K562 세포의 후성유전학적 공학: dCas9-DNMT3A 및 -HDAC1 융합 단백질을 사용한 안정적인 표적 DNA 메틸화를 위한 이중 벡터 에피솜 전략

요약

이 프로토콜은 K562 세포에서 표적 후성유전학적 편집을 위한 비통합적 에피솜 CRISPR/dCas9 기반 시스템을 설명하며, dCas9-DNMT3A 및 dCas9-HDAC1 이펙터를 특정 sgRNA와 결합하여 유전자좌 특이적 DNA 메틸화를 정밀하게 유도하고 표적 이탈 효과를 감소시킵니다.

초록

유전자 전사 조절에서 DNA 메틸화의 정확한 역할을 조사하고 특정 유전자 메틸화 패턴을 표적으로 하는 치료법을 개발하는 것은 유전자 발현을 조절하기 위한 부위 특이적 및 장기 후성유전학적 변형을 유도할 수 있는 다목적 도구의 부족으로 인해 상당한 과제를 제시합니다. 이 연구는 기초 후성유전학 연구와 치료 응용 모두에 잠재적으로 유용한 표적 유전자 유전자좌에서 안정적인 DNA 메틸화를 촉진하는 혁신적인 에피솜 기반 시스템을 개발하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 이를 달성하기 위해 K562 세포주를 두 개의 서로 다른 에피솜 벡터로 공동 형질감염했습니다. 두 벡터 유형 모두 ZBTB7A 유전자의 상류에 위치한 CpG 섬 326 내의 367bp 메틸화되지 않은 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)를 발현하도록 조작되었습니다. 각 벡터는 DNA 메틸트랜스퍼라제 DNMT3A(dCas-DNMT3A-CD) 또는 전장 히스톤 데아세틸라제 HDAC1(dCas-HDAC1)의 촉매 도메인에 융합된 비활성화된 형태의 엔도뉴클레아제 Cas9(사상 또는 dCas9)를 암호화했습니다. dCas 서열에는 단백질의 핵 수입을 보장하기 위한 두 개의 핵 국소화 신호(NLS)가 포함되었습니다. 이 이중 시스템 발현 카세트는 잠재적으로 장기적인 후생유전학적 침묵에 도움이 되는 염색질 상태를 촉진하여 강력하고 내구성 있는 후생유전학적 결과를 약속합니다. 자가 복제 에피솜 벡터의 활용을 통한 숙주 후성유전체에 대한 이러한 개입 접근 방식은 숙주 게놈에 통합되지 않고 여러 세포 분열에 걸쳐 낮은 복제 수로 벡터를 유지 및 발현하여 표적 이탈 효과를 최소화하고 게놈 무결성을 보존하는 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 표적 ZBTB7A CpG 섬 326에서 DNA 메틸화의 정확하고 유의미한 증가를 보고합니다. 연구 결과는 조작된 에피솜 CRISPR/dCas 시스템이 내구성 있는 부위 특이적 DNA 메틸화를 유도할 수 있음을 검증합니다. 따라서 이 시스템은 표적 메틸화 변화의 기능적 효과를 평가하기 위한 귀중한 연구 도구이자 미래의 후성유전학적 치료법 개발을 위한 유망한 플랫폼입니다.

서론

DNA 메틸화 및 히스톤 변형을 포함한 후생유전학적 조절은 유전자 발현, 세포 분화 및 게놈 안정성을 제어하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이러한 메커니즘의 조절 장애는 종종 원인 또는 결과로서 다양한 병리학적 상태, 특히 암, 신경 장애 및 각인 증후군에 관여합니다 ^1,2,3. 특히, 후성유전체 편집 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술을 사용하여 특정 게놈 유전자좌의 후생유전학적 환경에 정확하게 개입함으로써 기본 DNA 서열을 변경하지 않고도 유전자 녹아웃 모델에서 관찰되는 것과 유사한 유전자 억제 수준을 달성할 수 있습니다⁴. 그 결과, 표적 후성유전학적 편집은 유전자 조절 메커니즘을 해부하고 정밀 치료제를 개발하기 위한 유망한 전략으로 부상했습니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제와 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제는 현재 임상용으로 승인된 후성유전학적 치료법입니다. 그러나 이러한 제제는 게놈 전체의 후생유전학적 마커를 비선택적으로 표적으로 삼아 전반적인 염색질 상태를 변경하여 환자에게 표적 이탈 효과 및 독성을 유발합니다⁵. 전통적인 후성유전학적 변형제의 한계를 해결하기 위해, DNA 메틸트랜스퍼라제(예: DNMT3A), 데메틸라아제(예: TET1), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(예: p300) 또는 데아세틸라제(예: HDAC3)와 같은 이펙터 도메인에 융합된 촉매 사멸 Cas9(dCas9)를 기반으로 하는 프로그래밍 가능한 후생유전학적 편집기가 개발되었습니다 6,7,8,9 . dCas9-이펙터 시스템은 표적 서열에 이중 가닥 절단을 도입하지 않고 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 알려진 작은 RNA 분자에 의해 유도되는 유전자좌 특이적 후성유전체 변형을 허용합니다. 최근 연구에서는 유전자 발현 수정, 염색질 접근성 리모델링, 심지어 세포 표현형 재프로그래밍에 사용됨이 입증되었습니다 10,11,12.

