애기장대의 단세포 분석을 위한 조직 특이적 고품질 원형질 분리

요약

이 연구는 Arabidopsis thaliana의 뿌리, 잎, 줄기, 꽃 조직에 대한 향상된 원형질 분리 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 최적화된 효소 소화 및 정제 단계를 활용하여 세포 손상과 이물질을 최소화함으로써 수율을 높이고 단일 세포 방법(예: 단일 세포 RNA 시퀀싱)에 적합한 고품질 프로토플라스트를 얻습니다.

초록

단세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)은 식물생물학에서 세포 유형별 유전자 발현, 발생 역학, 그리고 환경 요인에 대한 조직 특이적 반응에 대한 고해상도 정보를 얻기 위한 필수 도구가 되었습니다. scRNAseq를 식물에 적용할 때 가장 큰 기술적 도전 과제는 세포벽 없이 생존 가능한 단일 세포를 효율적이고 재현 가능하게 분리하는 것으로, 이는 식물 조직의 이질성을 나타냅니다. 원형질 분리는 세포벽을 효소적으로 제거하여 단일 살아있는 식물 세포를 생성하는 방법으로, 이 목적을 위해 널리 사용되는 접근법입니다. 그러나 성공적인 원형질 분리는 세포 생존력을 유지하고 세포 유형별 전사체 프로필을 보존하기 위한 세심한 최적화가 필요합니다. 여기서는 지상(잎, 줄기, 꽃)과 뿌리 조직을 포함한 여러 Arabidopsis thaliana 조직에서 고품질 원형질체를 분리하는 견고하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 조직 유형의 독특한 생리학적 특성을 고려하여 효소 소화 조건과 정제 단계를 최적화하여 다양한 세포 유형의 높은 수율과 폭넓은 대표성을 보장합니다. 생성된 원형질체는 scRNAseq, 유세포분석(FACS), 일시적 유전자 발현 분석과 같은 응용에 적합합니다. 여러 조직 유형에서 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있게 해줍니다. 제시된 방법은 세포 이질성 탐구를 지원하고 식물 연구에서 단세포 접근법의 신뢰성을 높입니다.

서론

단세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)은 유전자 발현을 전례 없는 해상도로 분석할 수 있게 하여 식물 생물학에 혁신을 가져왔습니다. scRNAseq는 세포 유형별 특이적 해상도 ^1,2,3으로 세포 이질성, 발달 궤적, 환경 자극에 대한 반응에 대한 전사체 정보를 제공합니다.

동물 시스템과 달리, 단단한 식물 세포벽과 식물 조직의 구조적 복잡성은 전사체 분석을 위한 단일 세포의 효율적인 분리에 상당한 장애물이 됩니다. 이용 가능한 방법 중에서, 세포벽을 효소로 제거해 원형체를 생성하는 방법이 널리 사용되고 있으며, 이는 60년 이상 전에 개발되었습니다 ^4,5,6. 광범위하게 사용되었음에도 불구하고, 원형질체 분리는 세포 수량, 생존력, 안정적인 전사체의 균형을 맞추기 위해 조직별 최적화가 필요한 기술적으로 매우 까다로운 절차입니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)과 같은 대체 방법은 핵⁷을 분리하여 세포벽 소화를 피합니다. 하지만 이는 세포질 내에 존재하는 성숙한 전사체에 대한 정보를 잃는 대가를 치르게 됩니다. 기계적 및 레이저 보조 미세해부와 같은 다른 물리적 해리 방법은 효소 세포벽 소화를 피하지만 교차 오염에 취약하여 세포 생존율 저하와 처리량 제한을 초래할 수 있습니다 ^8,9,10.

최근 몇 년간 특히 애기장대를 위해 많은 식물 세포 아틀라스가 개발되어 다양한 조직의 전사체 경관에 대한 중요한 통찰을 제공합니다 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . 그러나 이 지도집들은 주로 어린 식물이나 묘목 단계의 식물을 기반으로 하며, 뿌리 조직이나 잎 조직에 초점을 맞추고 있습니다. 이 연구에서 사용되는 프로토콜은 성숙한 잎, 꽃, 줄기 등 오래된 애기장대 조직에 대한 최적화 과정을 요구합니다. 또한, scRNAseq 또는 형광활성화세포 분류(FACS)와 같은 세포 유형 특이적 시퀀싱 연구가 RNA 시퀀싱과 결합되기 전까지는, 원형체 분리가 일으킨 전사체 변화가 완전히 설명되지^{않았습니다.}

