방법 논문

자유롭게 움직이는 마우스의 만성 다중 사이트 뇌파 기록을 위한 비용 효율적이고 최소 침습적 프로토콜

DOI:

10.3791/69314

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2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 2National Institute of Biotechnology, 3Department of Neuroscience and Regenerative Medicine, Medical College of Georgia at Augusta University, 4Department of Neurology, Medical College of Georgia at Augusta University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 설치류 EEG를 기록하기 위한 안정적이고 쉽게 접근할 수 있는 시스템을 만들기 위해 개발되었습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌파 검사(EEG)는 뇌의 전기적 활동을 추적하기 위한 기본 도구 역할을 하며 임상 진단과 전임상 동물 연구 모두에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 설치류 EEG는 인간의 신경 장애를 모델링하기 위한 강력한 플랫폼을 제공하지만, 장기 기록은 기존 시스템의 높은 비용, 침습성 또는 기술적 복잡성으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 여기에서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 만성, 다중 부위 피질 EEG 획득을 위한 신뢰할 수 있고 접근 가능하며 경제적으로 실행 가능하며 최소 침습 프로토콜을 제시합니다. 이 기술에는 뼈 나사를 사용하여 경막외로 고정되고 접착제와 치과용 시멘트로 고정되는 범용 직렬 버스(USB) 유형 인터페이스에 연결된 나사 전극이 있는 백금-이리듐 와이어를 제작하는 작업이 포함됩니다. 이 시스템은 85%의 수술 후 생존율(n = 20)을 보이는 야생형 C57BL/6J 마우스에서 입증된 바와 같이 몇 달 동안 안정적인 신호 캡처를 허용합니다. EEG는 1,000Hz에서 샘플링되었고 차동 증폭기 설정을 사용하여 1Hz에서 500Hz 사이에서 필터링되었습니다. 시스템을 검증하기 위해 펜티렌테트라졸(20mg/kg)을 투여하여 발작 유사 활동을 유도하여 발작 간 방전이 기준선에서 2-5회에서 주사 후 20-51회로 현저하게 증가했으며 신호 진폭 증가를 동반했습니다. 방전은 인식된 전기생리학적 기준과 일치하는 파형 형태 및 신호 특성을 기반으로 식별되었습니다. 이 설정은 행동 비디오 추적 및 오픈 소스 분석 파이프라인과 호환되며 약리학적, 유전적 또는 신경 조절 연구와의 통합을 지원합니다. 이 방법은 설치류 모델에서 뇌 네트워크 역학을 조사하기 위한 안정적이고 적응 가능한 플랫폼을 제공하며 간질 연구 및 그 이상에 적용됩니다.

서론

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뇌파 검사(EEG)는 뇌 전기적 활동을 직접 측정하며 간질 진단에 널리 사용됩니다1. 최근 몇 년 동안 EEG 기술은 신경 장애, 수면 생리학 및 뇌 네트워크 역학을 연구하기 위해 소동물 모델에 사용하도록 점점 더 많이 채택되고 있습니다 2,3,4. 유전자 변형 마우스 모델의 출현과 기록 기술의 상당한 발전으로 설치류 EEG는 전임상 연구에 필수적인 도구가 되었으며 인간의 뇌 건강과 관련된 번역 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다5,6.

신경 활동을 동시에 포착하고 조작하는 것은 거시적 및 미시적 회로 수준 모두에서 뇌 역학을 연구하는 데 중요합니다. 이 이중 접근 방식을 통해 발작 시작 및 진행과 관련된 신경망을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 반복적이고 종종 예측할 수 없는 발작을 특징으로 하는 간질은 복잡한 뇌 회로의 중단으로 인해 발생합니다4. 광범위한 연구에도 불구하고 발작 확산 및 발병을 지배하는 메커니즘은 부분적으로 여러 뇌 영역에 걸쳐 동시 기록을 허용하는 기술의 제한된 사용으로 인해 불완전하게 이해되고 있습니다7.