급속한 발전에도 불구하고 dCas9 기반 후성유전체 공학 시스템은 계속해서 몇 가지 한계에 직면해 있습니다. 가장 일반적인 문제는 후생유전학적 이펙터 도메인의 비특이성으로 인한 표적 이탈 효과이며, 특히 dCas9 융합 도구의 강하거나 장기간의 발현과 함께^13,14. 또한 dCas9 융합체의 크기가 크기 때문에 전달 문제가 크게 발생합니다. Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9) 서열의 크기는 약 4.2kb15이며, 이는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 최대 용량 크기와 비슷합니다. 렌티바이러스 벡터는 상대적으로 큰 용량(~12-1kb)을 가지고 있어 후생유전학적 이펙터와 융합된 전장 SpCas9의 전달이 가능하지만, 여전히 무작위 게놈 통합의 가능성을 유지하여 삽입 돌연변이 유발의 위험을 감수하고 임상 적용을 제한합니다¹⁶. 반면, 플라스미드 형질감염과 같은 비바이러스 접근법은 분열 세포에서 유지율이 좋지 않습니다. 일시적 또는 "뺑소니" 전달 접근법은 게놈 통합의 가능성을 배제하지만, 염색질 리모델링 또는 협동 이펙터와 결합하지 않는 한 세포 분열 전반에 걸쳐 메틸화 변화를 유지하지 못하는 경우가 많습니다 17,18,19.

이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 dCas9 융합 후성유전학적 이펙터를 전달하기 위해 비통합적 자가 복제 에피소좀 벡터 시스템(pEPI-S/MAR)을 사용했습니다. 이 벡터는 낮은 복제 수(세포당 ~1-2개)로 분열하는 세포에서 염색체외로 지속되어 과발현과 관련된 바람직하지 않은 기능을 최소화하기 위해 지속적이면서도 적당한 발현을 허용합니다^20,21. 에피좀의 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR) 요소는 핵 매트릭스와 상호 작용하여 세포 분열 동안 세포 핵에서 에피좀의 안정적인 유지에 기여합니다^22,23. 또한 pEPI 벡터 시스템은 바이러스 통합과 관련된 위험을 방지하고 포장 한계를 초과하지 않고 구조물을 전달할 수 있습니다.

최근 연구에 따르면 활성 히스톤 변형, 특히 H3K27 아세틸화(H3K27ac)로 특징지어지는 프로모터 영역은 종종 조작된 DNA 메틸화에 내성이 있는 것으로 나타났습니다. 히스톤 변형의 라이터 또는 지우개를 사용하여 히스톤 마크를 제거하거나 추가하고 동시에 DNMT3A를 통해 DNA 메틸화를 도입하는 조합 접근법은 일시적인 접근법에서도 유전자 억제의 안정성과 지속성을 증가시키는 것으로 나타났습니다^19,24. 이러한 통찰력을 바탕으로 우리는 dCas9-HDAC1 및 dCas9-DNMT3A를 공동 전달하고 인접한 유전 영역을 표적으로 삼으면 염색질 리모델링을 촉진하고 표적 조절 요소에서 보다 효율적이고 지속적인 메틸화를 촉진할 것이라는 가설을 세웠습니다.

본 연구에서는 K562 세포에서 낮은 내인성 메틸화와 비정상적인 H3K27ac 마크를 특징으로 하는 영역인 ZBTB7A의 CpG 섬 326에 표적화와 안정적인 DNA 메틸화를 전달할 수 있는 시스템을 설계하고 구축하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구의 목적은 저발현, 안정적, 비통합 pEPI 시스템을 사용하여 ZBTB7A 유전자의 상류에 있는 CpG가 풍부한 조절 영역을 표적으로 하는 sgRNA와 함께 각각의 고유한 후생유전학적 이펙터에 융합된 dCas9를 암호화하는 두 개의 에피소좀 구조물을 전달하는 것이었습니다. 그림 1에 도시된 바와 같이, K562 세포를 이러한 에피솜으로 공동 형질감염시키면 HDAC1이 국소 히스톤 아세틸화를 제거하여 DNMT3A에 의한 후속 DNA 메틸화를 촉진하여 조정되고 부위 특이적인 후성유전학적 변형을 초래하는 관심 있는 CpG 섬에 편집 복합체를 이중 모집할 수 있습니다.

여기에 설명된 시스템은 구조 크기, 안전 문제 또는 비용 제한으로 인해 바이러스 전달이 불가능한 응용 분야에 적합합니다. 다양한 sgRNA 및 이펙터 융합의 모듈식 클로닝을 지원하므로 다양한 표적 유전자좌에 적응할 수 있습니다. 현재 플라스미드 형질감염 및 항생제 선택을 견딜 수 있는 세포주에 대한 시험관 내 또는 전임상 연구에 가장 적합합니다. 우리의 구현에서 K562 세포에서의 에피솜 전달은 리포펙타민 기반 시약을 사용하여 달성되었고 G-418 선택에 따라 유지되었습니다.

