCl₂ 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 보충합니다. 혼합물을 RT에서 10분 동안 배양한 다음 종단 간 회전기에서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: PMSF는 독성이 있습니다. 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 착용한 화학 연기 후드에서 원액을 준비하고 취급합니다. PMSF 함유 폐기물은 할로겐화 유기 폐기물 용기에 폐기하십시오. 실험을 위해 0.1M 원액을 사용하고 추가로 희석했습니다.
4. 현탁액에 직접 삽입 된 팁 초음파 처리기를 사용하여 박테리아 세포를 기계적으로 파괴합니다. 일정한 3 개의 1 분 초음파 처리 펄스를 적용하여 지정된 초음파 발생기 설정으로 각 펄스 사이에 1 분의 냉각 간격을 허용합니다 (프로브 팁 크기 : 6mm, 단단한 팁; 진폭 40%; 듀티 사이클(펄스 모드): 1초 ON/1초 OFF)
5. 4°C에서 15,000 x g 에서 45분 동안 원심분리하여 용해물을 정화하여 박테리아 세포 파편과 온전한 박테리아를 펠릿화합니다.
   참고: 용해물은 원심분리기 병으로 옮기거나 벤치탑 원심분리를 위해 5mL 튜브에 분취할 수 있습니다.
6. 생성된 상청액을 새 50mL 튜브로 조심스럽게 옮기고 펠릿을 적절한 생물학적 폐기물에 버립니다.
7. 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 준비하는 동안 투명화된 용해물을 얼음 위에 보관합니다. 히스티딘 태그가 부착된 나노바디를 분리하려면 중력 흐름 작동에 최적화된 사전 포장된 일회용 His-tag 정제 컬럼을 활용하십시오.
8. Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 컬럼을 금속 스탠드 또는 적절한 컬럼 홀더에 고정합니다.
   1. 컬럼에서 저장 완충액을 배출하고 10mL의 결합 완충액(1x PBS에 20mM 이미다졸)으로 평형을 이룹니다.
   2. 버퍼가 중력에 의해 통과하도록 하십시오. 유입되는 것을 바이오 폐기물로 폐기하십시오.
9. 제거된 박테리아 용해물(~30mL)을 컬럼에 점차적으로 도포합니다. 중력에 의해 흐르게 하고 흐르는 것을 버리십시오.
10. 2회 연속 10mL 부피의 결합 완충액(1x PBS에 20mM 이미다졸)으로 컬럼을 세척합니다.
11. 2mL의 용출 완충액(1x PBS에 500mM 이미다졸)을 사용하여 결합된 나노바디를 2mL 미세 원심분리기 튜브에 용리합니다.
12. 버퍼 교환을 수행합니다.
    1. 50mL 튜브 어댑터에 놓인 탈염 컬럼을 5mL의 1x PBS로 5회 헹구어 평형을 맞춥니다.
    2. 완충액이 포장된 수지에 완전히 들어가도록 합니다. 플로우스루를 버립니다. 최종 PBS 세척 후, 컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
    3. 플로우스루를 버립니다. 어댑터가 있는 컬럼을 새 50mL 튜브에 놓습니다. 용출된 기능화 나노바디 2mL(단계 3.11에서)를 PBS 평형 탈염 컬럼에 로드하고 1,000 x g 에서 2분 동안 회전시킨 후 용출액을 수집합니다.
       참고: 투석은 완충액 교환을 위해 대안적으로 사용될 수 있습니다.
13. 제조업체의 프로토콜에 따라 비신코닌산(BCA) 또는 Bradford 분석을 사용하여 정제된 VHH-mCherry 단백질의 농도를 정량화합니다.
    참고: 살아있는 세포 이미징 응용 분야에서 효율적인 나노바디 흡수를 위해 5-10 mg/mL의 최종 스톡 농도가 권장됩니다.

4. VHH-mCherry 발현 및 순도 검증(쿠마시 염색)

1. 확립된 실험실 프로토콜에 따라 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)을 준비합니다.
   참고: 대안으로 편의성과 재현성을 위해 Bio-Rad의 상업적으로 이용 가능한 프리캐스트 그래디언트 젤을 사용할 수 있습니다.
2. 정제된 VHH-mCherry 20μg을 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취하고 95°C에서 5분 동안 시료 완충액에서 끓여 변성시킵니다.
3. 변성된 나노바디 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 추적 염료(예: 브로모페놀 블루)가 분해 겔의 바닥에 도달할 때까지 표준 PAGE 절차에 따라 전기영동을 수행합니다.
4. 쿠마시 염색 및 젤 탈색을 진행합니다.
   1. 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하고 쿠마시 염색 용액(10% 아세트산 및 ddH₂O에 45% 메탄올이 함유된 10g/L 쿠마시 브릴리언트 블루 스톡 5%)에 부드럽게 흔들리는 플랫폼에서 RT에서 20-30분 동안 담급니다. 젤이 염색 용액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.
   2. 탈색 용액(ddH₂O의 7.5% 아세트산 및 15% 메탄올)을 사용하여 겔을 염색하고 RT에서 각각 1시간씩 2-3회 순차적 세척을 수행합니다. 최적의 배경 감소를 위해 젤을 신선한 탈색 용액에 13-15시간 동안 그대로 두십시오.
      참고: 과도한 염료는 탈색 과정에서 젤 주위에 가정용 종이 타월을 놓으면 효과적으로 흡수될 수 있습니다. 염색/탈색 용액에는 가연성 메탄올과 자극성 아세트산이 포함되어 있습니다. 연기에서 사용하고, 장갑과 고글을 착용하고, 지정된 가연성 액체 폐기물 용기에 사용한 용액을 수거하십시오.
5. 선택한 겔 문서화 시스템 또는 카메라를 사용하여 겔을 시각화합니다.
   참고: 나노바디 발현의 추가 확인을 위해 에피토프 특이적 항체를 사용한 면역블로팅을 수행할 수 있습니다( 그림 1C 참조).

