유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유비퀴틴화는 번역 후 변형으로, 세포 내 단백질 기능을 조절하는 중요한 요인입니다. 유비퀴틴화는 단백질 기능을 조절하여 프로테아솜 분해를 촉진하거나 유비퀴틴 사슬 의존적 신호를 통해 세포 내 위치를 변화시킵니다. 여기서는 HEK293T 세포에서 SMAD2 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 단백질 유비퀴틴화 수준 분석에 있어 이들의 효과를 비교합니다. 세포 내 단백질 과발현은 일시적인 형질전환에 의해 유도되었습니다. 플라스미드(HA-Ub, FLAG-SMAD2, MYC-SMURF2)와 형질전환 시약은 기저 배지에 별도로 첨가되어 혼합된 후 혼합물을 세포에 첨가했습니다. 수확 전에 MG132가 추가되어 프로테아솜 분해를 억제하고 유비퀴틴화된 단백질 축적을 촉진했습니다. 두 실험 접근법의 주요 차이점은 세포 용해 방법인 얼음 목욕법(4 °C에서 수행)과 열처리 방법(95 °C에서 배양 포함)으로, 단백질 용해 효율에 상당한 영향을 미칩니다. 세포 용해가 완료된 후, 세포 용해액, 아가로스 구슬, FLAG 항체를 혼합하여 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다. 유비퀴틴화된 단백질을 검출하기 전에, 경쇄 항체가 2차 항체 배양에 사용되었습니다. 그 후 유비퀴틴화 밴드가 발견되었습니다. 결과는 아이스배스 방법과 열처리법 모두 유비퀴틴화 수준을 검출하는 데 사용할 수 있으며, 열처리 방법은 SMAD2의 유비퀴틴화 검출을 더 쉽게 할 수 있음을 보여줍니다. 본 연구는 SMURF2/SMAD2를 모델로 사용하여 포유류 세포에서 유비퀴틴화 수준을 측정하는 두 가지 세포 용해 방법을 구분하고 비교하여, 연구자들이 기질 단백질의 유비퀴틴화 수준을 더 적합한 방법을 선택하는 데 도움을 줍니다.
서론
유비퀴틴화는 필수적인 번역 후 변형으로, 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 진핵생물에서 단백질의 80% 이상이 분해되는 과정을 매개하며, 유비퀴틴(Ub), E1 활성화 효소, E2 결합 효소, E3 리가아제, 탈유비퀴티화 효소(DUB), 그리고 26S 프로테아좀2로 구성되어 있습니다. 이 시스템은 단백질 교체를 높은 특이도로 조절하여 세포 주기 진행3, 신호전달 4,5, 스트레스 반응 6,7과 같은 필수 세포 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 다단계 효소 과정입니다. E1은 ATP를 가수분해하여 Ub의 C-말단을 아데닐화하여 Ub-AMP 중간체를 형성합니다. 그 후 활성화된 Ub는 E1에서 E2 결합 효소의 활성 부위 시스테인으로 옮겨져 티오에스터 결합을 형성합니다. 마지막으로, E3 리가아제가 E2-Ub 복합체와 표적 단백질을 모두 모집하여 Ub가 E2에서 기질8의 라이신 잔기로 전달되는 과정을 촉매합니다.
유비퀴틴은 7개의 라이신 잔기(Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) 또는 Met1(M1)4)에서의 결합을 통해 다양한 폴리우비퀴틴 사슬을 형성할 수 있습니다. 각 연결 유형은 뚜렷한 생물학적 결과를 결정합니다: K48 연결 사슬은 주로 단백질을 표적으로 하여 단백질 분해를 진행합니다9, K63 연결 사슬은 신호 전달과DNA 수리를 조절하며, M1 연결 사슬은 선천 면역 반응에 필수적이다12. 유비퀴틴화와 탈유비퀴틴화는 단백질 분해부터 신호 전달에 이르기까지 다양한 세포 이벤트를 지배하는 중요한 번역 후 변형 과정입니다. 예를 들어, 대장암에서는 MDM2 매개 p53 유비퀴틴화의 비정상 활성화가 p53의 과도한 분해를 초래하여 세포 주기 정지 및 세포자살 사전을 유도하는 능력을 저해하고, 이로 인해 종양 진행과 화학요법 내성을 촉진합니다13,14. 간허혈-재관류 손상에서는 OTUD1이 K48 연관 폴리우비퀴틴화를 제거하여 NRF2를 안정화하여 세포 내 산화 스트레스 수준을 완화합니다15,16. 보르테조밉, 카필조밉, 익사조몹과 같은 다양한 프로테아좀 억제제가 다발성 골수종17, 18, 19와 같은 질환에 대해 점차 임상 실무에 도입되고 있습니다.