프로토콜

1. sgRNA의 설계

1. 게놈 브라우저(예: UCSC 게놈 브라우저)를 사용하여 관심 유전자의 프로모터 영역 내에서 원하는 CpG 섬 또는 조절 CpG 부위를 식별합니다. 여기에서는 ZBTB7A 유전자의 CpG 섬 326(GRCh38)에 설계를 적용했습니다.
2. 온라인 CRISPR sgRNA 설계 플랫폼[예: CHOPCHOP 웹 도구(버전 3)]을 사용하여 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계합니다. sgRNA를 설계할 때 아래 권장 사항을 따라 높은 표적 활성과 최소한의 표적 효과를 보장하십시오.
   1. Sp Cas9단백질을 엔도뉴클레아제로 선택하고 5'-NGG-3'을 3' 말단의 프로토스페이서 인접 모티프로 사용합니다(PAM-3').
   2. sgRNA 길이를 20bp로 선택합니다(PAM 서열 제외). 프로토스페이서 시퀀스에서 3개의 불일치만 있는 오프 타겟 일치를 허용합니다.
   3. 유전자의 특정 영역을 표적으로 삼도록 선택할 때, '프로모터' 옵션을 선택하고 업스트림 범위(예를 들어, CpG 아일랜드 326의 경우 1500bp 내지 3000bp 업스트림)를 정의하여 sgRNA를 조절 영역 내에 배치한다.
   4. Doench et ^al.25에서 개발한 것과 같은 표적 효율성 점수를 사용하여 sgRNA 활성을 평가합니다.
3. 실험용으로 sgRNA를 선택할 때 다음 기준을 고려하십시오.
   1. 표적 영역에 대한 효율성에 따라 모든 후보 sgRNA의 순위를 매깁니다. 예측 효율의 상위 10-20%에 속하는 sgRNA를 선택합니다. 선택할 때 잠재적인 오프 타겟 부위에서 불일치(MM0, MM1, MM2, MM3)가 있는 sgRNA를 피하십시오.
   2. dCas9-DNMT를 사용하여 전사 억제를 위해 원래 메틸화되지 않았거나 약하게 메틸화된 영역을 표적으로 하는 sgRNA를 선택하십시오. dCas9-HDAC를 사용한 전사 억제의 경우 효율성을 높이기 위해 고도로 아세틸화된 영역을 표적으로 삼습니다. 온라인 데이터베이스(예: ChIP-Atlas)를 사용하여 표적 유전자좌의 K562 세포에서 DNA 메틸화 및 히스톤 아세틸화 마크를 확인합니다.
   3. 여러 sgRNA를 사용하여 100-200 bp보다 큰 표적 영역을 커버합니다²⁶.
      참고: 후성유전학적 변형(메틸화 및 탈아세틸화)은 sgRNA 결합 부위의 상류 및 하류 영역에 영향을 미치며 이러한 효과는 짧은 게놈 범위로 제한될 수 있습니다.
   4. GC 함량이 40%에서 80% 사이인 sgRNA를 선택하십시오.
      참고: GC 함량이 높을수록 RNA 안정성과 dCas 결합이 향상되므로 sgRNA의 GC 함량이 중요합니다.
   5. 4개 이상의 티미딘(Ts)을 포함하는 sgRNA를 피하고 PAM 부위의 상류에 4개의 염기가 위치한 아데닌 또는 티민 뉴클레오티드가 있는 sgRNA를 선택합니다.
      참고: 4개 이상의 T는 조기 전사 종료로 이어질 수 있습니다. PAM 부위의 상류에 4개의 염기가 위치한 A 또는 T가 있는 sgRNA는 더 강한 dCas 결합을 나타낼 수 있습니다.
   6. 2차 구조 형성의 위험을 최소화하기 위해 자기 상보성이 높은 sgRNA를 확인하고 피하십시오.
   7. 몇 개의 sgRNA 서열 선택을 완료합니다.
      참고: 4개의 sgRNA가 CpG 섬 326에 걸쳐 설계되었습니다. CpG 섬(326)에 걸친 sgRNA1-4 표적 서열 및 표적 위치는 보충 표 1에 도시되어 있다.
4. 선택한 sgRNA 서열(PAM 삼중항 제외)을 역보체로 변환합니다. GATCG를 순방향 서열의 5' 말단에, G를 3' 말단에, AAAAC를 역상보 서열의 5' 말단에, C를 3' 말단에 추가합니다. 상업용 올리고 공급자로부터 각 sgRNA에 대한 두 개의 최종 올리고를 주문합니다.

2. 복제

참고: 이 섹션에서는 dCas-후생유전학적 이펙터 융합 및 sgRNA 발현 카세트를 모두 운반하는 에피솜 벡터를 생성하기 위한 플라스미드 pEPI-1의 조정에 대해 설명합니다. 복제 워크플로우 및 벡터 아키텍처에 대한 포괄적인 개요는 그림 2 를 참조하십시오. 아래에 설명된 모든 제한 소화 및 결찰 반응은 사용된 각 효소 및 시약에 대해 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 수행되었으며, 반응 사양은 보충 표 2에 자세히 나열되어 있습니다.