인간의 신경학적 장애를 요약하는 동물 모델의 EEG 기록은 인간 환자에게서 볼 수 있는 것과 밀접하게 유사한 발작 간기 스파이크, 스파이크 및 파동 방전 및 발작 발작 시작 패턴을 밝혀 8,9 인간 뇌에서 일어나는 전기생리학적 변화에 대한 이해를 발전시켰습니다. 유사하게, 알츠하이머병, 자폐 스펙트럼 장애 및 정신분열증 모델에서 검출된 EEG 이상은 중단된 신경 진동 활동에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 잠재적인 치료 표적을 강조합니다10.

뇌 해부학적 구조와 규모의 차이에도 불구하고 마우스와 인간 EEG는 놀라운 유사성을 나타냅니다 2,11. 둘 다 델타, 세타, 알파, 베타 및 감마와 같은 특징적인 진동 주파수 대역을 나타내며, 전력 스펙트럼은 일반적으로 1/f 분포를 따릅니다 2,11. 비급속 안구 운동(NREM) 수면 중 델타 활동의 출현 또는 주의력 및 기억 작업 중 감마 동기화 증가와 같은 뇌 상태 간의 전환은 종에 걸쳐 보존됩니다. 더욱이, 고주파 진동(HFO) 및 발작 패턴을 포함한 간질형 활동은 마우스와 인간 모두에서 유사한 시간 및 스펙트럼 프로파일을 보여줍니다7.

설치류와 인간 EEG의 보존된 특징으로 인해 마우스 모델은 뇌 장애를 연구하기 위한 매우 번역적입니다. 마우스 EEG는 상세한 회로 수준 분석을 가능하게 하는 침습적인 고해상도 기록을 허용합니다12. 또한 신경 기능 장애를 정확하게 조사하기 위해 행동 및 분자 도구와 결합될 수 있는 약리학적 제제, 광유전학적 제어 및 폐쇄 루프 자극13,14을 포함한 신경 조절 전략의 테스트를 지원합니다.

그럼에도 불구하고 결과를 추정할 때는 주의를 기울여야 합니다. 마우스 뇌의 더 작은 크기와 단순한 피질 구조는 신호 전파에 영향을 미칠 수 있으며 인지 사건 관련 전위(ERP)는 인간에 비해 덜 두드러질 수 있습니다15. 전극 배치, 신호 참조 및 분석 파이프라인의 일관성을 보장하는 것은 재현성과 실험실 간 타당성을 개선하는 데 중요합니다16.

작은 동물의 EEG를 기록하는 것은 기회와 도전을 동시에 제시합니다. 마우스 EEG는 일반적으로 두개골 표면에 경막외로 위치하거나 피질하 구조에 삽입된 깊이 전극으로 만성적으로 이식된 전극을 사용하여 획득됩니다17,18. 경막에 배치된 나사 또는 와이어 전극과 같은 표면 전극은 최소 침습적이며 장기간의 종단 기록에 적합합니다. 이러한 전극은 뼈 아래에 있어 기록에 높은 임피던스 장벽을 제공합니다. 따라서 설치류의 경막 전극은 EEG보다 피질전도(eCoG)에 더 비슷하다고 생각할 수 있습니다. 대조적으로, 깊이 전극은 더 높은 공간 해상도를 제공하고 해마, 시상 또는 편도체와 같은 심부 뇌 영역에 대한 접근을 가능하게 하여 발작 네트워크 및 영역 분포 전반에 걸친 진동 결합에 대한 연구를 용이하게 합니다 2,11.

설치류를 위한 최신 EEG 시스템은 높은 시간 해상도로 다중 채널 기록을 지원하며 종종 행동 상관 관계를 위한 비디오 모니터링과 결합됩니다18. 또한 무선 EEG 시스템을 사용하면 자유롭게 행동하는 동물에 대한 자유로운 실시간 수집이 가능하여 움직임 제약과 스트레스를 최소화할 수 있습니다19. 시간이 지남에 따라 이러한 현대화가 상업적으로 이용 가능해졌지만 비용이 많이 들거나 장기간에 걸쳐 설치류 모델을 연구하기에는 너무 침습적입니다.