5. 레트로바이러스 형질도입을 이용한 GFP 태그 리포터 HeLa 세포주 생성

참고: 다양한 GFP 리포터 HeLa α 교토 세포주(여기서는 간단히 HeLa 또는 HeLa α라고 함)가 이전에 생성되었습니다¹⁷. 살아있는 세포 이미징 분석을 시연하기 위해 대표적인 화물 단백질로서 GFP 태그 CDMPR 또는 TfR이 사용됩니다. 유형 I 토폴로지를 가진 TM 단백질은 극단적인 N-말단에서 GFP 태그가 있는 반면, 유형 II 토폴로지를 가진 TM 단백질은 C-말단 GFP 융합이 필요합니다.

1. EGFP-CDMPR(Addgene #182642) 또는 TfR-EGFP(#243763)를 암호화하는 유전자는 이전에 표준 제한 효소 클로닝 기술을 사용하여 레트로바이러스 벡터 pQCXIP에 서브클로닝되었습니다¹⁷. 화학 적격 대장균으로 형질전환한 후, 미디 프렙 키트(예: Macherey-Nagel)를 사용하여 고순도 플라스미드 DNA를 준비합니다.
   참고: 화학 적격 박테리아 세포는 표준 실험실 프로토콜에 따라 준비해야 합니다. NEB 5-알파 NEB의 유능 한 대장균 은 클로닝 및 플라스미드 정제에 사용할 수 있습니다.
2. 안정적인 GFP 리포터 HeLa 세포주를 생성하기 위해 패키징 세포주 Phoenix ampho의 형질감염에 의해 레트로바이러스 입자가 생성됩니다. 모든 세포 배양 작업은 BSL2 층류 조건에서 수행됩니다.
   1. 형질감염 전날, 2.0-3.0 x 10⁶ 피닉스 암포 세포를 10mL의 배지에 10cm 접시에 시딩하여 다음날까지 60%-80% 컨플루언트를 달성합니다. 피닉스 암포는 10% 소 태아 혈청(FBS), 100단위/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 1mM 피루브산나트륨과 함께 DMEM 고포도당 GlutaMAX-I에서 유지됩니다.
   2. 형질감염 당일, 배지를 10mL의 신선한 완전 배지로 교체합니다.
   3. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 혈청 및 보충제가 없는 DMEM 고포도당 GlutaMAX-I 1mL와 pQCXIP-EGFP-CDMPR 또는 pQCXIP-TfR-EGFP 10μg 및 FuGENE HD 형질감염 시약 30μL를 결합합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합하십시오.
   4. 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양하여 DNA-시약 복합체를 형성합니다.
   5. 전체 형질감염 혼합물을 Phoenix 암포 배양액에 적가합니다. 접시를 부드럽게 휘젓어 복합체가 고르게 분포되도록 합니다.
   6. 형질감염된 Phoenix ampho 세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 13-15시간 동안 배양합니다.
      참고: Retro-X Q 벡터 시스템과 호환되는 경우 대체 패키징 세포주를 사용할 수 있습니다.
3. 다음날 형질감염 배지를 폐기하고 바이러스 생산을 향상시키기 위해 7mL의 신선한 완전 배지로 교체합니다.
4. 형질감염 후 48시간 및 선택적으로 72시간에, 피펫 보조기를 사용하여 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청액(~7mL)을 수집합니다. 형광 현미경 또는 이미징 시스템(예: Bio-Rad ZOE)을 사용하여 형질감염된 Phoenix 암포 세포에서 GFP 발현을 모니터링합니다.
   참고: 다시 말하지만, 레트로바이러스 조작에는 BSL-2 봉쇄가 필요합니다. 인증된 생물안전 캐비닛에서 모든 작업을 수행하고, 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 착용하고, 오토클레이브를 통해 폐기물을 처리하기 전에 1% 헥사쿼트와 70% 에탄올로 표면의 오염을 제거합니다.
5. 수집된 바이러스 상청액을 0.45μm 크기의 필터를 통해 여과합니다. 여과된 상청액은 즉시 사용하거나(단계 5.7 참조) 단기 사용을 위해 4°C, 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 냉동 시 바이러스 역가가 감소할 수 있습니다.
6. 안정적인 GFP 리포터 HeLa 세포를 확립하기 위해, 여과된 바이러스 상청액을 사용하여 레트로바이러스 형질도입을 진행한다. 모든 절차는 BSL2 조건에서 수행되어야 합니다.
   1. 형질도입 하루 전, 10mL의 배지와 함께 10cm 접시에 약 2.0-3.0 x 10⁶ HeLa α 세포를 시딩하여 다음날까지 60%-80% 컨플루언션에 도달합니다. 배양 HeLa α 세포는 10% FBS 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 고포도당 GlutaMAX-I에서 배양됩니다.
   2. 여과된 바이러스 상청액을 15μg/mL 폴리브렌(헥사디메트린 브로마이드)과 혼합하여 감염 효율을 높입니다.
      참고: 폴리브렌은 자극제입니다 - 스톡 준비 중에 장갑과 보안경으로 다루고, 에어로졸 형성을 피하고, 폴리브렌 함유 용액을 유해 화학 폐기물로 폐기하십시오.
   3. 다음날 표준 성장 배지를 폴리브렌이 함유된 희석되지 않은 바이러스 상청액으로 교체하여 접시 전체 표면을 덮습니다.
   4. 형질도입 중인 HeLa α 세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 13-15시간 동안 배양합니다.
      참고: 바이러스 역가를 결정하기 위해 HeLa α 세포에 대한 연속 희석 및 감염 분석을 수행할 수 있습니다. 이 경우 역가는 레트로바이러스가 분열하는 세포만 감염시키기 때문에 선택사항입니다.
7. 형질도입 다음날, 바이러스 배지를 BSL2 폐기물로 버리고 10mL의 신선한 완전 HeLa α 배지로 교체합니다. 5% CO₂와 함께 37°C에서 13-15시간 동안 배양합니다.
8. 다음날, 배지를 1.5μg/mL 퓨로마이신을 함유한 완전 배지로 교체하여 선택을 시작합니다.
9. 2-3주 동안 선택 압력을 유지하고 필요에 따라 세포를 계대합니다. 유전자 변형 세포를 BSL1 환경으로 옮기기 전에 복제 능력이 있는 바이러스 입자가 없는지 확인하십시오.
10. 균질한 집단을 얻으려면 클로닝 링 또는 실린더를 사용한 클론 분리 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용합니다. FACS는 형α 강도를 기반으로 균일한 GFP 발현을 가진 집단을 농축하기 위해 FACSAria III 또는 Fusion(BD Biosciences)을 사용하여 형질도입된 HeLa 세포에서 수행할 수 있습니다.
    참고: HeLa α 세포에서 GFP 리포터의 발현은 고정 세포 형광 현미경 또는 항-GFP 항체를 사용한 면역블로팅에 의해 추가로 검증될 수 있습니다( 그림 2C 참조).