1. eGFP(향상된 녹색 형광 단백질) 코딩 서열 옆에 있는 AgeI 및 BspEI를 사용하여 pEPI-1 플라스미드를 분해합니다. 제한 분해 후, DNA 중합효소 I.의 Klenow 단편을 사용하여 생성된 돌출부를 무디게 합니다. T4 DNA 리가아제를 사용하여 무딘 말단 플라스미드 백본을 연결하여 eGFP 결실 벡터를 생성합니다.
   참고: eGFP 유전자의 결실은 전체 벡터 크기를 줄이기 위해 수행됩니다. 벡터 크기가 클수록 다운스트림 클로닝 및 형질감염 단계가 제한될 수 있습니다.
2. DNMT3A 유전자의 촉매 도메인(CD)과 HDAC1 유전자의 전체 길이에 대한 코딩 서열을 얻습니다. 각 코딩 시퀀스의 3'(다운스트림) 끝에 중지 코돈을 추가합니다. 서열 옆에 제한 부위 BglII(5') 및 AseI(3')를 추가합니다.
3. eGFP 결실 pEPI-1 벡터를 BglII 및 AseI로 분해합니다. 별도로, 준비된 DNMT3A(CD) 및 HDAC1 코딩 서열을 동일한 효소로 분해합니다. 두 가지 독립적인 결찰 반응을 수행합니다.
   1. DNMT3A(CD) 단편을 분해된 벡터에 연결하여 pEPI-1-DNMT3A 구조물을 생성합니다.
   2. HDAC1 단편을 분해된 벡터에 연결하여 pEPI-1-HDAC1 구조물을 생성합니다.
      참고: BglII 및 AseI 부위는 최적의 발현을 위해 pCMV 프로모터의 하류와 S/MAR 요소의 상류에 삽입물을 배치합니다.
4. 화학적으로 유능한 대장균(예: NEB 5-알파 유능한 대장균, 고효율)을 각 벡터의 결찰 산물로 개별적으로 형질전환합니다. 형질전환된 세포를 카나마이신(50μg/mL)을 함유한 LB 한천에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 양성 콜로니를 선택하고 급속 끓이는 미니프렙 방법^27,28을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다.
5. 촉매적으로 사운 SpCas9(dCas9)를 암호화하는 서열을 얻습니다. 지정된 순서로 다음 요소를 도입합니다.
   1. 5' 말단: AscI 제한 부위, Kozak 합의 서열 및 시작 코돈(ATG).
   2. 3' 끝: NLS, 선택적으로 HA 태그, BamHI 제한 사이트.
6. AscI 및 BamHI로 pEPI-1-DNMT3A 및 pEPI-1-HDAC1 벡터를 모두 분해합니다. dCas9 인서트에 대해 동일한 분해를 수행합니다. dCas9 단편을 각 벡터에 연결합니다.
   참고: AscI/BamHI 부위는 dCas9가 pCMV 프로모터의 바로 다운스트림인 DNMT3A 또는 HDAC1의 업스트림에 삽입되도록 합니다. 올바른 판독 프레임을 유지하기 위해 dCas9와 후성유전학적 이펙터 사이에 짧은 링커 또는 몇 개의 뉴클레오티드가 존재하는지 확인하십시오.
7. 최종 결찰 산물을 플라스미드 발현을 엄격하게 제어하는 고효율 유능한 대장 균 균주(예: NEB 5-alpha F'Iq Competent E. coli, High Efficiency)로 변환합니다. 카나마이신 플레이트에서 형질전환체를 선택합니다. 급속 끓이는 미니프렙 방법을 사용하여 양성 클론에서 고품질 플라스미드 DNA를 준비합니다.
8. 나노포어 시퀀싱을 사용하여 최종 플라스미드 구조물(pEPI-1-dCas9-DNMT3A 및 pEPI-1-dCas9-HDAC1)를 시퀀싱하여 모든 구성 요소의 올바른 조립을 확인하고, 온라인 번역 도구(예: Expasy 번역 도구 3.0)를 사용하여 판독 프레임을 확인하고, 온라인 정렬 도구(예: BLAST 정렬 도구)를 사용하여 잠재적인 돌연변이 또는 재조합 이벤트를 확인합니다.
   참고: 큰 벡터는 재조합이 더 쉬우며 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 따라서 철저한 서열 검증이 필수적입니다.
9. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 순방향 및 역방향 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 그룹을 인산화합니다. 혼합물을 90°C로 몇 분 동안 가열하여 2차 구조를 변성시킴으로써 두 개의 상보적인 가닥을 혼성화한 다음 이중 가닥 DNA로 완전히 어닐링하기 위해 밤새 실온으로 점진적으로 냉각합니다.
10. 선택한 pGuide sgRNA 발현 벡터를 BamHI 및 Esp3I로 분해합니다. T4 DNA 리가아제를 사용하여 어닐링된 이중 가닥 sgRNA 단편을 선형화된 벡터로 연결합니다.
11. 특정 PCR 프라이머(보충 표 3)를 사용하여 (1) U6 프로모터, (2) 클로닝된 sgRNA 서열 및 (3) sgRNA 스캐폴드를 포함하는 전체 gRNA 발현 카세트를 증폭합니다. 3' 오버행을 생성하지 않는 고충실도 DNA 중합효소(즉, 교정 중합효소)를 사용하여 다운스트림 클로닝에 적합한 깨끗하고 무딘 종단 PCR 산물을 보장합니다.
12. 섹션 1에서 설계된 각 개별 gRNA에 대해 2.9-2.11단계를 반복합니다. 표적 특이성을 유지하기 위해 각 gRNA 카세트가 별도로 준비되고 증폭되었는지 확인하십시오.
13. 벡터 pEPI-1-dCas9-DNMT3A 및 pEPI-1-dCas9-HDAC1을 SacII로 분해합니다. DNA 중합효소 I.의 Klenow 단편을 사용하여 끈적끈적한 말단을 무디게 합니다. T4 리가아제를 사용하여 이전에 증폭된 U6 프로모터-sgRNA-스캐폴드 카세트를 이러한 벡터에 복제합니다.
    참고: 여러 gRNA-후생유전학적 이펙터 조합(예: sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1 등)이 실험 단계에서 구성되었습니다. 그러나 후속 섹션에서 제시된 실험을 위해 선택된 두 가지 조합만 진행되었습니다.
14. 최종 결찰 산물을 플라스미드 발현을 엄격하게 제어하는 고효율 유능한 대장균 균주로 변환합니다. 카나마이신 플레이트에서 형질전환체를 선택합니다. 급속 끓이는 미니프렙 방법을 사용하여 양성 클론에서 고품질 플라스미드 DNA를 준비합니다.
15. 나노포어 시퀀싱을 사용하여 최종 플라스미드 구조를 시퀀싱하고, 판독 프레임을 확인하고, 잠재적인 돌연변이 또는 재조합 이벤트를 확인합니다.

