마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

Summary

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

Abstract

강화제 RNA(eRNA)는 전사적으로 활성화된 강화체 영역에서 생성되는 비암호화 전사체로, 점점 유전자 발현의 핵심 조절자로 인식되고 있습니다. 기능적 중요성에도 불구하고, eRNA의 안정성과 분해 역학은 특히 배아 줄기세포(ESC)에서 전사 프로그램이 매우 역동적이고 맥락에 의존하는 경우가 많아 아직 잘 특성화되지 않고 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 ESC에서 유전자 간 및 유전자 내 eRNA의 붕괴 속도론과 반감기를 정량적으로 평가하는 방법을 제시합니다. 전사는 악티노마이신 D를 사용하여 억제되며, 총 RNA는 여러 지정된 시점에서 수집됩니다. cDNA는 무작위 헥사머와 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 합성하여 폴리아데닐화 및 비다아데닐화 전사체 모두를 검출할 수 있게 합니다. 간유전자 eRNA의 경우, 정규화는 하우스키핑 유전자 또는 0분 시점의 Ct 값을 사용하여 수행됩니다. 유전자 내 eRNA의 경우, 겹치는 프리-mRNA의 간섭을 최소화하기 위해 이중 정규화 접근법이 사용됩니다. 감쇠 곡선은 1상 지수 감쇠 모델을 사용하여 분석되어 반감기를 정확히 추정할 수 있습니다. 프로토콜은 mESC의 eRNA가 약 2-3분의 반감기를 가진 빠른 회전을 보인다는 것을 밝혀냅니다. 이 방법론은 eRNA 안정성을 연구하는 견고하고 재현 가능한 틀을 제공하며, 다능성 줄기세포 맥락에서 증강제 활성과 RNA 역학에 대한 통찰을 제공합니다.

Introduction

강화제는 전사 인자와 공동 조절자 ^1,2,3,4,5,6의 결합 플랫폼으로서 조직 및 자극 특이적 유전자 발현을 조절하는 시스 조절 요소(CRE)입니다. 인핸서가 선형 게놈 수준에서 표적 유전자와 멀리 떨어진 곳에 위치할 수 있지만, 염색질 루프 메커니즘은 프로모터와의 공간적 근접성을 가능하게 하여 전사 조절을 촉진합니다. 활성 강화제는 RNA 중합효소 II(Pol II)에 의해 양방향으로 전사되어, 보통 중앙값 길이가 약 1 kb 1,2,7,8,9인 인핸서 RNA(eRNA)라고 불리는 긴 비암호화 RNA를 생성합니다. eRNA의 발현은 인근 표적 유전자 활성화와 강한 상관관계를 보이며^, 기능적 연구들은 eRNA의 고갈이 표적 유전자의 전사를 감소시키는 것으로 꾸준히 보여주어, eRNA가 전사 부산물이 아니라 기능적 조절자로 작용함을 시사합니다 13,14,15,16,17. 기능적 중요성에도 불구하고, eRNA를 신뢰성 있게 검출하고 정량하는 실험 프로토콜은 여전히 제한적입니다.

줄기세포에서 증강제 활성은 다능성 유지와 발달 전이의 촉진에 중요한 역할을 합니다^18,19. 증강서는 유전자 간 영역(간유전자 또는 외유전자 증강자)에 존재하거나 유전자체 내에 내장되어 인트라유전자 증강서로 존재할 수 있습니다^. 간유전자 증강제는 다양한 세포 유형에서 광범위하게 연구되었으나, 숙주 유전자 전미 mRNA와의 전사 중첩과 전사 신장과 관련된 히스톤 변형 존재 등 기술적 어려움으로 인해 유전자 내 증강제는 상대적으로 덜 탐구되고 있다^20,21. 그럼에도 최근 연구들은 유전자 간 및 유전자 내 증강체가 ESC에서 다능성^22,23과 초기 분화²⁴에 관여하는 유전자 조절 네트워크에 기여함을 보여주었습니다. 특히, 주석이 달린 인가시의 거의 절반이 유전자 내 인생 인^{더스이며,} 이들의 활성은 발달 단계에 따라 달라지며, 분화된 조직 ^8,26,27,28에서 종종 증가합니다. 그러나 ESC에서 유전자 내 증강제의 유병률과 기능적 역할은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 특히, 유전자 간 eRNA는 유전자 간에 전사되는 반면, 유전자 내 eRNA는 유전자 체 내에서 전사되며 선-mRNA 전사체와 겹칠 수 있습니다. 이러한 위치 차이는 유전자 간 및 유전자 내 eRNA를 해석하고 정량할 때 서로 다른 분석 접근법을 요구합니다.