6. 살아있는 세포 이미징을 위한 배양 세포에 의한 VHH-mCherry 흡수

참고: 모든 세포 배양 절차는 살아있는 세포 현미경 검사 전에 층류 후드 내의 멸균 조건에서 수행됩니다.

1. 6.1멸균 층류 하에서 GFP 태그 CDMPR 또는 TfR 리포터 구조물을 안정적으로 발현하는 약 50,000 내지 110,000개의 HeLa 세포를 μ-슬라이드 4-웰 ibiTreat 챔버 슬라이드의 각 웰에 시드합니다. 10% FBS, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM l-글루타민 및 1.5 μg/mL 퓨로마이신이 보충된 항생제(DMEM 고포도당, 페놀 레드 프리)가 함유된 완전 배양 배지 700μL를 사용합니다.
2. 적절한 접착 및 증식을 허용하기 위해 5% CO₂ 가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 13-15시간 동안 세포를 배양합니다. 세포는 다음날까지 약 80% 합류에 도달해야 합니다.
3. 이미징 당일, 실험 직전에 각 웰의 배지를 350μL의 신선한 페놀 레드 프리 완전 배지로 부드럽게 교체합니다.
4. 병행하여 예열된 페놀 레드가 없는 배지에서 최종 농도 2.5μg/mL(약 50nM)의 VHH-mCherry 작업 용액을 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 37°C로 유지하십시오.
5. 자동 라이브 셀 이미징 시스템(예: FEI MORE 또는 Nikon Ti2 X-Light V3)을 초기화한 후 현미경의 배양 챔버를 5% CO₂ 로 37°C로 예열한 후 ibidi 현미경 챔버를 현미경으로 옮기고 다음과 같이 획득 설정을 구성합니다.
   1. U PlanS Apo 100x NA 1.4를 선택하고 현미경 스테이지에 ibidi 현미경 챔버를 추가합니다.
   2. EGFP(예: 470/20 nm, em: 517/20 nm) 및 mCherry(예: 550/15 nm, em: 590/20 nm)에 적합한 여기 파장과 단일 대역 통과 방출 필터로 두 개의 채널을 설정합니다.
   3. 광표백을 피하기 위해 짧은 노출 시간과 낮은 조명 강도를 선택하십시오(예: EGFP의 경우 50ms 및 5% 전력, mCherry의 경우 160ms 및 25%). 선택한 값은 모든 실험에서 일정하게 유지되는 것이 중요합니다.
   4. 조건(=well)에 따라 포인트 목록에 3-4개의 셀에 초점이 맞춰진 10개의 서로 다른 시야의 좌표를 저장합니다.
   5. 단일 스냅샷으로 이 포인트 목록의 모든 위치를 한 번 이미지화합니다. VHH-mCherry 추가 전의 참조 이미지입니다.
   6. 엔도사이틱 흡수를 시작하려면 예열된 VHH-mCherry 용액 350μL를 각 웰에 부드럽게 첨가하여 세포 단층에 대한 교란을 최소화합니다. 5% CO₂와 함께 37°C에서 배양을 계속합니다.
   7. 5% CO₂로 37°C에서 프레임 사이에 36초 지연으로 100프레임에 대한 타임랩스 실험에서 포인트 목록의 모든 포인트를 반복적으로 이미지화합니다.
   8. 광표백을 줄이려면 먼저 mCherry를 이미지화한 다음 EGFP를 이미지화하기 위해 채널 획득을 명령합니다.
   9. 처리량을 늘리려면 먼저 모든 위치를 순차적으로 획득하도록 수집을 주문하고 각 시점에 대해 이 작업을 반복합니다.

7. VHH-mCherry 엔도사이틱 흡수의 이미지 분석

1. 피지에서 획득 후 이미지 전처리 및 데이터 추출.
   1. 분할 채널 옵션이 활성화된 Bio-Formats 임포터 플러그인을 사용하여 타임랩스 이미지를 로드합니다.
   2. MultiStackReg 플러그인을 사용하여 측면 드리프트를 수정합니다. EGFP 채널을 참조로 사용하고 변환을 mCherry 채널에도 적용합니다.
   3. 셀당 다각형 도구를 사용하여 관심 영역(ROI)을 그리고 ROI 관리자에 추가합니다.
   4. 두 채널 모두에 대해 ROI 관리자의 다중 측정 기능을 사용하여 모든 ROI 및 시점의 평균 강도를 측정하고 결과 테이블을 텍스트 파일로 저장합니다.
   5. 해당 참조 이미지를 열고 각 ROI에 대해 측정을 반복합니다.
2. 엔도사이틱 흡수 곡선을 결정하기 위한 데이터 분석
   1. 텍스트 파일을 열고 각 프레임 번호에 1을 빼서 0에서 시작하도록 한 다음 각 프레임 번호에 프레임 사이의 지연(즉, 36)을 곱합니다.
   2. 각 ROI에 대해 VHH-mCherry 채널의 해당 타임랩스 이미지의 각 프레임에서 참조 이미지의 VHH-mCherry 채널의 평균 강도를 빼서 자가형광과 배경을 제거합니다.
   3. 각 프레임 및 ROI에 대해 배경에서 뺀 VHH-mCherry 강도를 EGFP 채널 평균 강도로 나누어 VHH-mCherry 이외의 ROI 내의 강도 변동(예: 골지체 이동, 세포 수축, z-드리프트 또는 조명 불안정성)을 설명합니다.
   4. 결과 곡선을 자체 최대값으로 정규화합니다.
   5. 타임랩스의 시작(예: 미디어 추가) 또는 끝(예: 드리프트, 표백)에서 아티팩트를 제외할 프레임 범위를 선택합니다.
   6. 1차 동역학 과정을 모델링하는 단일 지수 감쇠 함수로 곡선 데이터를 적합시킵니다.
      
