유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유비퀴틴화는 번역 후 변형으로, 세포 내 단백질 기능을 조절하는 중요한 요인입니다. 유비퀴틴화는 단백질 기능을 조절하여 프로테아솜 분해를 촉진하거나 유비퀴틴 사슬 의존적 신호를 통해 세포 내 위치를 변화시킵니다. 여기서는 HEK293T 세포에서 SMAD2 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 단백질 유비퀴틴화 수준 분석에 있어 이들의 효과를 비교합니다. 세포 내 단백질 과발현은 일시적인 형질전환에 의해 유도되었습니다. 플라스미드(HA-Ub, FLAG-SMAD2, MYC-SMURF2)와 형질전환 시약은 기저 배지에 별도로 첨가되어 혼합된 후 혼합물을 세포에 첨가했습니다. 수확 전에 MG132가 추가되어 프로테아솜 분해를 억제하고 유비퀴틴화된 단백질 축적을 촉진했습니다. 두 실험 접근법의 주요 차이점은 세포 용해 방법인 얼음 목욕법(4 °C에서 수행)과 열처리 방법(95 °C에서 배양 포함)으로, 단백질 용해 효율에 상당한 영향을 미칩니다. 세포 용해가 완료된 후, 세포 용해액, 아가로스 구슬, FLAG 항체를 혼합하여 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다. 유비퀴틴화된 단백질을 검출하기 전에, 경쇄 항체가 2차 항체 배양에 사용되었습니다. 그 후 유비퀴틴화 밴드가 발견되었습니다. 결과는 아이스배스 방법과 열처리법 모두 유비퀴틴화 수준을 검출하는 데 사용할 수 있으며, 열처리 방법은 SMAD2의 유비퀴틴화 검출을 더 쉽게 할 수 있음을 보여줍니다. 본 연구는 SMURF2/SMAD2를 모델로 사용하여 포유류 세포에서 유비퀴틴화 수준을 측정하는 두 가지 세포 용해 방법을 구분하고 비교하여, 연구자들이 기질 단백질의 유비퀴틴화 수준을 더 적합한 방법을 선택하는 데 도움을 줍니다.
서론
유비퀴틴화는 필수적인 번역 후 변형으로, 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 진핵생물에서 단백질의 80% 이상이 분해되는 과정을 매개하며, 유비퀴틴(Ub), E1 활성화 효소, E2 결합 효소, E3 리가아제, 탈유비퀴티화 효소(DUB), 그리고 26S 프로테아좀2로 구성되어 있습니다. 이 시스템은 단백질 교체를 높은 특이도로 조절하여 세포 주기 진행3, 신호전달 4,5, 스트레스 반응 6,7과 같은 필수 세포 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 다단계 효소 과정입니다. E1은 ATP를 가수분해하여 Ub의 C-말단을 아데닐화하여 Ub-AMP 중간체를 형성합니다. 그 후 활성화된 Ub는 E1에서 E2 결합 효소의 활성 부위 시스테인으로 옮겨져 티오에스터 결합을 형성합니다. 마지막으로, E3 리가아제가 E2-Ub 복합체와 표적 단백질을 모두 모집하여 Ub가 E....
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프로토콜
1. 용해 버퍼 및 시약의 준비
참고: 모든 완충제를 지정된 농도로 준비하세요. 농도 차이를 피하려면 제조사의 시약 분말 사용 지침을 따르세요.
- 20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton X-100을 포함한 용해 버퍼를 준비합니다. 필요하다면 NaCl 농도를 50-150 mM 사이로 조절하세요. 모든 완충제는 이중 증류 H₂O로 준비하세요.
- 용해 버퍼에 1% 프로테아제 억제제 혼합물(EDTA 포함 제외)을 보충하여 작동 용액을 준비합니다. 충분히 섞고 얼음 위에 보관해 두세요.
- 10% SDS 분말을 10mL PBS에 녹여 10% SDS를 준비합니다. 완전히 녹을 때까지 섞으세요. 실온에서 보관하세요.
- 250 mM 트리스-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 50% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 5% β-머캅토에탄올을 포함한 5× 단백질 로딩 버퍼를 준비합니다. 성분을 이중 증류 H2O에 녹입니다. 사용 전에 충분히 혼합하세요.
참고: SDS와 β-머캅토에탄올은 적절한 보호 ....