mRNA와 달리 eRNA는 일반적으로 3′ 폴리(A) 꼬리가 없어 안정성이 낮고 빠른 분해가 발생한다 1,2,7,8,9. 이러한 내재적 불안정성은 특히 시간 실험에서 eRNA 발현 분석을 어렵게 만듭니다. 뉴런에서 eRNA는 7.5분¹⁷초라는 짧은 반감기를 보이는 것으로 보고되었습니다. 그러나 이러한 불안정성이 특히 증강제 활성과 eRNA 전사가 세포 유형에 따라 매우 특이적인 ESC에서 일관되는지는 여전히 불분명합니다 7,17,29,30. ESC는 다능성을 유지하거나 분화를 시작하기 위해 동적 유전자 조절 프로그램에 의존하며, eRNA 전환을 검사하는 독특한 시스템이다^31,32. ESC의 빠른 전사 변화를 고려할 때, 이 맥락에서 eRNA 붕괴를 이해하는 것은 증강제 활성이 시간적으로 어떻게 조절되는지 밝혀낼 수 있습니다¹⁷. 더불어, 유전자 간 및 유전자 내 eRNA 간의 차이, 예를 들어 숙주 유전자 전사체와의 중복 등은 별도의 분석 접근법을 필요로 합니다²⁰. 이러한 질문들이 중요함에도 불구하고, ESC에서 eRNA 반감기를 측정하거나 다양한 eRNA 유형의 붕괴 역학을 비교하는 표준화된 방법은 거의 존재하지 않습니다.

본 연구는 mESCs에서 간유전자 및 유전자 내 증강제로부터 전사된 eRNA의 안정성과 반감기를 평가하는 정량적 프로토콜을 제시합니다. 전사 억제는 정해진 시간 간격에서 악티노마이신 D(ActD)를 사용하여 수행되며, 이어서 실시간 정량적 PCR(RT-qPCR)과 비선형 회귀분석을 통해 eRNA 붕괴를 정량합니다. 유전자 간 증강제와 유전자 내 증강제 간의 위치 차이를 해결하기 위해, 이 방법은 서로 다른 정규화 전략을 도입하여 eRNA 분해 역학을 체계적이고 정확하게 비교할 수 있게 합니다. 이 구조화된 분석 프레임워크는 다능성 줄기세포의 eRNA 회전에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.

Protocol

본 연구의 모든 실험은 마우스 배아 줄기세포(mESC; E14Tg2A)는 우리 실험실에서 직접 생성된 것이 아니라, ATCC(CRL-1821)에서 상업적으로 구할 수 있는 확립된 세포주에서 얻은 것입니다. 따라서 이 글에서 설명한 연구는 충남대학교의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)의 검토가 필요하지 않습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. mESC의 세포 배양

1. 6웰 세포 배양판에 0.1% 젤라틴(웰당 2mL)을 미리 코팅합니다. 플레이트를 37°C에서 10분간 배양하세요.
2. 젤라틴을 흡입한 후 각 웰을 1mL PBS로 한 번씩 세척하세요. 플레이트를 최소 15분 이상 자외선 조사로 소독하세요.
3. 완전한 2mL 세포배지를 사용하여 젤라틴 코팅된 플레이트에 mESC를 씨앗 부착합니다(표 1).
   참고: 실험에 필요한 총 배지 부피를 기준으로 사용 직전 요구된 농도로 배양지에 신선한 LIF를 첨가하십시오.

구성 요소	최종 집중	사용 볼륨
글래스고의 최소 필수 매체(GMEM)	-	500 mL
녹아웃™ 혈청 대체 요법(KOSR)	10%	50 mL
페니실린-스트렙토마이신	0.50%	2.5 mL
태아 소 혈청(FBS)	1%	5 mL
피루베이트나트륨	0.1 mM / 1%	5 mL
MEM 비필수 아미노산 용액(MnEA)	0.1 mM/ 1%	5 mL
2-머캅토에탄올	0.1 mM	910 uL
백혈병 억제인자(LIF)	1000 U/mL	-

표 1: mESC 배양 배양액의 조성. mESC 배양지를 준비하는 데 사용된 구성 요소와 최종 농도. 전체 배지 500mL당 일반적인 부피가 나열되어 있습니다.

4. 세포를 표준 배양 조건인 37°C, 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 유지합니다(그림 1A).