      여기서 I(t)는 시간 t의 정규화된 강도이고 t₀ 은 VHH-mCherry 추가와 기록 시작 사이의 시간 지연을 설명합니다. 속도 상수 k에서 공정의 반감기 τ_1/2 을 다음과 같이 계산합니다.
      
      참고: 시점당 여러 개의 후속 이미지 시야(FOV)로 실험을 수행할 때 각 해당 t0은 약간 다를 수 있지만 한 FOV에서 다음 FOV로 더 높은 값으로 증가해야 합니다.
   7. 모든 데이터 세트에 대해 절차를 반복하고 상자 그림에 반감기 값을 보고합니다.

결과

다양한 세포 내 구획으로의 역행성 단백질 트래피킹을 조사하기 위해 우리는 최근 세포 표면에서 재조합 융합 단백질을 표지하고 추적하기 위한 항-GFP 나노바디 기반 도구를 확립했습니다¹⁷. 여기에서 우리는 이러한 유도체화된 나노바디의 박테리아 생산을 설명하고 살아있는 세포 이미징에 의한 엔도사이틱 흡수를 모니터링하는 데 있어 유용성을 입증합니다. 골지체 상주 형광 리포터와 함께 이 프로토콜은 선택된 화물 단백질의 트랜스 골지체 네트워크(TGN)로의 역행 수송을 실시간으로 정량적으로 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.

우리는 표준 분자 복제 기술을 사용하여 공통 모듈식 아키텍처를 공유하는 뚜렷한 기능화된 항-GFP 나노바디 모음을 생성했습니다¹⁷. 현재 연구는 형광 변이체 VHH-mCherry에 초점을 맞추고 있지만, 이 도구 세트의 다양성을 설명하고 향후 응용 분야의 잠재력을 강조하기 위해 추가 유도체화된 나노바디도 포함합니다. 당사의 가장 기본적인 구조인 VHH-std(표준의 경우 표준)는 VHH 도메인, 항체 기반 검출을 위한 T7 및 HA 에피토프, 정제를 위한 C-말단 헥사히스티딘(His₆) 태그, 효소 비오티닐화 및 고친화성 스트렙타비딘 기반 풀다운 분석을 가능하게 하는 비오틴 수용체 펩타이드(BAP) 서열로 구성됩니다(그림 1A). 이 핵심 설계에서 생화학적 분석, 고정 및 살아있는 세포 이미징, 전자 현미경을 통해 엔도사이틱 및 역행 트래피킹의 연구를 용이하게 하기 위해 다양한 나노바디 유도체가 개발되었습니다.

엔도사이틱 수송의 생세포 이미징을 위해 GFP와 구별되는 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 형광단을 통합하는 형광 항-GFP 나노바디를 설계하여 형광 현미경 검사 중 최적의 스펙트럼 분리를 보장했습니다. IPTG 유도 대장균 의 우수한 접힘 특성과 잘 특성화된 광물리학적 특성을 기반으로 mCherry를 형광 태그로 선택했습니다. 단량체 적색 형광 단백질(mRFP)과 같은 다른 적색편이 형광단도 원칙적으로 적합한 대안이 될 수 있지만 mCherry는 이 시스템에서 특히 견고하고 효과적인 것으로 입증되었습니다.

VHH-mCherry보다 다른 기능화된 나노바디의 잠재력은 무엇입니까? 원형질막에서 트랜스골지체(TGN)로의 단백질 트래피킹을 조사하기 위해 우리는 TGN과 트랜스골지수조에만 존재하는 TPST의 구획 특이적 국소화를 활용했습니다. 이를 위해 우리는 쥐 프로콜레시스토키닌²⁹에서 파생된 탠덤 티로신 황산화 모티프(2xTS)로 VHH-std를 수정하여 이러한 구획에 도착하는 화물의 생화학적 판독을 가능하게 했습니다. VHH-std와 mCherry의 융합은 고정 또는 살아있는 세포 이미징에 의한 역행 수송의 직접적인 시각화를 허용하는 반면, APEX2³⁰ 과 같은 과산화효소를 사용한 기능화는 전자 현미경, 표적 세포화학적 절제 또는 근접 기반 비오티닐화 분석에 의한 미세구조 국소화를 허용합니다. 또한, 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위를 나노바디 스캐폴드에 통합하면 내재화된 나노바디와 표면 결합 나노바디를 구별할 수 있는 생화학적 수단이 제공됩니다(그림 1A). 우리는 이전에 나노바디 결합 EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP¹⁷의 재활용 동역학을 모니터링하기 위해 VHH-tev 구조물을 사용했습니다. 세포 표면에서 나노바디 태그 수용체의 재출현은 재조합 TEV 프로테아제를 세포외에 적용함으로써 쉽게 감지할 수 있으며, 그 결과 나노바디의 C-말단 에피토프 카세트가 특이적으로 손실됩니다. 유사하게, 여기에 제시된 mCherry 기능화된 나노바디 VHH-mCherry 내에 TEV 절단 부위를 포함하면 살아있는 세포 이미징에 의한 EGFP 리포터 재활용의 동적 평가가 가능합니다. 추가 형광단, 효소 태그 또는 번역 후 변형을 위한 서열 모티프와 같은 대체 단백질 도메인을 사용한 기능화는 SpeI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 원하는 삽입물을 VHH-std 백본에 서브클로닝하여 쉽게 달성할 수 있습니다. 원래 연구¹⁷ 에서 사용된 모든 기능화된 항-GFP 나노바디 구조물은 공개 배포를 위해 Addgene과 함께 기탁되었습니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 모든 나노바디 변이체를 높은 수율 및 순도로 정제했습니다(그림 1B). mCherry 융합만이 정제 후 단백질 도메인의 경미한 단백질 분해 클리핑을 나타냈습니다(그림 1B, 레인 5). 관찰된 두 가지 분해 생성물은 겉보기 분자량에서 추론되고 에피토프 특이적 면역블롯 검출에 의해 검증된 바와 같이 개별 VHH 및 mCherry 도메인에 해당할 가능성이 가장 높습니다(그림 1C). 공동 발현된 BirA가 없는 경우, VHH-mCherry는 일반적으로 제제당 약 20mg의 수율로 회수되었습니다. 우리의 경험에 따르면, BirA의 공동 발현은 나노바디 수율을 약 1/^{3에서 1} /2로 지속적으로 감소시킵니다. BSA와의 1:1 혼합물에서 나노바디가 스트렙타비딘-아가로스에 의해 완전히 회수되었기 때문에 비오티닐화는 상당히 완전했습니다(그림 1D).