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결과
TGF-β 신호 전달 경로에서 '분자 메신저'인 SMAD2는 TGF-β 수용체에 의해 인산화된 후 SMAD3 및 SMAD4와 복합체를 형성하고, 핵으로 이동하여 하위 표적 유전자의 전사를시작합니다. 따라서 이 분자는 세포 외 신호와 세포 내 유전자 발현을 연결하는 핵심 분자입니다. 이 분해는 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화를 촉매하는 E3 유비퀴틴 리가아제인 SMURF2에 의해 매개되며, 이를 통해 프로테아솜 분해를 표적으로 합니다. 이 SMURF2 매개 SMAD2 분해는 TGF-β 신호 전달을 종료하고, 하위 유전자의 과도한 활성화를 방지하며, 세포 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다. SMURF2가 SMAD2를 분해하는 과정은 폐섬유증과 같은 여러 질환에서 기능적 역할을하며, SMURF2 매개 SMAD2 분해가 감소하면 SMAD2가 과도하게 축적되고 섬유화 유전자가 과발현된다
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토론
본 연구는 E3 리가아제 매개 기질 유비퀴틴화 검출에 최적화된 두 가지 상세한 단백질 용해 프로토콜을 제시하고 비교합니다. 검출 가능성을 보장하기 위해 플라스미드 기반 과발현(예: 태그된 SMAD2, SMURF2, Ub)을 세포 내에서 사용하여 특정 유비퀴틴화 신호를 시각화할 충분한 단백질 수준을 제공했으며, 이는 본 연구에서 E3 리가아제-기질 상호작용 검증에 매우 중요했습니다. 세포 채취 전에, 프로테아좀 매개 유비퀴틴 단백질의 분해를 차단하기 위해 강력한 프로테아좀 억제제인 MG132가 첨가되었습니다. 이 단계는 유비퀴틴-단백질 접합체의 축적을 보장하여 이후 분석에서 유비퀴틴화 신호의 검출 가능성을 높였습니다. MG132의 작동 농도 범위는 일반적으로 5-50 μM이며, 처리 시간은 24시간을 넘지 않아야 합니다. MG132는 반감기가 짧은 빠르게 작용하는 프로테아좀 억제제이므로, 장기 프로테아좀 억제가 필요하다면 실험 중 MG132가 포함된 신선한 배지로 대체하.......
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공개 사항
저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가자연과학기금(Nitro Natural Science Foundation of China, Nitro 82370647 (W.H.), Nos. 82170642 (J-X.)의 지원을 받았습니다. Z), 번호 81801923 (X-F. Z), 번호 81670575 (J-X. Z), 번호 81570570 (W.H.) 및 번호 81070355 (J-X. 화중과학기술대학교 HUST 학술 프런티어 청년팀 프로그램(2018QYTD02)에서 발표했습니다. 후베이 재생의학 및 다학제적 중개 연구 핵심 연구소 오픈 재단(2022zsyx003). 중국 국가 중점연구개발 프로그램(2024YFA1107601).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | 서비스바이오 | EP-150-M | |
| 100mm TC 처리 배양 접시 | 서비스바이오 | CCD-100 | |
| 6웰 디스크 | 서비스바이오 | CCP-6H | |
| 항-FLAG 항체 | 단백질 기술 | 20543-1-AP | 희석은 IP에 1:200, WB에 1:10000 사용됨 |
| 항-GAPDH 항체 | 단백질 기술 | MA5-15738 | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-HA 항체 | 단백질 기술 | 51064-2-AP | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-IgG 항체 | CST | #3900 | 희석 비율은 IP에 1:200 사용 |
| 항-MYC 항체 | 단백질 기술 | 60003-2-Ig | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-SMAD2 항체 | CST | #5339 | 희석은 IP에 1:200, WB에 1:2000 |
| 브로모페놀 블루 | 서비스바이오 | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | 서비스바이오 | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| 글리세롤 | 시노팜 | 10010618 | |
| 가열/냉각 건조 욕조 | 궈청 | ||
| HEK293T 세포 | ATCC | CRL-3216 | |
| 고혈당 DMEM | 서비스바이오 | G4515-500ML | |
| HRP 결합 염소 항쥐 IgG 경쇄 및 nbsp; | 아클론 | AS062 | 희석 사용 1:5000 |
| HRP 결합 마우스 항토끼 IgG 경쇄 | 아클론 | AS061 | 희석 사용: 1:10000 |
| 리포8000 | 비요타임 | C0533 | |
| MG132 | 알라딘 | M421264 | |
| 마이크로 원심분리기 | 랩지크 | CF1524R | |
| NaCl 분말 | 서비스바이오 | GC102004 | |
| PBS | 서비스바이오 | G4202-500ML | |
| pCMV-플래그-SMAD2 | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-하-우브 | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-MYC | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | 포유류 발현에 대해 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | 서비스바이오 | G4003-100ML | |
| EDTA 없는 프로테아제 억제제 조합 | 타겟몰 | C0001 | |
| 단백질 A/G 아가로스 구슬 | 비요타임 | P2017 | |
| PVDF 멤브레인 | 바이즈메 | E801 | |
| SDS 분말 | 솔라비오 | S8010-500g | |
| SDS-PAGE 시스템 | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| 소닉스 | 위브라 셀 | ||
| 트리스-HCl 화약 | 바이오탑 | HST-0372 | |
| 트리톤 X-100 | 서비스바이오 | GC204003-100ml | |
| 트립신 | 서비스바이오 | G4021-100ML | |
| 보텍스 믹서 | 바이즈메가 친절히 기증하셨습니다 | ||
| β-머캡토에탄올 | 알라딘 | M301573 |
참고문헌
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., ....
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재인쇄 및 허가