현재 유비퀴틴 단백질을 검출하는 다양한 방법이 있으며, 여기에는 웨스턴 블롯팅, 방사성 기반 분석법, 형광 분석법 등이 포함됩니다. 그러나 과학 연구에서는 웨스턴 블롯이 비교적 빠르고 간단한 프로토콜 덕분에 단백질 유비퀴틴화 검출에 여전히 선호되는 방법으로 남아 있습니다. 유비퀴틴화 단백질을 검출하는 전통적인 방법은 공동면역침전(co-IP) 기술과 유사합니다: 용해 완충제를 사용해 저온에서 세포 펠릿을 배양하고 용해하여 단백질을 방출한 후, 항체를 이용해 기질 단백질의 유비퀴틴화를 감지합니다21,22. 하지만 이 실험 프로토콜은 종종 많은 수의 세포를 필요로 합니다. 또한, 저온에서의 비교적 온화한 용해 방법은 단백질 상호작용을 완전히 방해하지 못하기 때문에, 유비퀴틴화 검출에서 위양성 가능성이 증가합니다. 가열과 SDS 사용은 단백질 구조를 크게 교란시켜 완전한 변성을 유도함으로써 단백질-단백질 상호작용으로 인한 위양성 결과를 효과적으로 줄입니다 23,24,25. 마찬가지로, 가열과 SDS 처리 시 세포는 충분한 용해를 겪어 더 많은 단백질을 방출하고, 그에 따라 실험에 필요한 세포 수를 줄입니다. 요약하자면, 아이스배스 방법과 열처리 방법 모두 용해 세포를 분석하고 항체 배양을 통해 기질 단백질의 유비퀴틴화 수준을 검출합니다. 하지만 가열 방법은 세포 용해가 더 많고 단백질 변성이 더 강해집니다.
TGF-β는 다양한 질병의 병태생리학적 과정에서 이중 역할을 합니다26,27. SMAD2는 TGF-β의 중요한 하류 전사 인자입니다. SMURF2 매개 SMAD2의 유비퀴틴화는 이를 프로테아좀 분해에 표적으로 하여 TGF-β 신호 강도를 미세 조정합니다28. 본 연구는 SMURF2/SMAD2를 모델로 사용하여 포유류 세포에서 유비퀴틴화 수준을 측정하는 두 가지 세포 용해 방법을 구분하고 비교합니다. 여기서는 HA-Ub, FLAG-SMAD2, MYC-SMURF2 플라스미드에 의한 일시적 형질염입에 의해 HEK293T 세포 내 단백질 과발현이 유도되었습니다. 세포들은 각각 얼음 목욕법과 열처리법을 사용해 용해되었습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었다. 우리는 아이스-배스 방법과 열처리법 모두 유비퀴틴화 수준을 검출하는 데 사용할 수 있으며, 열처리 방법은 SMAD2의 유비퀴틴화 탐지를 더 쉽게 만들 수 있음을 발견했습니다. 이 프로토콜은 유비퀴틴화된 단백질을 검출하는 새로운 대안을 제공합니다. 더불어, 유비퀴틴화와 강하게 연관된 특정 기질 단백질에 대해서는 열처리 방법이 단백질 용해 효율을 높이 수행하여 유비퀴틴화 검출을 용이하게 합니다.