엔도사이틱 수송 연구를 위한 이 나노바디 툴킷의 적합성을 평가하기 위해 우리는 뚜렷한 세포내 트래피킹 경로를 가진 EGFP 태그 표면 수용체 단백질을 발현하는 안정적인 HeLa 세포주를 생성했습니다. 여기에는 원형질막과 초기(분류 및 재활용) 엔도좀 사이를 순환하는 TfR이 포함되었습니다. 초기 엔도좀에 의해 원형질막과 TGN 사이를 이동하는 TGN46; TGN, 원형질막, 초기 및 후기 엔도좀 사이를 왕복하는 두 MPR¹⁷. EGFP는 각 수용체의 세포외 도메인(특히 CDMPR, CIMPR 및 TGN46에 대한 신호 펩타이드와 수용체 서열 사이에 삽입됨)과 TfR의 C-말단에 융합되었습니다. 이 설계는 천연 세포질 도메인을 보존하여 알려진 모든 분류 신호가 손상되지 않고 세포외 항-GFP 나노바디에 의해 결합하기 위해 EGFP 태그에 접근할 수 있도록 했습니다(그림 1E). 세포외 도메인이 비정상적으로 큰 CIMPR의 경우, 이러한 절단이 정상적인 인체이동 행동을 보존한다는 것을 입증하는 이전 연구와 일치하는 잘린 버전이 사용되었습니다^31,32.

안정적인 세포주는 레트로바이러스 형질도입에 의해 확립되었으며, 이어서 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 중간 및 유사한 발현 수준을 가진 균질한 세포 집단을 분리했습니다. 주목할 점은 EGFP-CDMPR이 이질적인 글리코실화를 나타내는 내인성 대응물⁽³³)과 유사하게 면역블롯에서 이중 밴드로 일관되게 나타났다는 것입니다. EGFP 융합 단백질이 내인성 단백질의 정상 상태 국소화 및 발현 패턴을 요약하는지 여부를 평가하기 위해 안정적으로 발현되는 세포를 부모 HeLa 세포와 공동 배양하고 공초점 형광 현미경으로 분석했습니다(그림 2B). EGFP 신호는 해당 내인성 단백질의 분포를 충실하게 반영했습니다. 예상대로 CDMPR, CIMPR 및 EGFP 태그 버전은 말초 엔도좀에 추가 라벨링과 함께 TGN 및 후기 엔도좀 구획을 반영하는 핵주위 영역에 주로 국한되었습니다. 내인성 및 EGFP 태그가 부착된 TGN46은 모두 핵주위 TGN에서 거의 독점적으로 발견된 반면, TfR 및 TfR-EGFP는 두드러진 말초 분류 및 핵주위 재활용 엔도좀과 함께 특징적인 초기 엔도좀 분포를 나타냈습니다. 사용된 항체는 내인성 및 EGFP 태그 형태(CIMPR 제외)를 모두 검출했지만, 융합 단백질을 발현하는 세포에서 전체 염색 강도는 현저하게 증가하지 않았으며, 이는 EGFP 구조가 실질적으로 과발현되지 않았음을 시사합니다. EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP와의 직접적인 비교를 위해 그림 2B에 EGFP-TGN46 및 EGFP-CIMPR을 포함시켰습니다. 세포 고정 및 형광 현미경 이미징에 사용되는 프로토콜은 이전 연구^17,19에 설명되어 있습니다.

VHH-mCherry를 사용하여 EGFP 태그 리포터 단백질의 엔도사이틱 수송을 살아있는 세포 이미징으로 모니터링할 수 있습니다. 이를 위해 EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP를 발현하는 세포를 예로 사용하였다. 세포는 배지에 VHH-mCherry를 첨가한 후 도립 광시야 형광 현미경으로 시간이 지남에 따라 이미지화되었습니다(비디오 1 및 비디오 2). 다양한 시점의 정지 이미지가 그림 3에 나와 있습니다. mCherry 채널의 신호를 측정하고, 자가형광 배경을 빼고, EGFP 신호로 정규화하여 표지된 구획의 이동 또는 초점면의 잠재적인 작은 이동으로 인한 변동을 제거함으로써 흡수를 정량화했습니다. 25nM에서 배지에서 VHH-mCherry의 형광은 무시할 수 있었고 측정을 방해하지 않았습니다. 세포 표면에서 세포내 구획으로, 정상 상태 분포로의 리포터의 수송을 분석한 결과, 이전 간행물¹⁷의 그림 2에 나타난 생화학적 실험과 동일한 동역학 결과가 나타났으며, 겉보기 흡수 반감기는 EGFP-CDMPR의 경우 ~9분, TfR-EGFP의 경우 ~4분, 포화 후 ~43분 및 ~20분, 각각. 이러한 값은 면역블로팅 분석법을 사용한 생화학적 흡수 실험에서 얻은 값과 비슷했습니다¹⁷. 원칙적으로, MPR 농도가 가장 높은 핵주위 영역과 같은 관심 세포내 영역으로의 역행 수송 동역학도 분석할 수 있습니다. 그러나 핵주위 영역에는 골지체/TGN뿐만 아니라 후기 엔도좀과 재활용 엔도좀도 풍부합니다. 핵주위 영역으로의 나노바디 흡수 동역학은 정의된 소기관으로의 역행 수송을 분석하기에 충분히 특이적이지 않습니다. 원형질막에서 TGN으로의 수송을 보다 안정적으로 평가하기 위해서는 형광단 특성의 스펙트럼 중복이 없는 방식으로 또 다른 형광 단백질인 TGN 상주 막관통 단백질이 GFP 리포터 단백질과 함께 안정적으로 공동 발현되어야 합니다. 이 추가 마커를 사용하면 이전에 문서화된 바와 같이 TPST에 의해 매개되는 티로신 황산화와 유사한 리포터 수입 VHH-mCherry를 검출할 수 있습니다¹⁹.