3. 세포 배양 및 형질감염

1. T-75 배양 플라스크에서 K562 세포를 37°C, 5% CO₂ 및 습도 조건에서 유지합니다. 10% 소 태아 혈청(FBS), 1× 페니실린/스트렙토마이신 용액(Pen/Strep)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)을 사용하십시오.
2. 형질감염을 위한 플라스미드 준비:
   1. 형질감염당 총 플라스미드 DNA 8μg을 사용하므로 2개의 플라스미드의 공동 형질감염을 위해 각 플라스미드 4μg을 사용합니다. 260nm에서 흡광도를 사용하여 DNA를 정량화한 다음 필요한 양을 90μL의 초순수에 희석합니다.
   2. 희석된 DNA에 10μL의 3M 아세테이트나트륨 용액과 2.5부피의 100% 에탄올을 첨가합니다.
   3. 완전히 혼합하고 -20°C에서 밤새 배양하여 DNA를 침전시킵니다.
      참고: 서로 다른 gRNA-후성유전학적 이펙터 조합(예: gRNA1-dCas9-DNMT3A 및 gRNA2-dCas9-HDAC1)으로 두 플라스미드를 공동 형질감염할 때, 다운스트림 절차의 취급을 단순화하기 위해 두 플라스미드를 동일한 침전 튜브에 결합하는 것이 좋습니다.
   4. 다음날, DNA 침전 튜브를 11,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
      참고: 이 단계에는 살아있는 세포 취급도 포함되므로 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
   5. 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 70% 에탄올 500μL를 첨가하여 펠릿을 세척합니다. 11,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   6. 에탄올 상층액을 완전히 제거합니다. 눈에 보이는 에탄올이 남지 않을 때까지 펠릿을 자연 건조시킵니다.
   7. 건조된 DNA 펠릿을 50μL의 DMEM에 완전히 재현탁합니다. 플라스미드-DMEM 용액은 사용할 때까지 4°C로 유지합니다.
   8. 1% 아가로스 겔에 준비된 에피솜 DNA(재현탁된 용액의 약 2.5μL)를 400ng씩 실행하여 형질감염 전에 DNA 정제 및 무결성의 성공을 확인합니다.
3. 세포 준비:
   1. 배양이 50-60% 컨플루언트에 도달하면 T-75 플라스크에서 K562 세포를 수확하여 형질감염 효율을 보장합니다.
   2. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 2 × 10⁵ 세포가 포함된 부피를 FBS 또는 항생제 없이 900μL의 DMEM이 들어 있는 35mm 배양 접시로 옮깁니다.
      참고: 형질감염 절차의 모든 단계에 무혈청 DMEM을 사용하십시오. 형질감염 배양기가 완료된 후에만 전체 배지 배양 조건을 재개하십시오.
   3. 접시를 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 넣어 형질감염 준비가 된 세포를 유지합니다.
4. 플라스미드 전달을 위해 리포펙타민 기반 형질감염 키트를 사용하십시오. 사용된 특정 키트에 대한 제조업체의 지침을 따르고 필요한 경우 볼륨을 조정하십시오.
   1. 준비된 플라스미드-DMEM 용액에 3 μL의 P3000 시약(형질감염 키트에 제공됨)을 첨가합니다. 부드럽게 혼합하고 플라스미드-P3000 시약 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   2. 총 반응 부피 100μL에 도달할 수 있도록 충분한 DMEM과 함께 5μL의 Lipofectamine 3000 시약(형질감염 키트에 제공됨)을 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   3. 전체 100μL 형질감염 혼합물을 세포가 포함된 35mm 접시에 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 혼합물을 분산시킨 다음 접시를 인큐베이터로 되돌립니다.
5. 형질감염 후 24시간에, 형질감염된 세포의 증식을 시작하기 위해 각 35mm 접시에 3mL의 전체 배지(10% FBS 및 1× Pen/Strep이 보충된 DMEM)를 첨가합니다. 형질감염 후 72시간에, G-418 항생제를 최종 농도 1mg/mL로 첨가하여 선택 절차를 시작합니다.
6. 선택이 적절하게 확립되고 총 세포 수가 1 × 10⁶을 초과하면 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 단일 클론(그림 3A)을 분리합니다.
   1. 25°C에서 6 분 동안 300×g에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 1× 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, pH ~7.4)로 한 번 세척하고 동일한 조건에서 다시 원심분리합니다.
   2. 세포 펠릿을 1× PBS에 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 현탁액을 1 × 10⁶ cells/mL로 희석하여 철저한 재현탁을 보장합니다.
   3. 96웰 조직 배양 처리 플레이트를 수집 장치로 사용하여 FCS를 단일 세포 모드로 짧게 설정합니다(액적당 1개 세포 보장). 필요한 경우 사용하는 기기에 따라 소프트웨어 설정을 조정합니다(그림 3B).
   4. 예상 크기(FSC) 및 세분성(SSC)을 기반으로 기본 모집단을 게이트합니다. 파편(낮은 FSC/SSC) 및 고입 또는 죽은 물질(높은 SSC)을 제외합니다. FSC-A 대 FSC-H 또는 SSC-A 대 SSC-H 도트 플롯을 사용하여 일중항을 게이트합니다.
   5. 웰당 1mg/mL G-418을 포함하는 100μL의 전체 배지로 96웰 플레이트를 미리 채웁니다. 분류하기 전에 인큐베이터에서 플레이트를 데우십시오.
   6. 단일 셀 모드에서 정렬을 수행하고 정렬 속도를 초당 300개 미만으로 유지하여 정렬 정확도를 높입니다.
   7. 분류 후 현미경으로 웰을 검사하여 웰당 하나의 세포를 확인합니다. 플레이트를 5% CO₂가 있는 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
7. 단일 세포 클론이 96웰 플레이트에서 개별적으로 확장되도록 합니다. 클론 성장이 확립되면 G-418 농도를 400μg/mL로 줄여 선택을 유지합니다.
8. 잘 자라는 클론을 12웰 플레이트로 순차적으로 옮긴 다음 필요에 따라 T-25로, 마지막으로 T-75 플라스크로 각 클론이 ~1 × 10⁶ 세포에 도달할 때까지 옮깁니다.
9. 일정한 간격으로 이중 세포 펠릿을 수집합니다. 게놈 DNA 추출을 위해 펠릿을 -20°C에서 보관합니다. 또한 RNA 추출 및 cDNA 합성을 위해 500μL의 Trizol 시약에 균질화된 펠릿을 -20°C에서 보관합니다.
   주의: Trizol 시약은 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 화학 연기 후드에서 독성 및 부식성 특성으로 인해 주의해서 취급해야 하며, 오염된 물질에는 유해 폐기물 처리를 위해 라벨을 부착해야 합니다.
10. 전통적인 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 선택된 클론에서 게놈 DNA를 추출한 다음 에탄올 침전을 수행합니다.
    주의: 페놀:클로로포름은 독성과 부식성이 있으므로 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 화학 연기에서 취급해야 합니다. 페놀 및 클로로포름 함유 폐기물을 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.
11. DNA가 뉴클레아제가 없는 물 또는 TE 완충액에 완전히 재현탁되었는지 확인합니다. 다운스트림 응용 분야로 진행하기 전에 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다.
    참고: 이 DNA는 후성유전학적 편집 효율성을 평가하기 위해 PCR 및 파이로시퀀싱과 같은 다운스트림 실험에 사용됩니다.
12. Trizol 시약을 사용하여 세포 펠릿에서 총 RNA를 추출한 후 이소프로판올 침전을 수행합니다²⁹. RNase가 없는 시약과 일회용품을 사용하고 시술 중에 샘플을 4°C로 유지하여 RNA 샘플을 주의해서 취급하십시오.
    참고: 총 RNA는 역전사 키트를 사용하여 cDNA 합성에 사용됩니다.