여기서 제시된 방법은 이전 연구를 기반으로 여러 중요한 개선점을 도입했습니다: 뿌리와 지상 조직(잎, 줄기, 꽃) 모두에 대한 완충 농도를 최적화하여 식물 조직 간 생리적·해부학적 변이성을 고려하고, 세포 손상을 최소화하고 원형질체의 순도를 향상시키기 위한 부드러운 정화 단계를 포함합니다. 핵 기반 접근법과 비교할 때, 이 방법은 세포 전사체를 유지하여 세포질 내에 존재하는 성숙한 mRNA 분자의 더 높은 해상도 정보를 얻을 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 중요한 점은, 이 절차가 꽃에서 약 9.8 ×^{10 3} cells/mg에서 잎에서는 2.2 ײ 2 cells/mg까지 높은 프로토라스트 생존력, 이질성, 재현 가능한 농도를 제공한다는 것입니다.

제시된 방법의 전반적인 목표는 Arabidopsis thaliana의 여러 조직에 맞춘 견고하고 재현 가능한 원형질 분리 프로토콜을 제시하는 것으로, 식물 단세포 연구를 위한 다양한 세포 유형을 아우르는 고품질 입력에 대한 중요한 수요를 충족하는 것입니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 완충 준비

1. 표 1에 따라 해당 원형질체 분리 완충액^{17, 18}을 15 mL 원심분리관 내에서 준비합니다; 뿌리 조직용 뿌리 원형질 분리 완충제 또는 지상 조직을 위한 꽃/줄기/잎 원형질 분리 완충제.
   참고: 5종의 수확한 애기장대(Arabidopsis thaliana ) 개화식물(11-12단계, 봉오리 봉오리) 대략적인 원형질 분리 완충제량: 뿌리(~ 375 mg): 7 mL, 잎(~930 mg): 5 mL, 줄기(~215 mg): 3 mL, 꽃(~10 mg): 2 mL.
2. 뿌리/잎 원형질 분리 완충액을 사용하기 전에 셀룰라제 RS 2%와 마세로자임 R10 1%를 새로 첨가합니다. 원형질 분리 완충제를 회전기 위에 올려 분말이 완전히 녹을 때까지 잘 섞으세요(25 °C에서 약 10분). 기포를 만들지 않고, 버퍼 안에 가루 덩어리가 남지 않도록 하세요.

2. 조직 소화

1. 사용 전에 해당 원형질 격리 버퍼를 0.2 μm 필터로 필터링하세요. 잎과 뿌리는 표준 크기의 페트리 접시(100 mm x 15 mm)를, 꽃과 같은 소량의 조직은 작은 크기의 페트리 접시(30 mm x 15 mm)를 사용하세요. 조직을 옮기기 전에 페트리 접시에 원형질 분리 완충제를 몇 방울 떨어뜨립니다.
2. 해당 조직을 페트리 접시에 옮긴 후, 면도날을 사용해 가능한 한 빠르게 수직으로 작은 조각으로 잘라냅니다(그림 1A).
   참고: 교차 오염을 방지하기 위해 샘플마다 항상 다른 칼날과 핀셋을 사용하세요. 면도날을 다룰 때는 보호용 장갑을 착용하세요.
3. 남은 원형질 분리 완충제를 해당 페트리 접시에 넣어 잘게 썬 조직을 담근 후 25°C에서 1시간 배양합니다. 지상 조직은 실험실 위에 보관하고(흔들림 없음), 근부 조직은 궤도 셰이커 플랫폼(60rpm)으로 옮겨 옮기세요.

3. 여과

1. 배양 후 뿌리 샘플:
   1. 파스퇴르 피펫을 사용해 페트리 접시에서 40 μm 셀 스트레이너로 옮기고, 미리 냉각된 50 mL 원심분리관 위에 올려놓습니다.
   2. 남은 원형체를 채취하기 위해, 동일한 양의 W5 용액(2 mM MES pH 5.7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl)을 같은 페트리 접시에 첨가하여 페트리 접시 바닥에 부착된 원형체를 수집합니다. W5 용액에 재현탁된 원형체를 미리 냉각된 50mL 원심분리관 위에 놓인 동일한 40 μm 셀 스트레이너로 옮깁니다.
   3. 새로운 40 μm 셀 스트레이너를 통해 새로 냉각된 50 mL 원심분리기 튜브로 두 번째로 통과시킵니다. 앞으로는 샘플을 얼려두고 원형체를 다룰 때는 매우 조심스럽게 다루세요.
2. 배화 후 지상 샘플:
   1. 파스퇴르 피펫을 사용해 페트리 접시에서 70 μm 셀 스트레이너로 전이하여 미리 냉각된 50 mL 원심분리관 위에 올려놓습니다.
   2. 남은 원형체를 수확하려면, 동일한 양의 W5 용액(2 mM MES pH 5.7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl)을 같은 페트리 접시에 첨가하여 페트리 접시 바닥에 부착된 원형체를 수집합니다. W5 용액에 재현탁된 원형체를 미리 냉각된 50 mL 원심분리관 위에 올려놓은 동일한 70 μm 셀 스트레이너로 옮깁니다. 앞으로는 샘플을 얼려두고 원형질체를 아주 조심스럽게 다루세요.