이러한 격차를 해소하기 위해 우리는 최소한의 침습성으로 장기 연구에 적합한 설치류 모델에서 다중 사이트 EEG 획득을 위한 다재다능하고 비용 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이 EEG 기록 접근법은 통제된 실험 조건에서 마우스의 피질 활동에 대한 고해상도 평가가 필요한 연구에 특히 적합합니다. (i) 동물이 전극 이식 중 짧은 마취를 견딜 수 있고 완전히 회복될 수 있고, (ii) 기록 중에 안정적인 머리 위치 또는 최소한의 움직임이 보장되고, (iii) 신경 활동의 장기 또는 반복적인 모니터링이 바람직하고, (iv) 실험 설계는 증폭기 용량에 따라 단일 또는 제한된 다중 동물 기록을 수용할 수 있습니다. 조사관은 이러한 제약 조건을 고려하여 이 방법이 실험 목표와 일치하는지 여부를 결정해야 합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 오거스타 대학교 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침은 실험의 각 단계에서 따랐습니다. 이 연구에 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취했습니다. 이 연구에 사용된 마우스는 2개월 된 야생형 C57Bl6J입니다. 각 단계를 수행하는 데 필요한 시간은 해당 단계에 포함됩니다.

1. 전극이 있는 플러그 핀 준비(5분)

  1. 5핀이 있는 USB 유형 B 암 플러그 핀을 사용하여 0.003" 백금-이리듐 와이어로 납땜합니다. 핀으로 납땜하기 전에 와이어에서 코팅을 제거하십시오. 5개의 핀 중 네 번째 핀은 접지 핀입니다. 전극에 연결하는 데 사용하지 마십시오(그림 1A). 다른 4개의 핀을 사용하여 전극을 연결합니다.
  2. 핀을 약 45° 구부리고 각 핀에 전선을 두 번 감아 전선이 제대로 연결된 상태로 유지되고 빠지지 않도록 합니다(그림 1A).
  3. 각 핀에 약간의 솔더 로진 플럭스 페이스트를 추가하여 핀 표면을 청소하여 효과적으로 용접할 수 있습니다.
  4. 각 핀에 작은 용접선을 추가하고 인두를 사용하여 용접선을 녹인 다음 핀을 백금-이리듐 와이어에 영구적으로 부착합니다(그림 1B-D).
    알림: 45° 집게를 사용하여 와이어를 잡고 다른 집게를 사용하여 핀을 감습니다. 명시야 현미경으로 전체 절차를 수행합니다. 감싸고 납땜한 후 남은 와이어를 자르고 다른 쪽 끝을 전극에 부착한 상태로 유지합니다.

2. 전극 이식(30분)