그림 1: eRNA 안정성 분석을 위한 실험 설계. (A) 전사 정지 실험의 도식. 세포는 0.1% 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트에 도판되어 수확 후 지정된 시점(0분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분)에 actD(최종 농도: 5 μg/mL)로 처리되었습니다. (B) RT-qPCR 분석법 레이아웃. 총 RNA는 무작위 헥사머 또는 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 역전사하였습니다. 각 시점의 cDNA 샘플은 RT-qPCR을 사용해 지시된 표적인 Tbp_mRNA, 유전자 간 eRNA, 유전자 내 eRNA에 대해 분석하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 액티노마이신 D (ActD) 치료

1. actD를 DMSO에 용해시켜 1 mg/mL 농도로³³ 농도로 스톡 용액을 준비합니다.
   참고: 여기서는 단기 전사 억제에 악티노마이신 D를 사용하지만, 향후 연구에서는 트립톨라이드와 같은 대체 억제제가 전사 시작을 차단하는 데 사용될 수 있습니다. 액티노마이신 D와 DMSO는 모두 빛에 민감하므로, 원정 용액을 호박 마이크로튜브에 준비하고 빛으로부터 보호한 후 -20°C에서 보관하여 사용 전까지 보관하세요.
2. 세포 씨앗 이틀 후(또는 수확 당일)에 actD 스톡 용액을 배양지에 최종 농도인 5 μg/mL³³으로 첨가합니다. 처리 후 0분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분 시점에 샘플을 채취하세요(그림 1A).
   참고: 대부분의 eRNA는 0-30분 범위 내에 빠르게 붕괴하지만, 일부 eRNA는 반감기가 더 길 수 있습니다. 목표 좌위의 특성에 따라, 붕괴 속도를 더 정확하게 포착하기 위해 장시간 시점(예: 1시간, 3시간, 6시간)에 추가 샘플링이 포함될 수 있습니다. 본 연구에서는 5 μg/mL 농도로 단기(≤30분) 전사 차단에 악티노마이신 D를 사용했으며; 하지만 더 긴 배양 기간(>1시간)의 경우, 세포 스트레스 반응을 최소화하기 위해 농도를 1-2 μg/mL로 낮추는 것이 권장됩니다. DMSO 자체가 전사 활성에 영향을 줄 수 있으므로 DMSO 단독 대조군도 포함되어야 합니다.

3. RNA 추출 및 cDNA 합성

1. 흡입으로 배양지를 제거하고, 각 웰에 1mL의 TRIzol 시약을 추가합니다. 플레이트를 셰이커 위에서 실온(RT)^34,35에서 10분간 배양한 후, 용해액을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   참고: TRIzol 처리 후 샘플은 RNA 추출 전 최대 일주일간 -80°C에 보관할 수 있습니다. TRIzol 시약에는 페놀과 구아니디늄 이소티오시아네이트가 포함되어 있어 매우 독성이 강하고 부식성이 강하므로 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 모든 TRIzol 폐기물은 적절한 폐기물을 위해 지정된 유기 용제 폐기물 용기에 수집되어야 합니다.
2. 각 샘플에 500 μL의 클로로포름을 첨가합니다. 튜브를 세게 흔들고 RT에서 3분간 배양하세요.
3. 샘플을 13,500 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리합니다.
4. 수상을 같은 부피의 이소프로판올이 들어있는 새로운 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. RNA 침전을 촉진하기 위해 RT에서 10분간 배양하세요.
   참고: 간기 오염을 피하기 위해 투명한 상부 수상만 조심스럽게 옮겨야 합니다. RNA 수율을 높이기 위해 이소프로판올을 첨가한 후 -20°C에서 1시간에서 하룻밤(O/N) 동안 샘플을 배큐하세요. 저투입 샘플의 경우, 이소프로판올을 추가하기 직전에 글리코겐(최종 10-20 μg/mL) 또는 글리코블루를 첨가하여 RNA 펠릿의 가시성과 회수 효율을 높이세요. 이소프로판올은 매우 가연성이 강하며 인체 건강에 잠재적으로 해롭습니다; 증기 흡입이나 피부 또는 눈과의 접촉은 자극, 두통, 어지러움, 중추신경계 억제를 유발할 수 있습니다. 조심하여 다루고, 남은 모든 용액은 승인된 유기 용제 폐기물 용기에 담아 적절히 처리하세요.
5. 샘플을 다시 13,500 × g에서 4 °C에서 10분간 원심분리한 후 상상액을 버립니다.
6. 생성된 RNA 펠릿을 75% 에탄올 1mL로 세척합니다. 원심분리기는 6,800 × g 에서 4 °C에서 5분간 가열합니다.
   참고: 에탄올을 첨가한 후 튜브를 부드럽게 뒤집어 펠릿을 들어 올립니다.
7. 상청액을 조심스럽게 제거하고 42 °C에서 10분간 자연 건조하세요. 건조 펠릿을 RNase 무첨가물에 재현탁한 후 55 °C에서 10분간 배큐합니다.
   참고: RNA 순도가 높을 때는 공기 건조 과정에서 흰색 펠릿이 반투명해질 수 있습니다. 펠릿을 10분 이상 과도하게 건조시키지 마세요. 과도한 건조는 부유 효율을 떨어뜨릴 수 있습니다.
8. 나노드롭 분광광도계를 사용해 RNA 농도와 순도를 측정합니다.
9. 제조사 지침에 따라 M-MLV cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA μg로부터 cDNA를 합성합니다(표 2).