4. 클론에서 두 에피좀의 존재를 확인하기 위한 PCR

1. 세포를 완전히 재현탁한 후 각 배양 클론에서 약 5 × 10⁵ 개의 세포를 수확합니다. 25°C에서 3분 동안 7,000 x g 에서 원심분리합니다. 상청액 배지를 버리십시오.
2. 1× PBS에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 동일한 조건에서 다시 원심분리합니다.
3. 상청액을 버리고 펠릿 수준 바로 위에 작은 부피를 남깁니다. 1 μL의 세포 현탁액을 PCR용 주형으로 직접 사용합니다.
4. 또는 형질감염된 클론에서 추출한 정제된 게놈 DNA 200ng를 사용합니다.
   참고: 세척된 세포의 직접 PCR은 신속한 스크리닝 방법을 제공하지만 다양한 결과를 산출할 수 있습니다. 더 높은 특이성과 민감도를 위해 정제된 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하십시오.
5. 표 1에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
6. dCas9 서열을 표적으로 하는 공통 순방향 프라이머와 각 후생유전학적 이펙터 벡터에 특이적인 별도의 역방향 프라이머와 함께 두 세트의 프라이머를 사용합니다(보충 표 3).
7. 표 2에 제시된 사이클링 조건을 따르십시오.
8. 아가로스 겔에서 PCR 산물을 실행하거나 모세관 전기영동으로 분석하여 제품 크기(DNMT3A 함유 벡터의 경우 230bp, HDAC1 함유 벡터의 경우 205bp)를 확인합니다(그림 3C). 예상 밴드 크기를 확인하고 PCR 효율성을 검증하기 위해 양성 대조군(10-20ng 농도의 두 플라스미드 혼합)을 포함합니다. NTC(템플릿 컨트롤 없음)를 포함합니다.

시약	최종 농도/양
10× 버퍼	1×
포워드 프라이머	1 μΜ
리버스 프라이머	0.5 μM
DNA	200ng
중합효소	1.25 유
dNTP	각 200 μM
물, 뉴클레아제 프리	50 μL까지

표 1: 에피좀 검증을 위한 PCR 반응 혼합물.

걸음	온도, °C	시간	사이클 수
초기 변성	95	3 분	1
변성	95	30초	30
어 닐 링	58	30초
확장	72	1 분
최종 확장	72	5 분	1

표 2: 에피좀 검증을 위한 PCR 사이클링 조건.