  1. 밀폐된 챔버에서 0.5mL의 이소플루란에 적신 면모로 마우스를 마취하고 마우스를 정위 고정 단계에 장착합니다. 마우스를 스테이지에 장착하기 전에 뒷다리를 꼬집고 핀치에 반응하지 않을 때까지 기다려 마우스의 투여량이 부족하지 않은지 확인하십시오. 코에 있는 이소플루란/산소 인공호흡기를 1.5% v/v의 속도로 빠르게 시작합니다.
  2. 염증 반응과 통증을 줄이기 위해 카프로펜(5mg/kg)을 마우스에 주사하고 염증과 뇌 부종을 줄이기 위해 덱사메타손(0.1mg/kg IM)을 주사합니다. 마취제에 장기간 노출되면 눈이 건조해지고 손상될 수 있으므로 눈 연고를 사용하여 눈을 촉촉하게 유지하십시오.
  3. 제모제를 사용하거나 두개골 윗부분을 면도하여 피부를 노출시킵니다. 무균 기술에 따라 70% 에탄올과 요오드 패드를 사용하여 절개 부위를 청소하십시오.
  4. 메스로 머리 중앙을 명확하게 한 획으로 절개합니다. 절개 부위를 잘라 전극 이식 부위를 노출시킵니다. 근육이 노출되지 않았는지 확인하십시오(그림 2A).
  5. 0.9% NaCl 용액으로 세척하고 표면을 건조시킵니다. 과산화수소에 적시거나 담근 면봉으로 표면을 문지릅니다. 지속되는 뼈의 결합 조직은 메스로 제거할 수 있습니다. 문지른 후 최소 1분 정도 기다리십시오.
  6. 드릴링을 시작하기 전에 0.9% NaCl 용액으로 세척하고 표면을 건조시키십시오.
  7. 치과용 드릴을 사용하여 두개골 표면을 거칠게 만들어 아크릴 접착을 촉진합니다.
  8. 전극 이식 위치를 측정하고 가리킵니다(AP: +2, -4, ML: ±1.5)20 (그림 2B).
  9. 1.4mm 드릴을 사용하여 표면을 뚫고 정밀 드라이버를 사용하여 구멍에 뼈 나사 4개(1.5mm)를 넣습니다. 드릴링이 뼈를 통해 구멍을 뚫지 않도록 하십시오. 나사는 뇌에 구멍을 뚫지 말고 표면에 닿아야 합니다(그림 2C).
  10. 혈액이 있으면 0.9% NaCl 용액으로 씻고 마를 때까지 기다리십시오. 필요한 경우 진공청소기를 사용하십시오.
  11. USB 커넥터에 부착된 전선을 각 나사 주위에 2-4번 감고 남은 전선을 자릅니다(그림 2D).
  12. 각 나사 상단에 강력 접착제(Loctite)를 소량 떨어뜨리고 건조시켜 연결을 강하게 만듭니다. 커넥터가 두개골 중앙에 있고 두개골이나 전극에 닿지 않는지 확인하십시오(그림 2E).
  13. 시아노아크릴레이트를 사용하여 헤드캡을 한 번에 조금씩 천천히 만듭니다. 너무 두꺼운 층은 뼈를 가열할 수 있으므로 적용하지 마십시오. USB 케이블 연결을 돕기 위해 치과용 시멘트를 사용하여 뼈나 동물에 닿지 않는 커넥터의 평평한 표면에 큰 나사를 부착합니다(그림 2F).
  14. 정위 고정 단계에서 마우스를 분리하기 전에 헤드 캡을 최소 2분 동안 건조시키십시오. 히트 패드에서 다음 24시간 동안 마우스를 관찰합니다.
  15. 다음 7일 동안 12시간마다 5mg/kg의 용량으로 카프로펜으로 마우스를 치료합니다. 마우스는 아크릴 인터페이스에서 뼈 성장을 촉진하기 위해 2주를 기다린 후 EEG 기록을 위한 준비가 됩니다.
    알림: 커넥터를 가능한 한 두개골에 가깝게 유지하십시오. 두개골이나 뼈 나사에 닿지 않도록 하십시오. 전선이 양쪽 끝에서 서로 연결되어 있지 않은지 확인하십시오. 시아노아크릴레이트가 USB 커넥터와 눈에 들어가지 않도록 주의하십시오.

3. 뇌파 기록(65분)

  1. 펜티렌테트라졸(PTZ) 치료 전 30분, 20mg/Kg PTZ 치료 후 30분 동안 각 마우스의 EEG를 기록합니다.
  2. USB 케이블을 커넥터에 꽂습니다. USB 케이블을 차동 교류(AC) 에 연결합니다 amp게인이 10k로 설정되고 0.1Hz에서 250Hz 사이에서 필터링된 악어 클립을 사용하여 liifier21. 1000Hz에서 EEG 신호를 샘플링합니다(그림 3).
  3. 증폭기의 출력을 컴퓨터에 동시에 기록하고 실시간 모니터링을 위해 오실로스코프에 표시합니다. 증폭기 출력을 컴퓨터에 연결된 데이터 수집 및 신호 컨디셔닝(예: NIDAQ) USB 장치에 연결합니다(그림 3).
  4. Python 코드를 사용하여 EEG 신호를 기록합니다(https://github.com/schrodi159/blakelabeeg 에서 사용 가능). 이 코드는 0.1Hz 및 250Hz에서 신호를 디지털 방식으로 필터링합니다.
    알림: 전기 간섭이 없는 방에서 EEG를 기록하면 데이터 및 기록의 품질이 향상됩니다.

4. 데이터 해석

  1. Python 코드를 사용하여 데이터를 시각화합니다(https://github.com/schrodi159/blakelabeeg 에서 사용 가능). 각 기록에서 발작 간 방전물을 식별합니다(그림 4A).
    참고: 파형이 기준선의 두 배이고 지속 시간이 200ms 미만인 경우 발작 간 방전이 고려되었습니다.22 다음 5가지 기준 중 최소 4가지를 따르는 경우 고려되었습니다. 20,22.