구성 요소	사용 볼륨
10배 M-MLV RT 버퍼	2 uL
dNTP	2 uL
프라이머 (랜덤 / 올리도 dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
RNASE 억제제	0.5 uL
RNA 샘플	2ug (RNA 샘플 농도에 따라 부피가 조정됨)
DW	RNA 샘플 농도에 따라 최종 부피를 구성하기 위해 조정된 부피
총 부피	20 uL

표 2: cDNA 합성 반응(M-MLV 역전사효소)의 조성. M-MLV cDNA 합성 키트를 이용한 총 RNA 2 μg의 역전사에 사용된 상세한 부피와 시약. RNA 샘플의 부피는 농도에 따라 조정되었고, 뉴클레아제가 없는 DW를 첨가하여 최종 반응 부피를 20 μL로 만들었습니다.

10. cDNA 반응을 37°C에서 2시간 배양한 후, 85°C에서 5분간 열로 비활성화합니다.
    참고: 합성된 cDNA는 -20 °C에 저장하세요. 일반적인 cDNA 농도는 약 100 ng/μL입니다. 유전자 내 eRNA를 검출하기 위해, 동일한 RNA 샘플에서 무작위 헥사머 프라이머와 올리고(dT) 프라이머를 모두 사용하여 cDNA를 합성합니다.

4. 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

1. 15ng cDNA, 5 μL Power SYBR Green PCR 마스터 믹스, 각 프라이머 5 pmol, 증류수(DW)를 포함한 10 μL 반응 혼합물을 준비합니다.
   참고: eRNA 유전자좌위는 종종 반복 서열을 포함하거나 인접하여 신중한 프라이머 설계가 필요합니다. BLAST를 사용해 후보 영역을 제한하고 유전체 전반에 걸친 프라이머-쌍 특이성을 검증하기 위해 반복 마스크 서열을 사용합니다. 가능하다면 비특이적 증폭을 배제하기 위해 인근 제어 영역을 포함하세요.³⁶.
2. 실시간 PCR 시스템을 사용하여 증폭을 수행하라: 50°C에서 초기 활성화 및 변성 단계(2분, 95°C에서 10분), 이어서 95°C에서 15초간 변성, 60°C에서 어닐링, 신장 및 형광 측정을 1분³⁴초, ³⁷ (표 3).

무대	걸음	온도 (°C)	시간	주기
스테이지 대기	역전사	50	2분	1
	초기 변성	95	10분	1
PCR 단계	변성	95	15초	40
	어닐링/연장	60	1분	40
용융 곡선 단계	변성	95	15초	1
	어 닐 링	60	1분	1
	해리 (용융 곡선)	95	15초	1

표 3: RT-qPCR의 열 사이클링 조건. 역전사, 40사이클 qPCR(10 μL 반응), 표준 용융 곡선 분석을 위한 온도, 시간, 사이클 조건 요약.

3. 유전자 내 eRNA 정량을 위해서는 올리고(dT) 프라이머로 합성한 cDNA를 사용해 Tbp (또는 기타 하우스키핑/컨트롤 유전자)와 유전자 내 강화제 영역을 모두 분석합니다. 유전자 간 eRNA의 경우, 무작위 헥사머 프라이머로 합성한 cDNA만 사용한다(표 4 및 그림 1B).
   참고: 데이터 분석 시 평균 계산을 위해 각 샘플을 기술적 복제(두 개의 우정)로 분석하세요.