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프로토콜
1. 용해 버퍼 및 시약의 준비
참고: 모든 완충제를 지정된 농도로 준비하세요. 농도 차이를 피하려면 제조사의 시약 분말 사용 지침을 따르세요.
- 20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton X-100을 포함한 용해 버퍼를 준비합니다. 필요하다면 NaCl 농도를 50-150 mM 사이로 조절하세요. 모든 완충제는 이중 증류 H₂O로 준비하세요.
- 용해 버퍼에 1% 프로테아제 억제제 혼합물(EDTA 포함 제외)을 보충하여 작동 용액을 준비합니다. 충분히 섞고 얼음 위에 보관해 두세요.
- 10% SDS 분말을 10mL PBS에 녹여 10% SDS를 준비합니다. 완전히 녹을 때까지 섞으세요. 실온에서 보관하세요.
- 250 mM 트리스-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 50% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루, 5% β-머캅토에탄올을 포함한 5× 단백질 로딩 버퍼를 준비합니다. 성분을 이중 증류 H2O에 녹입니다. 사용 전에 충분히 혼합하세요.
참고: SDS와 β-머캅토에탄올은 적절한 보호 장비를 착용한 채 연기함 내에서 다룰 것입니다. 오염된 물질은 기관의 화학 폐기물 지침에 따라 처리해야 합니다.
2. 세포 준비
- HEK293T 세포를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 고포도당 DMEM에 유지합니다. 멸균 조건에서 37°C에서 5% CO₂를 배양하세요. 통로 세포는 약 90% 합류율에 위치해 있습니다.
- 6웰 플레이트에 5× 10⁵ 셀의 씨앗 셀을 배치합니다. 두 개의 우물에서 셀을 모아 하나의 샘플을 생성합니다.
- 전체 배양 부피의 10%를 차지하는 형질전환 혼합물을 준비하고, SMAD2 유비퀴틴화 실험 모델로 사용합니다. 100 μL 무혈청 DMEM에 HA-Ub 플라스미드 1mg, FLAG-SMAD2 플라스미드 1μg, 빈 벡터 또는 MYC-SMURF2 플라스미드 0.5 μg를 조합합니다. 별도의 튜브에서 3.75 μL 형질전환 시약을 혈청 무첨가 DMEM 100 μL에 희석합니다. 시약 혼합물을 플라스미드 용액에 점차 넣고, 실온에서 15분간 배양한 후 세포에 고르게 분포합니다.
- 6-8시간 후 트랜스펙션 배지를 웰당 2mL의 신선하고 완전한 DMEM으로 교체합니다. 세포를 48시간 배양하세요.
- 세포를 5 μM MG132로 12시간 동안 처리한 후 채취하세요.
참고: 장갑을 끼고 생물안전 캐비닛에 MG132를 넣어 다룰 수 있습니다. 오염된 물질은 기관 안전 절차에 따라 폐기해야 합니다.
3. 세포 수집
- 셀을 90-100% 합류도(~3 × 10⁶ 셀)로 채취합니다. 배지를 흡입한 후 각 웰에 1mL 미리 차가운 PBS를 넣어 세척하세요. PBS를 완전히 제거하세요.
- 각 웰에 1mL의 PBS를 추가하고 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮겨 얼음 위에 올려놓으세요.
- 380 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 상원액을 제거하고 펠릿을 남기세요.
4. 아가로스 비즈 준비
- 샘플당 50 μL 단백질 A/G 아가로스 비즈를 새로운 튜브로 옮깁니다. 1mL 용해 완충액으로 3번 비드를 세척하세요. 세척 사이에 100 × g 원심분리기에서 4 °C에서 1분간 사용하세요.
- 잔류 버퍼를 제거하면서 펠릿을 손상시키지 마세요. 작동 용액 100 μL과 항-FLAG 항체 5 μL을 추가합니다. 4°C에서 6시간 동안 부드럽게 돌려 배양하세요.
5. 세포 용해
- 아이스배스 방법
- 펠릿에 500 μL 미리 냉각된 작업 용액을 추가하세요. 얼음 위에 30분간 부화하세요.