그림 1: EGFP 태그 세포 표면 단백질을 추적하기 위한 유도체화된 나노바디의 설계 및 생산. (A) 유도체화된 나노바디의 개략적 개요. 표준 나노바디 구조물은 GFP 특이적 VHH 도메인, T7 및 HA 에피토프 태그, 비오틴 수용체 펩타이드(BAP) 및 정제를 위한 C-말단 헥사히스티딘(His₆) 태그로 구성됩니다. 추가 나노바디 변이체에는 탠덤 티로신 황산화 부위(2xTS), 조작된 과산화효소 APEX2 또는 형광 단백질 mCherry를 사용한 변형이 포함됩니다. 스케일 바는 아미노산(aa) 길이를 나타냅니다. (B) 박테리아 발현 및 친화성 정제된 나노바디(20-50μg)를 그래디언트 SDS-PAGE로 분석하고 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 분자량 표준(kDa)은 왼쪽에 표시되어 있습니다. 경미한 단백질 분해 클리핑은 VHH-mCherry에 대해서만 관찰되었으며, VHH와 mCherry 도메인 사이에서 발생할 가능성이 높습니다. (C) T7, HA 또는 His₆ 에피토프에 대한 항체를 사용하거나 비오티닐화 평가를 위해 스트렙타비딘-HRP(SA-HRP)에 의해 검출된 항체를 사용하여 나노바디 제제(10ng)의 면역블롯 분석. (D) 나노바디 비오티닐화의 정도는 나노바디를 BSA와 1:1 비율로 배양한 후 스트렙타비딘-아가로스 풀다운, 펠릿화 및 비드의 세척을 통해 평가하였다. 동일한 부피의 상청액(S)과 비드 결합 물질(B)을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석했습니다. 비드 결합 분획에서 나노바디의 정량적 회수율은 완전한 비오티닐화를 나타냅니다. 결합된 분획에 VHH 및 mCherry 단편이 모두 존재한다는 것은 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플 준비 중에 발생할 수 있는 부분 분해를 나타냅니다. 차선 2와 3 사이의 흰색 선은 관련 없는 두 차선이 삭제되었음을 나타냅니다. 이 수치는¹⁷에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 형광 표지된 EGFP 태그 화물 수용체의 발현 및 세포내 국소화. (A) EGFP 융합 구조체의 개략적 표현. 분비 막관통 단백질에서 파생된 서열은 검은색으로 표시되며, N-말단 신호 펩타이드와 내부 막관통 도메인은 노란색으로 강조 표시됩니다. EGFP 부분은 녹색으로 표시됩니다. CDMPR, TfR 및 TGN46에 대해 전체 길이 구조가 생성되었으며, 정상적인 인체매매 행동을 보존하기 위해 CIMPR에 잘 특성화된 잘린 변이체가 사용되었습니다. 스케일 바는 아미노산(aa) 길이를 나타냅니다. EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP는 이전에 기술되었습니다¹⁷. (B) 세포내 국소화를 평가하기 위해 EGFP 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 부모 HeLa 세포와 공동 배양하고 형광 현미경으로 분석했습니다. 스케일 바는 10μm를 나타냅니다. (C) EGFP-태그 리포터 단백질을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 용해하고, 단백질 추출물을 SDS-PAGE에 투여한 후 GFP 및 액틴에 대한 항체를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 분자량 마커(kDa)가 오른쪽에 표시됩니다. 이 수치는¹⁷에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP에 의해 매개되는 나노바디 엔도사이틱 흡수 동역학의 생세포 이미징. 37°C에서 페놀 적색이 없는 완전 배지에서 (A) EGFP-CDMPR 또는 (B) TfR-EGFP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포에 25nM VHH-mCherry를 첨가한 후 생세포 이미징을 수행했습니다. 세포는 36초 간격으로 반자동 광시야 형광 현미경을 사용하여 GFP 및 mCherry 채널에서 이미지화되었습니다. 대표적인 병합 정지 이미지가 아래 개별 채널에서 핵주위 영역(배율: 2.2x)의 확대 보기와 함께 표시됩니다. (스케일 바, 10μm.) 비디오 1 및 비디오 2도 참조하십시오. (C) EGFP-CDMPR 및 (D) TfR-EGFP에서 나노바디 흡수 동역학의 정량적 분석은 각각 약 40개의 개별 세포를 포착한 3개의 독립적인 실험의 데이터를 사용하여 수행되었습니다. 소기관 움직임과 초점면 변동성을 설명하기 위해 mCherry 형광 강도를 GFP 신호에 대해 정규화(표준)하고 세 실험의 모든 세포에서 평균 ± SD로 표시했습니다. 평균 최대 흡수 신호는 1로 정규화되었습니다. 각 세포에 대한 흡수 동역학은 1차 동역학 모델을 사용하여 개별적으로 적합되었습니다. 표시된 선은 해당 속도 상수의 평균에서 파생된 평균 곡선을 나타냅니다. 이 수치는¹⁷에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: EGFP-CDMPR에 의한 mCherry-나노바디 흡수의 생세포 이미징. EGFP-CDMPR을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 25 nM VHH-mCherry를 포함하는 완전 배지에서 37°C에서 배양하고 EGFP 및 mCherry 형광 채널 모두에서 36초 간격으로 이미지화했습니다. 동영상은 3분/초의 실시간 압축에 해당하는 5프레임/초의 재생 속도로 렌더링되었습니다. 이 영화는¹⁷에서 수정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: TfR-EGFP에 의한 mCherry-나노바디 흡수의 생세포 이미징. TfR-EGFP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 25 nM VHH-mCherry가 보충된 완전 배지에서 37°C에서 배양하고 36초 간격으로 EGFP 및 mCherry 형광에 대해 이미지화했습니다. 영화는 5프레임/초로 렌더링되었으며, 이는 3분/초의 타임랩스 속도를 나타냅니다. 이 영화는¹⁷에서 수정되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