5. 표적 파이로시퀀싱 분석

1. 형질감염된 클론에서 추출한 gDNA(1.5μg)를 제조업체의 지침에 따라 중아황산염 전환 키트로 처리합니다.
2. 구조물이 표적으로 하는 규제 영역 내에서 CpG 부위 옆에 있는 프라이머를 설계합니다. 전용 중아황산염 프라이머 설계 도구를 사용하십시오. 다음 디자인 지침을 따르십시오.
   1. CpG 아일랜드 또는 CpG 사이트 규제 영역을 중아황산염 변환 버전으로 변환합니다.
   2. 중아황산염 변환 DNA의 PCR 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. 스트렙타비딘 코팅 비드에 고정하기 위해 하나의 프라이머(보통 그 반대)에 비오틴 라벨을 포함합니다.
   3. 관심 있는 첫 번째 CpG의 업스트림인 PCR 산물 내부의 시퀀싱 프라이머(18-25bp)를 설계합니다. 표적 영역으로, sgRNA 결합 부위의 업스트림 또는 다운스트림의 100bp 창을 선택하여 잠재적인 국소 후성유전학적 변형을 평가합니다.
   4. 편향되지 않은 증폭을 보장하기 위해 프라이머 서열 내의 CpG 부위를 피하십시오.
   5. Assay Design 소프트웨어 점수가 75% 이상이고 품질 등급이 '높음'(파란색)인 프라이머 쌍을 선택하여 소프트웨어 분석에서 문제나 우려 사항을 식별하지 못했음을 나타냅니다.
      참고: CpG 아일랜드 326을 표적으로 하도록 설계된 프라이머 서열에 대해서는 보충 표 3을 참조하십시오. 프라이머는 sgRNA1 및 sgRNA2 결합 부위 측면 영역에 결합하도록 설계되어 표적 유전자좌를 둘러싼 CpG 부위의 시퀀싱을 허용합니다.
3. 중아황산염 주형에 최적화된 고충실도 핫스타트 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 반응을 설정합니다.
4. 파이로시퀀싱 절차:
   1. 비오티닐화된 PCR 산물을 스트렙타비딘으로 코팅된 세파로스 비드에 결합하고 파이로시퀀싱 워크스테이션을 사용하여 단일 가닥 DNA를 분리합니다.
   2. 어닐링 완충액의 단일 가닥 DNA에 시퀀싱 프라이머를 추가합니다. 혼합물을 80°C에서 2분 동안 가열한 다음 점차적으로 실온으로 식힙니다.
   3. 파이로시퀀싱 기기와 프라이머 설계 중에 정의된 분배 순서를 사용하여 시퀀싱 반응을 수행합니다.
5. 데이터 분석:
   1. 전용 파이로시퀀싱 소프트웨어를 사용하여 각 CpG 부위의 메틸화 비율을 정량화합니다.
   2. 형질감염된 클론과 형질감염되지 않은 클론 간의 메틸화 수준을 비교합니다. 편집 효율성을 평가합니다(그림 3D). 각 개별 CpG 부위에서 처리되지 않은 대조군과 형질감염된 각 클론 간의 메틸화 수준을 비교하기 위해 양측 짝이 없는 t-테스트를 수행하는 것을 고려하십시오.

6. dCas 발현 분석을 위한 cDNA 합성 및 디지털 PCR

1. 형질감염된 클론에서 추출한 총 RNA(반응당 1,100ng)를 12μL의 RNase가 없는 물에서 준비합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 게놈 DNA 제거 혼합물을 얼음 위에 조립합니다: gDNA 와이프아웃 완충액 2μL, 총 RNA 1,100ng를 함유한 RNA 샘플 및 RNase가 없는 물을 최종 부피 14μL로 혼합합니다. 42°C에서 2분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다.
3. 얼음 위에 역전사 마스터 믹스 준비: RT 버퍼 4μL와 RT 프라이머 1μL를 혼합하고 역전사 효소 1μL를 첨가합니다.
4. 14 μL의 게놈 DNA 제거 믹스와 6 μL의 역전사 마스터 믹스를 결합하여 총 반응 부피 20 μL로 만듭니다. 부드럽게 혼합하고 42°C에서 15분 동안 배양합니다. 95°C에서 3분 동안 가열하여 역전사 효소를 비활성화합니다.
   참고: 추가 사용할 때까지 cDNA를 -20°C에서 보관하십시오.
5. 모든 샘플의 cDNA를 뉴클레아제가 없는 물로 1:1로 희석합니다. dCas 특이적 프라이머가 있는 디지털 PCR 시스템을 사용하여 다운스트림 디지털 PCR 분석에 희석된 cDNA를 사용합니다(보충 표 3).
   1. 표 3에 따라 4× 마스터 믹스와 반응 믹스를 준비합니다. 희석된 cDNA를 혼합물에 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합되도록 합니다.
      참고: 모든 복제본에 대해 최소한 중복된 반응을 설정합니다. 음성 대조군(처리되지 않은 K562 세포의 cDNA)과 NTC를 포함합니다.
   2. 반응 혼합물 9μL를 PCR 플레이트의 각 웰에 로드합니다. 표 4에 제시된 사이클링 조건을 사용하여 PCR 시스템을 설정합니다.
   3. 감지할 FAM 염료 채널을 선택하고 실행을 시작합니다.
   4. 완료 후 샘플을 검색하고 데이터를 분석합니다.
      참고: 디지털 PCR은 결과를 반응 μL당 복사본으로 보고합니다.
   5. 보고된 값(copies/μL)에 반응 부피(10μL)를 곱하여 반응당 총 cops를 얻습니다. 이 값을 반응의 cDNA의 양으로 나누어 ng cDNA당 사본을 얻습니다(ng RNA 입력과 동일).
      참고: 정확한 프로토콜을 따르는 경우 각 샘플은 20μL RT 반응(55ng/μL)에서 1,100ng의 RNA로 시작합니다. 1:1 희석 후 작동 농도는 27.5 ng/μL이며, 각 PCR 반응에 1 μL가 첨가되기 때문에 이는 반응당 27.5 ng의 cDNA(RNA 등가물)에 해당합니다.