4. 세척 및 피콜 정화

1. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각한 후, 원심분리기 브레이크 설정을 전혀 하지 않은 상태에서 500 × g 에서 5분간 원형체를 수집(펠릿)합니다.
2. 원심분리 후 뿌리 샘플:
   1. 원형질 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 버리세요.
   2. 원형체를 파스퇴르 피펫 또는 절단 팁이 있는 1mL 길슨 피펫을 사용해 4°C의 600-700 μL 뿌리 부유액 완충제(효소 제외)와 W5 용액의 동률 뿌리 원형상체 분리 완충제에 부드럽게 재현탁합니다.
   3. 현탁액을 1.5mL 미리 냉각된 4 °C의 튜브로 옮깁니다.
3. 원심분리 후 지상 샘플:
   1. 상청액은 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 버리세요.
   2. 펠릿을 파스퇴르 피펫이나 1mL 길슨 피펫(잘라낸 팁이 있는 1mL 길슨 피펫)을 사용해 4°C의 600-700 μL 꽃/줄기/잎 재현탁 완충제(꽃/줄기/잎 분리 완충제와 W5 용액 동량)에 부드럽게 재현탁하여 절단을 방지합니다.
   3. 현탁액을 1.5mL 미리 냉각된 4 °C의 튜브로 옮깁니다.
   4. 1.5mL 튜브에 13.3% (w/v) Ficoll PM 400 용액 300 μL 준비합니다. 섞어서 얼음 위에 보관하세요.
   5. 재현탁된 원형질 샘플(600-700 μL)을 피콜 층을 건드리거나 혼합하지 않고 준비된 피콜 용액 위에 천천히 추가합니다.
   6. 원심분리기 4°C에서 700 × g 에서 5분간 원심분리기를 제로 브레이크 세팅 상태로 진행합니다.
   7. 중간 층(경계면)에 존재하는 원형질체와 상상(1층)을 함께 수집합니다(그림 1B). 피콜과 분리된 잔해가 포함된 하부 3층을 모으지 않도록 주의하세요. 추가 사용 전까지 4°C에서 보관하세요.

5. 카운팅 및 품질 검사

1. 노이바우어 혈구계로 분리된 원형질체 개수를 세기 위해 10 μL 원형질체 용액을 사용하세요.
   선택 사항: 원형체의 생존 가능성을 평가하기 위해 1% (w/v) Evans Blue 염료를 추가할 수 있습니다(그림 1C).
2. 원형질 용액을 해당 조직의 사전 냉각(4 °C) 부유액(근부 4.2.2단계, 지상 조직 4.3.2 단계에서 설명됨)을 사용하여 원형질체/mL 농도로 희석합니다.
3. 계획된 실험을 가능한 한 빨리 진행하세요. 예: 단세포 RNA 시퀀싱 및/또는 FACS^15,19.

결과

지상 및 근부 조직에 적용된 원형질 분리 프로토콜은 세포벽의 효율적인 소화와 모든 애기장대 조직에서 온전한 단일 세포의 방출을 성공적으로 가능하게 합니다. 꽃, 줄기, 잎, 뿌리 등 검사된 조직 유형에서 효소 소화 과정은 소화되지 않은 세포 그룹이 최소한으로 잘 분리된 원형체를 생성했다(그림 2A-D). Evans Blue 염료 분석은 구형 형태와 매끄러운 원형질막 경계를 가진 원형체가 생존 가능한 세포임을 확인했습니다(그림 1C). 각 조직 유형별로 구형 원형체를 집계하였다. 꽃은 평균 97,875개± 7,531개(9,788 세포/mg, n = 3), 줄기는 119,025개± 22,508개(550 세포/mg, n = 4), 잎은 210,483개± 15,572개(225 세포/mg, n = 3), 뿌리는 225,363 ± 52,561 개(599 세포/mg, n = 4)를 포함하고 있습니다.