나노바디는 기존의 항체에 비해 많은 이점을 제공하는 빠르게 부상하는 단백질 결합 스캐폴드 클래스를 나타냅니다: 작고, 매우 안정적이며, 단량체, 비가교성, 이황화 결합이 부족하고, 고친화성 결합을 위해 선택될 수 있습니다²⁴. 이전 연구에서 우리는 표면에 노출된 단백질을 표지하고 다양한 구획으로의 세포 내 수송을 모니터링하기 위해 박테리아 발현에 의해 생성된 기능화된 나노바디를 개발 및 적용했으며, 특히 트랜스골지체(TGN)로의 역행 수송에 중점을 두었습니다¹⁷. 우리는 다목적성을 보장하기 위해 항-GFP 나노바디를 활용하여 세포외 GFP, YFP 또는 mCerulean으로 태그된 융합 단백질(널리 이용 가능하고 종종 이미 특성화된 형광 태그)을 표적으로 삼을 수 있도록 했습니다. mCherry, APEX2 또는 티로신 황산화 모티프를 사용한 항-GFP 나노바디의 기능화를 통해 고정 및 살아있는 세포 이미징에 의한 화물 흡수를 시각화하고, 미세구조 수준에서 역행 수송 구획을 국소화하고, 표적 구획 절제를 수행하고, TGN에 대한 수송 동역학을 정량적으로 평가할 수 있었습니다. 이 접근법의 한 가지 한계는 기능화된 항-GFP 나노바디를 효과적으로 사용하기 전에 안정적인 과발현 또는 내인성 태깅에 의한 표적 세포주의 유전적 변형이 전제 조건이라는 것입니다. 그러나, 이 전략은 동물 면역화 또는 리보솜 또는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 합성 VHH 라이브러리로부터 시험관 내 선택을 통해 생성된 태그가 없는 내인성 표적 단백질에 대한 나노바디의 증가하는 레퍼토리에 쉽게 적응할 수 있습니다³⁴. 또한, mCherry, V5 또는 ALFA와 같은 일반적으로 사용되는 에피토프 태그를 표적으로 하는 나노바디가 최근 몇 년 동안 개발되었습니다 35,36,37. 특히, 우리는 최근 황산화 능력이 있는 항-mCherry 나노바디를 활용하여 빠른 기능 비활성화를 통해 GGA2 고갈된 HeLa 세포에서 CDMPR의 역행성 운송을 조사했습니다²⁸. 작은 에피토프 태그는 중요한 구조 도메인을 방해할 가능성이 적기 때문에 표적 단백질의 천연 형태와 기능을 보존할 수 있는 이점을 제공합니다. 이러한 소형 에피토프(예: ALFA, V5)를 인식하는 나노바디는 기능성 나노바디 툴킷에 원활하게 통합되어 엔도사이틱 및 역행성 트래피킹 메커니즘을 연구하는 데 유용성을 확장할 수 있습니다.

본 연구에서는 살아있는 세포 이미징 실험에서 VHH-mCherry의 적용을 시연합니다. EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP를 리포터 단백질로 사용하여 수용체 특이적 엔도사이틱 흡수와 정상 상태 분포로의 진행을 시각화할 수 있었습니다. 원형질막에서 각각의 세포내 구획으로의 이들 리포터의 매입에 대한 정량적 분석은 이전 연구의 그림 2에 제시된 생화학적 분석을 통해 얻은 것과 일치하는 동역학을 밝혔습니다¹⁷. 우리는 겉보기 반감기가 TfR-EGFP(~4분)보다 EGFP-CDMPR(~9분)에서 상당히 길며, 신호는 각각 약 43분과 20분 후에 포화된다는 것을 발견했습니다. 이러한 정량적 결과는 MPR 및 TfR 인신매매 역학에 대해 이전에 발표된 데이터와 잘 일치합니다 38,39,40. 특히, VHH-mCherry 구조는 수많은 Addgene 배포 요청에서 입증된 바와 같이 연구 커뮤니티로부터 상당한 관심을 끌었으며 이미 여러 독립 연구 28,41,42,43,44에서 성공적으로 구현되었습니다.

현미경 구성 또는 실험 요구 사항에 따라 mCherry 태그가 부착된 항-GFP 나노바디가 항상 최적의 것은 아닐 수 있습니다. 이러한 경우, 대체 형광단 또는 형광 단백질 변이체는 GFP 리포터 세포주와 함께 사용될 때 보다 적합한 스펙트럼 특성을 제공할 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 및 iRFP670(243764-68)을 포함한 다양한 범위의 형광 단백질을 통합하는 기능화된 나노바디 라이브러리를 구축했습니다. 이러한 추가 나노바디 구조는 Addgene을 통해 제공될 것입니다. 스펙트럼별로 구별되는 형광단을 사용하면 여기 신호와 방출 신호를 명확하게 분리할 수 있으므로 스펙트럼 중첩을 최소화하면서 최대 3개의 형광 채널에 대한 최적의 실시간 이미징이 가능합니다.

정상 상태로의 엔도사이틱 흡수를 모니터링하는 것은 간단해 보일 수 있지만, TGN으로의 단백질의 역행성 수송을 추적하는 것은 더 큰 실험적 과제를 제시합니다. VHH-mCherry 및 GFP 태그 리포터 단백질 외에도 시각화 및 정량화를 위해 추가 형광 또는 염료 접합 가능한 TGN 상주 마커가 필요합니다. 그러나 특정 골지체 상주 단백질은 세포 표면에 부분적인 누출을 나타내며, 이는 수송 기계 구성 요소의 실험적 조작에 의해 도입된 것과 같은 세포내 트래피킹 경로의 교란에 의해 더욱 악화될 수 있습니다. 예를 들어, TGN46은 특정 분비 화물의 TGN에서 세포 표면 수송을 매개하는 화물 수용체로서의 기능적 역할에도 불구하고 골지체 상주 마커로 일반적으로 사용됩니다^16,45. 유사하게, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 같은 글리코실트랜스퍼라제도 원형질막(⁴¹)에서 검출되었다. 이러한 단백질은 표면으로 순환할 수 있지만 우세한 정상 상태 국소화는 TGN 내에 남아 있습니다. 이러한 마커를 스펙트럼적으로 구별되는 형광 단백질 또는 염료 호환 태그(예: SNAP, Halo 등)로 태그하고 GFP 태그가 있는 막관통 리포터와 안정적으로 공동 발현하면 TGN 도착의 정량적 살아있는 세포 이미징이 가능해질 것입니다. 이것은 골지체 상주 융합 단백질에 해당하는 형광 채널 내에서 mCherry 신호의 축적을 기반으로 정량화하여 위에서 설명한 워크플로와 유사하게 측정할 수 있습니다. 고정 또는 살아있는 세포에서 역행성 트래피킹을 조사하기 위한 현재 전략은 종종 IgG 항체(예: CD8)^46,47와 결합된 키메라 수용체 구조에 의존합니다. 그러나 표면 표지 중 기존 IgG의 이원성으로 인한 가교의 고유한 위험은 표지된 단백질의 세포내 운명을 크게 변화시킬 수 있으며, 종종 엔도사이토시스 후 리소좀 분해로 방향을 전환할 수 있습니다^48,49. 대조적으로, 나노바디는 1가 특성과 1:1 결합 화학량론으로 인해 가교를 유도하지 않아 표적 단백질의 생리적 트래피킹 경로를 보존합니다. 이로 인해 나노바디 기반 접근 방식은 인공적인 라우팅 아티팩트를 도입하지 않고 실제 역행 수송 역학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