- 2W에서 4초 온/4초 오프 사이클을 5회 반복해서 소닉테이트하세요. 초음파 검사 중에는 샘플을 얼음 보관하세요. 샘플을 남은 배양 기간 동안 얼음에 넣으세요.
참고: 약한 단백질 상호작용의 경우, NaCl 농도를 50-75 mM으로 줄이고 초음파 검사를 생략하세요.
- 열처리 방법
- 펠릿에 작업 용액 45 μL을 추가하세요. 10% SDS 5 μL을 계속 섞으면서 추가하세요.
- 잠시 소용돌이를 일으키고 95°C에서 가열하여 현탁이 투명하고 완전히 액화될 때까지 가열합니다. 균일한 변성을 위해 간헐적으로 뒤집는 작업.
- 450 μL 작동 용액을 추가하세요. 2W에서 소닉케이트를 4초 온/4초 오프 사이클로 5회 반복하며 샘플을 얼음 위에 보관하세요.
참고: 최종 SDS 농도는 <0.1%로 유지되도록 하세요. 가시성 펠릿의 사라짐과 균일한 용액 투명도를 확인하여 완전한 용해를 확인합니다.
6. 면역침전 및 유비퀴틴화 검출
- 원심분리기는 13,680 × g 에서 4°C에서 15분간 용해합니다. 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
- 용해액 60μL를 비축하고 5× 로딩 버퍼 15μL을 추가합니다. 95°C에서 15분간 가열한 후 입력액으로 라벨을 붙입니다.
- 남은 용해액에 항체 결합 구슬 100 μL을 추가합니다(최종 용량 540 μL). 4°C에서 8-12시간 동안 교대로 배양하세요.
- 원심분리기는 100 × g 에서 4 °C에서 1분간 구슬을 형성한 후 상청액을 버립니다. 비즈를 용해 버퍼로 3번 세척하세요. 1× SDS 로딩 버퍼 75 μL를 추가하고 95 °C에서 15분간 가열하여 단백질을 용출합니다. IP로 라벨링하세요.
- 표준 JoVE 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯으로 유비퀴틴화된 단백질을 검출합니다.
참고: 자세한 전송 및 검출 절차는 웨스턴 블롯 프로토콜29 를 참조하십시오. 분자량 마커가 포함된 전체 길이의 자르지 않은 블롯은 보충 파일 1에 제공됩니다.
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결과
TGF-β 신호 전달 경로에서 '분자 메신저'인 SMAD2는 TGF-β 수용체에 의해 인산화된 후 SMAD3 및 SMAD4와 복합체를 형성하고, 핵으로 이동하여 하위 표적 유전자의 전사를시작합니다. 따라서 이 분자는 세포 외 신호와 세포 내 유전자 발현을 연결하는 핵심 분자입니다. 이 분해는 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화를 촉매하는 E3 유비퀴틴 리가아제인 SMURF2에 의해 매개되며, 이를 통해 프로테아솜 분해를 표적으로 합니다. 이 SMURF2 매개 SMAD2 분해는 TGF-β 신호 전달을 종료하고, 하위 유전자의 과도한 활성화를 방지하며, 세포 항상성을 유지하는 데 매우 중요합니다. SMURF2가 SMAD2를 분해하는 과정은 폐섬유증과 같은 여러 질환에서 기능적 역할을하며, SMURF2 매개 SMAD2 분해가 감소하면 SMAD2가 과도하게 축적되고 섬유화 유전자가 과발현된다
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토론
본 연구는 E3 리가아제 매개 기질 유비퀴틴화 검출에 최적화된 두 가지 상세한 단백질 용해 프로토콜을 제시하고 비교합니다. 검출 가능성을 보장하기 위해 플라스미드 기반 과발현(예: 태그된 SMAD2, SMURF2, Ub)을 세포 내에서 사용하여 특정 유비퀴틴화 신호를 시각화할 충분한 단백질 수준을 제공했으며, 이는 본 연구에서 E3 리가아제-기질 상호작용 검증에 매우 중요했습니다. 세포 채취 전에, 프로테아좀 매개 유비퀴틴 단백질의 분해를 차단하기 위해 강력한 프로테아좀 억제제인 MG132가 첨가되었습니다. 이 단계는 유비퀴틴-단백질 접합체의 축적을 보장하여 이후 분석에서 유비퀴틴화 신호의 검출 가능성을 높였습니다. MG132의 작동 농도 범위는 일반적으로 5-50 μM이며, 처리 시간은 24시간을 넘지 않아야 합니다. MG132는 반감기가 짧은 빠르게 작용하는 프로테아좀 억제제이므로, 장기 프로테아좀 억제가 필요하다면 실험 중 MG132가 포함된 신선한 배지로 대체하...