유전자명	프라이머 프로브	시퀀스(5'-3')	앰플리콘 크기
요약	전달	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122 BP
	후진	TTGCTGCTGTGTGTGTGTGTGTGT
Nsun2_mRNA	전달	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 BP
	후진	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	전달	TCCCTACAGCAGAGATCACTCAC	80 bp
	후진	CGCCGGTTAC타카택
Sox2_mRNA	전달	아카갓카아카갓카	105 BP
	후진	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	전달	CCTGAGGTGTGTGTGTGT	110 bp
	후진	AGGTTAACACATCACCCCCA
Pou5f1_eRNA	전달	카트그트크트트그	107 BP
	후진	CCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	전달	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 bp
	후진	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative 제어	전달	CCCCGTGTTTTTAAGAGGAATGA	88 BP
	후진	ACTGAGAACACACCCACTAGCA

표 4: RT-qPCR 분석을 위한 프라이머 서열. RT-qPCR 실험에서 각 표적 유전자의 특이적 증폭에 사용되는 순방향 및 역방향 프라이머 서열. 이 프라이머들은 mRNA와 eRNA 발현의 정확한 정량을 보장하기 위해 최적화되었습니다.

5. eRNA 안정성 데이터 분석 ²²

1. 모든 데이터를 ΔCt 방법으로 분석하고, 상대 eRNA 수준을 Tbp_mRNA로 정규화합니다(보충 파일 1 및 그림 2A).
   참고: 두 기술 복제 간 Ct 값 차이가 0.5를 초과하면 해당 데이터를 추가 분석에서 제외합니다. ΔCt 방법을 사용하여 상대 유전자 발현 수준을 대조 유전자의 Ct 값(예: Tbp_mRNA)에서 표적 유전자의 값을 빼서 계산합니다(ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). 상대 표현은 2^-ΔCt(보조 파일 2B)로 계산할 수 있습니다.
2. 유전자 내 eRNA 정량을 위해서는 무작위 헥머를 사용한 cDNA 값을 올리고(dT) 프라이머로 합성한 cDNA 값을 나누어 정규화합니다.
   참고: 모든 qPCR 반응은 세 개의 독립적인 생물학적 복제체(n = 3)를 사용하여 수행하십시오.
3. 각 시점의 표현 수준(ΔCt 방법으로 얻음)을 0 min 값으로 정규화하고 감쇠 곡선을 그립니다.
   참고: 이 프로토콜은 단기 액티노마이신 D 치료를 사용하지만, 전사 억제제(예: ActD)에 장기간 노출되면 하우스키핑 유전자 발현이 감소할 수 있습니다. 더 높은 정밀도의 정량화를 위해 세포 용해 단계에서 외부 스파이크인 RNA(예: ERCC)를 추가하여 RNA 추출 효율, 역전사 효율, 피펫팅 정확도의 변동을 보정하여 샘플 간 보다 일관된 정규화를 가능하게 할 것을 권장합니다^38,39.
4. 시간에 따라 eRNA 수준을 정규화하고 GraphPad Prism에서 비선형 회귀 모델(1상 지수 붕괴)을 사용해 적합시킵니다(보완 파일 3).
5. 개별 생물학적 복제체의 eRNA 반감기를 추정합니다.
   1. GraphPad Prism을 열고 XY> 생성 (옵션: X = 숫자; Y = 각 점마다 하나의 Y 값을 입력하고 그래프를 그립니다).
   2. 시간점(0, 5, 10, 15, 20, 30분)을 X축 값으로 입력하세요.
   3. Y축(그룹)에 샘플 이름을 적고, 각 시점별로 해당 단일 데이터 값을 입력하세요.
   4. 비 선형 회귀 > > 회귀 및 곡선 분석(곡선 적합도)을 선택하십시오.
   5. 지수 탭에서 1상 붕괴 모델을 선택하세요.
   6. 결과 표 시트에서 엑셀 또는 유사 소프트웨어를 사용해 각 샘플의 반감기 값의 평균 및 표준편차를 계산하세요. 결과 값을 그래프로 표시하세요.
6. 95% 신뢰구간을 가진 적합 감쇠 곡선
   1. GraphPad Prism을 열고 XY> 생성 (옵션: X = 숫자; Y = 나란히 서브컬럼에 3개의 복제 값을 입력하세요).
   2. 시간점(0, 5, 10, 15, 20, 30분)을 X축 값으로 입력하세요.
   3. Y축(그룹)에 샘플 이름을 적고, 각 eRNA 샘플의 세 가지 복제 값을 해당 데이터 시트에 입력하세요.
   4. 비 선형 회귀 > > 회귀 및 곡선 분석(곡선 적합도)을 선택하십시오.
   5. 지 수 탭에서 분석을 위해 1상 붕괴 모델을 선택하세요.
   6. 결과 표에서 3중 표본 분석에서 얻은 95% 신뢰구간(CI) 값을 추출합니다.
      참고: 다음 붕괴 방정식을 사용하세요: Y = (Y₀ - Pla토) • ^e-kt + Plateau, 여기서 Y는 시간 t의 상대 eRNA 수준, Y₀은 초기 eRNA 수준, k는 붕괴 상수입니다. eRNA 곡선 적합 시 고원을 0으로 고정하지 마세요. 이전 연구들은 eRNA가 시간이 지나도 완전히 분해되지 않고 지속될 수 있음을 보여줍니다^17,40. 그러나 mRNA 붕괴를 분석할 때는 이전 mRNA 프로토콜^41,42를 따라 고원을 0으로 고정하세요. GraphPad Prism이 eRNA 반감기(t₁/₂)를 다음과 같은 공식으로 자동으로 계산할 수 있도록 허용합니다: t_1/2 = In(2)/ k. 시간을 분(min)으로 입력하세요; 결과된 반감기 값을 최소 단위로 보고하세요.