원형체 현탁액은 세포 크기의 광범위한 분포와 녹색 또는 연한 색질 질의 존재를 보여주었으며, 이는 각 채취된 조직의 이질적인 세포 구성을 반영한다(그림 3A-D). 이를 확인하기 위해 형질전환 동반 세포 특이적 YFP 리포터 라인을 이용한 원형상체 분리가 수행되었고, 현탁액에는 동반 세포를 나타내는 YFP 신호를 가진 생존 가능한 작은 원형체가 포함되어 있었습니다(그림 3E). 이는 사용된 원형질 분리 프로토콜이 단단한 세포벽을 가진 혈관 세포에 적합함을 강조합니다.

제시된 최적화된 방법을 통해 성충 식물의 다양한 조직에서 최소한의 잔해로 많은 수의 생존 가능한 원형체를 분리할 수 있습니다. 지상 샘플의 정제를 개선하기 위해, 우리는 소화된 샘플에서 방출된 세포 소기관과 기타 세포 잔해를 제거하면서도 전사체 품질을 유지하기 위해 Ficoll 쿠션 세척 단계를 포함시켰습니다(그림 4).

원형질체에서 생성된 scRNAseq cDNA 라이브러리에서는 ACTIN2와 같은 고발현 하우스키핑 전사체와 캠비얼 및 분열조직 세포에 특이적인 표지인 항상도메인 전사인자 KNAT1과 같은 희귀/저발현 전사체, 그리고 동반 세포 표지인 SUC2 와 PARCL1 이 특정 cDNA PCR 분석법으로 검출되었습니다¹⁵ (그림 5)). 이는 얻어진 원형체 개체군의 광범위한 세포형 대표성과 이질성을 나타내며, 이 방법으로 생성된 scRNAseq 데이터를 분석하여 더욱 확인되었다¹⁵.

그림 1: 원형질 분리 단계의 워크플로우. 주요 6단계가 나와 있습니다: (1) 완충 준비, (2) 조직 소화, (3) 여과, (4) 세척 및 피콜 정제, (5) 계수 및 품질 관리, (6) 후속 실험 진행. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 원형질 준비 단계의 이미지. (A) 잎 샘플의 절단 단계의 대표적인 사진(Step 2.1). 위 이미지는 채취한 조직과 몇 방울의 완충제가 표준 크기의 페트리 접시에 담긴 모습, 그리고 절단용 면도날을 보여줍니다. 아래 왼쪽 이미지는 면도날로 몇 번 수직으로 긁은 후 조직을 나타냅니다(화살표 참조). 아래 오른쪽 이미지는 다음 단계를 위한 잘게 썬 샘플을 나타냅니다. (B) 1.5 mL 튜브 내 원심분리 후 Ficoll 쿠션 이미지(단계 4.3.7). 흰색 화살표는 원형체를 포함하는 중간 층을 나타냅니다. (C) Evans Blue 염료에 배양된 잎 원형체의 대표적인 현미경 이미지. 스케일 바: 250 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 생성된 원형체의 현미경 이미지. 각 조직 유형에서 원형상체 이미지가 표시됩니다. (a) 꽃, (b) 줄기, (c) 잎, (d) 뿌리. 스케일 바: 250 μm. (E) 동반 세포 특이적 YFP 리포터 라인의 공초점 현미경 이미지. 첫 번째 이미지(왼쪽)는 잎 혈관에서 YFP 동반 세포 리포터의 발현(녹색)을 나타냅니다. 두 번째 이미지(오른쪽)는 YFP 리포터(녹색 신호)를 발현하는 세포의 원형질체를 나타냅니다. 보라색/파란색은 엽록체 자가형광을 나타냅니다. 스케일 바 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 4: (A) 및 (B) 피콜 쿠션 세척 전후의 잎 원형체 현미경 이미지. 스케일 바: 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 5: scRNAseq 라이브러리의 품질 관리 PCR. 근과 지상 조직의 단일 세포 RNAseq 라이브러리의 품질 관리 PCR의 대표적인 겔 이미지. 유전자인SUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (각각 A부터 D까지)와 각 조직(꽃, 줄기, 잎, 뿌리)을 왼쪽에서 오른쪽으로 검사했습니다. cDNA(+)는 양성 대조군으로, 물은 음성 대조군으로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

뿌리 프로토플라스팅 버퍼	꽃/줄기/잎 프로토플라스팅 버퍼
600 mM 만니톨	400 mM 만니톨
2 mM MgCl2	-
0.1% BSA	0.1% BSA
2 mM CaCl2	10 mM CaCl2
2 mM MES pH 5.7	20 mM MES pH 5.7
10 mM KCl	20 mM KCl
필요하다면 1M Tris Base를 사용해 pH를 5.5로 조절하세요	필요하다면 1M Tris Base를 사용해 pH를 5.5로 조절하세요

표 1: 원형질 분리 완충 조성. 뿌리 및 지상(꽃, 줄기, 잎) 조직에 대한 원형질 분리 완충 레시피가 제공됩니다.