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공개 사항
저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가자연과학기금(Nitro Natural Science Foundation of China, Nitro 82370647 (W.H.), Nos. 82170642 (J-X.)의 지원을 받았습니다. Z), 번호 81801923 (X-F. Z), 번호 81670575 (J-X. Z), 번호 81570570 (W.H.) 및 번호 81070355 (J-X. 화중과학기술대학교 HUST 학술 프런티어 청년팀 프로그램(2018QYTD02)에서 발표했습니다. 후베이 재생의학 및 다학제적 중개 연구 핵심 연구소 오픈 재단(2022zsyx003). 중국 국가 중점연구개발 프로그램(2024YFA1107601).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | 서비스바이오 | EP-150-M | |
| 100mm TC 처리 배양 접시 | 서비스바이오 | CCD-100 | |
| 6웰 디스크 | 서비스바이오 | CCP-6H | |
| 항-FLAG 항체 | 단백질 기술 | 20543-1-AP | 희석은 IP에 1:200, WB에 1:10000 사용됨 |
| 항-GAPDH 항체 | 단백질 기술 | MA5-15738 | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-HA 항체 | 단백질 기술 | 51064-2-AP | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-IgG 항체 | CST | #3900 | 희석 비율은 IP에 1:200 사용 |
| 항-MYC 항체 | 단백질 기술 | 60003-2-Ig | 희석 사용: 1:10000 |
| 항-SMAD2 항체 | CST | #5339 | 희석은 IP에 1:200, WB에 1:2000 |
| 브로모페놀 블루 | 서비스바이오 | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | 서비스바이오 | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| 글리세롤 | 시노팜 | 10010618 | |
| 가열/냉각 건조 욕조 | 궈청 | ||
| HEK293T 세포 | ATCC | CRL-3216 | |
| 고혈당 DMEM | 서비스바이오 | G4515-500ML | |
| HRP 결합 염소 항쥐 IgG 경쇄 및 nbsp; | 아클론 | AS062 | 희석 사용 1:5000 |
| HRP 결합 마우스 항토끼 IgG 경쇄 | 아클론 | AS061 | 희석 사용: 1:10000 |
| 리포8000 | 비요타임 | C0533 | |
| MG132 | 알라딘 | M421264 | |
| 마이크로 원심분리기 | 랩지크 | CF1524R | |
| NaCl 분말 | 서비스바이오 | GC102004 | |
| PBS | 서비스바이오 | G4202-500ML | |
| pCMV-플래그-SMAD2 | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-하-우브 | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-MYC | 포유류 발현에 대해 | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | 포유류 발현에 대해 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 | 서비스바이오 | G4003-100ML | |
| EDTA 없는 프로테아제 억제제 조합 | 타겟몰 | C0001 | |
| 단백질 A/G 아가로스 구슬 | 비요타임 | P2017 | |
| PVDF 멤브레인 | 바이즈메 | E801 | |
| SDS 분말 | 솔라비오 | S8010-500g | |
| SDS-PAGE 시스템 | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| 소닉스 | 위브라 셀 | ||
| 트리스-HCl 화약 | 바이오탑 | HST-0372 | |
| 트리톤 X-100 | 서비스바이오 | GC204003-100ml | |
| 트립신 | 서비스바이오 | G4021-100ML | |
| 보텍스 믹서 | 바이즈메가 친절히 기증하셨습니다 | ||
| β-머캡토에탄올 | 알라딘 | M301573 |
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