살아있는 세포 이미징을 위한 이 프로토콜의 최적 성능은 과도한 양으로 인해 배지 내 결합되지 않은 나노바디에서 배경 형광이 상승하기 때문에 나노바디 농도의 신중한 적정이 필요합니다. 또한, 정확한 정량적 비교를 보장하기 위해 적정 중에 GFP 리포터 세포주의 발현 수준의 차이를 고려해야 합니다. 나노바디 생산의 경우 대장균 의 저온 유도는 mCherry 도메인의 적절한 접힘을 촉진하는 데 중요합니다. 유도 온도가 높을수록 일반적으로 단백질이 잘못 접히거나 분해되므로 권장되지 않습니다.

이 프로토콜의 성공은 세 가지 주요 측면에 결정적으로 좌우됩니다: 첫째, 일관된 라벨링과 최소 배경을 보장하기 위한 기능성 나노바디 구조의 고수율 발현 및 순도; 둘째, 생리학적 트래피킹 경로를 요약하기 위해 세포 표면 국소화와 함께 GFP 태그 리포터 단백질을 안정적으로 발현하는 잘 특성화된 세포주의 사용; 셋째, 이미징 매개변수 및 스펙트럼 분리를 포함한 형광 현미경 설정의 최적 처리 및 구성으로 화물 운송 역학의 정확한 정량적 및 정성적 분석을 가능하게 합니다.

mCherry 태그가 부착된 항-GFP 나노바디의 사용을 중심으로 여기에 제시된 방법 및 프로토콜은 배양된 포유류 세포에서 세포 표면에서 엔도사이틱 구획까지 화물 단백질의 정량적 및 정성적 추적을 가능하게 합니다. 형광 표지된 골지체 상주 마커와 공동 발현될 때 이 접근법은 역행 수송 경로를 추가로 분석할 수 있습니다. 따라서 이 도구는 특정 리간드 또는 호환 가능한 단량체 결합 시약의 부재로 인해 이전에는 라벨링에 접근할 수 없었던 세포 표면 막관통 단백질 및 수용체의 세포내 트래피킹을 모니터링하는 강력한 전략을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항GFP 항체	시그마-올드리치	118144600001	제품은 시그마-알드리치에서 유통하지만, 제조는 로슈에서 담당합니다
100mm 세포 배양 접시	TPP	TPP93100
항액틴 항체	EMD 밀리포어	MAB1501
항-HA 항체	실험실에서	12CA5 하이브리도마로 만들어졌습니다
Anti-His6 항체	베틸 연구소	A190-114A
항-T7 항체	베틸 연구소	A190-117A
BL21(DE3) 유능&대장균	NEB	C2527H
염화칼슘 이하이드레이트	메르크 밀리포어	102382	멸균수에 녹임, 재고는 1M
카르베니실린 이나트륨 염	Applichem	A1491	멸균수에 녹인 경우, 스톡은 100 mg/mL입니다
쿠매시-R (브릴리언트 블루)	시그마-올드리치	B-0149
D-비오틴	시그마-올드리치	B4501	멸균 500 mM NaH2PO4 또는 DMSO에 용해됨
일회용 PD10 탈염 컬럼	GE 헬스케어	GE17-0851-01
DMEM 글루타맥스-I	써모피셔 사이언티브	61965026
DMEM, 고혈당, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음	써모피셔 사이언티브	31053028
DNase I	Applichem	A3778	멸균수에 녹아
둘벡코 인산염 완충 식염수(DPBS) 2+/Mg2+	시그마-올드리치	D8537
태아 소 혈청(FBS)	써모피셔 사이언티브	A5256701
필트로푸르 S, PES, 포렌그르&둠; ß e: 0.45 & 마이크로; m	사르스테트	83.1826
FuGENE HD 형질전환 시약	프로메가	E2311
유리 커버슬립 (No. 1.5H)	VWR	631-0153
염소 안티마우스 HRP	시그마-올드리치	A-0168
염소 안티-래빗 HRP	시그마-올드리치	A-0545
그의 버퍼 키트	키트비아	11003400
그의 GraviTrap 칼럼	키트비아	11003399
ibidi µ-슬라이드 4 잘, ibiTreat	80426-IBI	이비디
이소프로필-&베타;-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)	Applichem	A1008	멸균수에 녹임, 재고는 1M
카나마이신 황산염	Applichem	A1493	멸균수에 녹인 경우, 스톡은 100 mg/mL입니다
L-글루타민	Applichem	A3704
라이소자임	시그마-올드리치	18037059001	제품은 시그마-알드리치에서 유통하지만, 제조는 로슈에서 담당합니다
육수화마그네슘 클로라이드	메르크 밀리포어	105833	멸균수에 녹임, 재고는 1M
미니-프로티언 TGX 젤, 4-20%, 15웰	바이오-래드	4561096
수정된 헬라 교토	실험실에서
NEB5-alpha 유능  대장균	NEB	C2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 준비	마셰리-나겔	740412.1
페니실린/스트렙토마이신	바이오콘셉트	4-01F00-H
페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)	Applichem	A0999.0025	40% DMSO 60% 이소프로판올에 용해, 500 mM 스톡
피닉스 암포 세포주	놀란 연구소
폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드)	시그마-올드리치	H9268
푸로마이신	인비보젠	앤트-PR-1
염화나트륨과 nbsp;	메르크 밀리포어	106404	멸균수에 녹은 상태, 재고는 5M
나트륨 피루브산	써모피셔 사이언티브	11360039
트랜스-블롯 터보 팩, 미니	바이오-래드	1704158
트립톤	Applichem	A1553
효모 추출물	Applichem	A1552