마스터 믹스 (4×)
시약	최종 농도/양
25× SYBR 그린 염료	2×
5× 디지털 PCR 믹스	4×
물, 뉴클레아제 프리	100 μL까지
반응 혼합물
시약	최종 농도/양
4× 마스터 믹스	1×
포워드 프라이머	1 μΜ
리버스 프라이머	1 μΜ
cDNA(희석)	1 μL
물, 뉴클레아제 프리	10 μL까지

표 3: 4× dCas 발현의 디지털 PCR 분석을 위한 마스터 믹스 및 반응 믹스.

걸음	온도, °C	시간	사이클 수
초기 변성	96	10 분	1
변성	96	5초	40
어닐링/확장	60	15초

표 4: 디지털 PCR의 사이클링 조건.

결과

우리의 표적 후성유전학적 편집 도구가 ZBTB7A CpG 섬 326에서 부위 특이적 DNA 메틸화 변화를 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 먼저 DNMT3A(CD) 또는 HDAC1에 융합된 dCas9를 암호화하는 에피솜 벡터와 CpG 섬 326 내의 표적 부위로 설계된 다양한 sgRNA를 생성했습니다. 우리는 처음에 sgRNA와 이펙터 모듈의 동시 전달이 재현 가능한 후생유전학적 변형으로 이어질 수 있는지 여부를 평가하기 위해 K562 세포를 이러한 플라스미드의 조합과 공동 형질감염시켰습니다.

초기 에피소모르 공동 형질감염 전략 및 한계
우리는 먼저 4개의 에피솜 플라스미드를 동시에 공동 형질감염하려고 시도했습니다. dCas9-융합 후성유전학적 이펙터(pEPI-1-dCas9-DNMT3A 및 pEPI-1-dCas9-HDAC1)를 발현하는 Τwo 벡터와 CpG 섬 3...

토론

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 매우 특이적인 sgRNA의 설계입니다. 오프 타겟 효과는 CRISPR 기반 후성유전학적 편집 시스템의 알려진 한계이며, 이는 종종 dCas9 결합 불충실과 이펙터 도메인의 비특이적 활성으로 인해 발생할 수 있습니다. 이를 최소화하기 위해 sgRNA는 높은 표적 활성과 최소한의 표적 결합에 최적화된 생물정보학 도구를 사용하여 설계되어야 합니다³⁰. 설계 도구를 사용하고 예측된 표적 외 부위를 검증하는 것이 권장되며, 서로 다른 sgRNA를 운반하는 클론을 비교하면 진정한 표적 효과를 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 핵심 단계는 전장 효소³¹의 유지된 기능에 의한 내인성 상호 작용을 방지하기 위해 사용된 후생유전학적 조절제의 촉매 도메인만을 사용하는 것입니다. dCas 융합 시스템의 효과는 염색질 상태, 핵의 3D 구조 컨텍스트 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Absolute Q DNA 디지털 PCR 마스터 믹스 (5배)	응용 생명 시스템	A52490
AgeI-HF	NEB	R3552
ASCI	NEB	R0558
아세르	NEB	R0526
밤히-HF	NEB	R3136
BD FACS 멜로디 셀 분류기	BD
블글	NEB	R0144
BSPEEI	NEB	R0540
디옥시뉴클레오타이드(dNTP) 용액 혼합물 (각각 10 mM)	NEB	N0447
DMEM 고혈당 및 안정 글루타민, 피루브산 나트륨 미디엄 함께.	바이오웨스트	L0103
DNA 중합효소 I, 대형 (클레노우) 단편	NEB	M0210
DNMT3A (CD), HDAC1 서열	IDT
드림택 DNA 중합효소	써모 사이언티픽	EP0712
에픽텍트	치아겐	59104	비아황산 변환 키트
에피텍트 비아황산 키트	치아겐	59104
ESP3I	NEB	R0734
태아 소 혈청	깁코	A5256701
제네티신 선택적 항생제(G418 황산염)	깁코	11811031
리포펙타민 3000 형질염색 키트	인비트로젠	L3000015
NEB® 그리고 nbsp; 5-알파 유능함  대장균   (고효율)	NEB	C2987I
NEB® 그리고 nbsp; 5-알파 F'Iq  유능함  대장균  (고효율)	NEB	C2992H
핵스핀 조직 및 nbsp;	마셰레이-나겔	740952.50
PBS, 10배 용액 pH 7.4	론자	BE17-517Q
페니실린-스트렙토마이신 용액 100배	바이오웨스트	L0022
pGuide 벡터	오리진 테크놀로지	GE100042
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 25:24:1 10 mM Tris에 포화, pH 8.0, 1 mM EDTA	시그마-올드리치	P2069
프라이머, sgRNAs와 nbsp;	유로핀
파이로마크 분석 설계	치아겐	버전 2.0	비아황산염 프라이머 설계 도구
파이로마크 골드 Q24 시약	치아겐	970802
PyroMark PCR 키트	치아겐	978703
파이로마크 Q24 MDx	치아겐		파이로시퀀싱 워크스테이션 & nbsp;
파이로마크 Q24 소프트웨어	치아겐	v2.0.8	파이로시퀀싱 소프트웨어
Q5® 고충실도 DNA 중합효소	NEB	M0491
퀀티텍 역전사 키트	치아겐	205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 플레이트 키트	응용 생명 시스템	A52865	디지털 PCR 시스템
SYBR 그린 I 핵산 젤 스테인, DMSO 10,000배 농축액	인비트로젠	S7563
T4 DNA 리가제	NEB	M0202
T4 폴리뉴클레오타이드 키나제	NEB	M0201
트리졸 시약	인비트로젠	15596026