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결과

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5마리의 야생형 C57Bl6J 마우스를 포함하여 C57Bl6J 배경의 20마리의 마우스에 전극을 이식했으며, 수술 후 최대 6개월까지 85%의 수술 후 생존율을 유지했습니다(그림 4B). 6개월 후 헤드캡이 분리되기 시작했고 모든 쥐는 생후 8개월에 안락사되었습니다. 커넥터와 나사를 포함한 헤드캡 어셈블리의 평균 무게는 1.13g(n = 20)이었습니다. 생쥐는 수술 후 30분 이내에 의식을 회복했고 12시간 이내에 정상적인 움직임과 시선을 재개했습니다.

이식된 전극이 화학적으로 유발된 경련과 관련된 전기생리학적 변화를 감지할 수 있는지 확인하기 위해 20mg/kg 펜티렌테트라졸(PTZ) 투여 전후에 EEG 기록을 얻었습니다. 데이터를 분석하기 위해 각 마우스의 발작 간 분비 횟수를 계산했습니다. 이 시스템은 그림 4C

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토론

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이 연구에서 우리는 자유롭게 움직이는 마우스에서 만성적인 다중 사이트 EEG 기록을 위한 강력하고 비용 효율적이며 최소 침습적 프로토콜을 개발하고 검증했습니다. 관찰된 생존율 및 기록 품질과 함께 USB 커넥터에 납땜된 나사 전극 및 맞춤형 백금-이리듐 전극의 성공적인 이식은 만성 기록에서 기술의 타당성과 신뢰성을 보여줍니다. 특히, 이 프로토콜은 광범위한 외과적 개입이나 엄청나게 비싼 하드웨어 없이 정확한 전기생리학적 데이터 수집을 가능하게 하여 광범위한 실험실 및 실험 설계에 접근할 수 있습니다.

핵심 혁신은 단순성, 내구성 및 비용 효율성의 조합에 있습니다. 종종 높은 비용8 또는 기술적 복잡성23,24으로 인해 제한되는 상업적으로 이용 가능한 시스템과 비교할 때, 이...

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공개 사항

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DTB는 Alfred Mann Foundation의 유급 컨설턴트입니다. 저자는 이 저작물에 따라 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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DTB는 NEI 보조금 R01EY036089 및 NIA 보조금 RF1AG060754에서 지원됩니다. XF는 James Fickel Alzheimer's Disease Research Fund, EY028158 및 EY032488의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.003" 백금 이리듐 와이어AM 시스템777000
1.5mm 본 스크류안트린 미니어처 특산물000-120X1/16 SL BIND MS SST
AC 앰프 AM 시스템
카프로펜코베트루스11695-6935-1
콜드팩 틀니어 아크릴 베이스예이츠 모틀로이드 컴퍼니https://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base
치과 드릴 1.4mm볼베레 GX해당 없음
덱사메타손VEDCO50989-437-12
눈 윤활제옵틱스 케어https://theoptixcare.com/
과산화수소시그마 올드리치7722-84-1
NIDAQ USB 내셔널 인스트루멘츠https://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.html데이터 수집 및 신호 조건화 USB 
펜틸렌테트라졸케이멘 케미컬스18682
납땜 송진, 플럭스 페이스트, nbsp;웰러https://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/
납땜 와이어 0.32"라디오 샥해당 없음
순간접착제록타이트해당 없음
USB 타입 B 암 플러그QM 판매자X00292ABU9

참고문헌

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  21. Luttjohann, A., Schoffelen, J. M., van Luijtelaar, G. Peri-ictal network dynamics of spike-wave discharges: Phase and spectral characteristics. Exp Neurol. 239, 235-247 (2013).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive evaluation of the 5XFAD mouse model for preclinical testing applications: A MODEL-AD study. Front Aging Neurosci. 13, 713726(2021).
  23. Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid microdrive system with recoverable opto-silicon probe and tetrode for dual-site high density recording in freely moving mice. J Vis Exp. (150), e60028(2019).
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