토론

이 최적화된 프로토콜은 다양한 애기장대 조직에서 원형체를 분리하기 위해 scRNAseq 응용에 맞춰져 세포질과 핵에 존재하는 전체 전사체를 분석했습니다. 조직 특이적 완충제의 최적화와 소화 및 정제의 추가 단계를 통해 다양한 조직에서 견고하고 재현 가능한 수율이 달성되었습니다. 구체적으로, 꽃 원형체는 샘플당 평균 ~98,000 세포(~9,788 세포/mg), 줄기 원형체는 ~119,000 세포(~550 세포/mg), 잎 원형체는 ~210,500 세포(~225 세포/mg), 뿌리 원형체는 ~225,000 세포(~599 세포/mg)로, 이들 조직의 구조적·생리학적 다양성을 반영합니다.

이 프로토콜의 핵심 개선점은 정화를 위해 일반적으로 사용되는 자당 기반 그라디언트/쿠션 대신 Ficoll 기반 쿠션을 사용한 것입니다. 세포가 흡수하며 전사체 13,20,21에 큰 영향을 미치는 자당과 달리, 피콜은 삼투압 불활성과 막 불투과성으로 분리 과정에서 RNA 무결성을 보존합니다. 이 단계는 또한 부탁액 내 파손된 세포와 세포 잔해에서 엽록체와 같은 자유 소기관의 수를 줄였습니다. 이러한 이물질의 존재는 마이크로유체 장치의 채널을 막거나 형성된 방울에 여러 세포가 존재하게 하여 방울 형성에 방해가 될 수 있으며, 이는 주변 RNA 오염에 기여합니다. 이 모든 요인들은 scRNA-seq 데이터 분석에서 잘못된 결론이나 편향을 초래할 수 있습니다.

원형질체 분리가 식물 세포 2,15,16,19의 전사체를 변화시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에서 이 인위물질을 최소화하기 위한 핵심 전략은 효소 소화 후 원형질체를 얼음 위에서 4°C로 유지하는 것으로, 이는 대사 및 전사 활동을 늦추어 원형질 분리와 관련된 전사 변화를 감소시킵니다. 또한, 조직 채취 시간을 복제 간에 일관되게 유지하고 연구 목표와 일치시키는 것이 매우 중요한데, 시기의 변동이 원형질 유도 유전자와 scRNA-seq 데이터셋에서 검출된 생체 조절 전사체 모두에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문입니다¹⁵.

이 방법에서는 최소한의 잔해로 단일 세포를 생성하는 것 외에도, 조직의 이질성을 유지해 모든 세포 유형을 잠재적으로 대표할 수 있도록 하는 것이 매우 중요한 점이었습니다. 원형체 현탁의 다양성은 원형체의 다양한 형태, 즉 크기의 차이와 얻은 개체군 내 세포 유형 특이적 리포터 라인의 신호 존재 등을 통해 확인되었습니다(그림 2). 또한, 원형질 집단은 PCR을 이용해 scRNA-seq cDNA 라이브러리에서 희귀하고 세포 유형별 특이적 전사체와 하우스키핑 전사체를 검출하여 평가하였습니다(그림 4). 여기에는 새순 꼭대기 분열조직의 희귀 마커 유전자와 동반 세포^{마커 15}가 포함되었다. 이러한 전사체의 성공적인 포착은 제시된 방법이 다양한 세포 유형을 높은 무결성으로 분리할 수 있음을 확인시켜 주며, 식물 단세포 연구를 진전시키는 데 유용한 도구가 됩니다. scRNAseq 외에도 이 방법은 유세포 분석, 일시적 유전자 발현 분석, 식물 재생 분석에도 사용할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀룰라아제 RS	두셰파 생화학	C8003
원심분리기 5810R 모델	에펜도르프	5810000010
피콜 PM 400	시그마-올드리치	26873-85-8
마세로자임 R10	두셰파 생화학	M8002
마이크로 원심분리기 5417R 모델	에펜도르프	중단
Puradisc 30 멸균 주사기 필터, 0.2 & 마이크로; m	시티바	10462200	0.2 & 마이크로라고 불립니다; 프로토콜 내 m 필터
멸균 셀 스트레이너 40 & 마이크로; m 나일론 메쉬	피셔브랜드	22363547
멸균 셀 스트레이너 70 & 마이크로; m 나일론 메쉬	피셔브랜드	22363548