Results

전사 정지 후 RNA 안정성을 평가하기 위해 mESCs는 actD로 처리되었고, 정해진 시점(0분, 5분, 10분, 15분, 20분, 30분)에 총 RNA를 수집하였습니다. cDNA 합성 후, RT-qPCR을 통해 Nsun2 와 Sox2의 유전자 내 eRNA, Pou5f1의 간간 eRNA 및 이에 대응하는 mRNA를 정량하였습니다. 이 데이터는 시간 의존 열화 곡선을 생성하는 데 사용되었습니다(그림 2). 성공적인 실험에서 mESC의 eRNA는 actD 처리 후 5분 이내에 발현이 급격히 감소하는 경향이 있었으며, mRNA는 더 안정적이어서 감소 정도가 적고 30분 이상 비교적 안정적인 수준을 유지했습니다.

Discussion

이 프로토콜은 mESC에서 eRNA 안정성을 측정하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제시합니다. 세포 배양, 악티노마이신 D 처리, RNA 추출, RT-qPCR 정량 등 중요한 실험 단계들이 도표와 보조 파일에 명확하게 설명되어 있어 사용자가 작업 흐름을 안내할 수 있도록 돕습니다. 또한, 비선형 회귀 모델링과 신뢰구간 해석과 같은 상세한 분석 절차가 보조 파일 4 에 제공되어 정확한 반감기 추정을 지원합니다. 이 단계들 중에는 정확한 타이밍과 actD 처리의 일관된 처리가 필수적인데, 이는 eRNA와 같은 불안정한 전사체의 검출에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다. 샘플 채취의 지연이나 불일치는 붕괴 속도론을 크게 왜곡하고 결과의 재현성을 저하시킬 수 있습니다. 이 때문에 의미 있고 해석 가능한 데이터를 생성하기 위해서는 지정된 타이밍 전략을 엄격히 준수하는 것이 매우 중요합니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-머캅토에탄올	깁코	21985023
액티노마이신 D	시그마-올드리치	A9415
클로로포름	대정화학	2548-4105
DMSO	젠디포	D2680
태아 소 혈청(FBS)	시그마-올드리치	F0392
젤라틴	시그마-올드리치	G1890-100G
글래스고' 최소 필수 매체(GMEM)	깁코	11710035
그래프패드 프리즈 (버전 9)	그래프패드 소프트웨어
이소프로파놀	대정화학	5035-4105
녹아웃 혈청 대체 요법(KOSR)	깁코 & nbsp;	10828028
백혈병 억제인자(LIF)	머크	ESG1106
MEM 비필수 아미노산 용액(MnEA)	웰겐	LS005
M-MLV cDNA 합성 키트	효소학	EZ006S
옵티젠 나노큐 플러스	클랩	01-QI685-M-16-C
페니실린-스트렙토마이신	웰겐	LS202-02
전원 SYBR-Green PCR 마스터 믹스	응용 생명 시스템	4368708
QuanStudio1 실시간 PCR 시스템	응용 생명 시스템	A40425
피루베이트나트륨	웰겐	LS013
트리졸	인비트로젠	15596018