고체 표면 형광을 이용한 벌 제품 내 2,4-디클로로페녹시아세트산 모니터링

Summary

이 연구는 아르헨티나 중부 및 북부 벌 제품 샘플에서 2,4-디클로로페녹시카복실산을 통제 및 모니터링하기 위한 새로운 대안 방법론 개발을 제안합니다.

Abstract

꿀 생산과 작물 수분에 꿀 건강은 필수적입니다. 벌이 처리된 식물에서 꿀과 꽃가루를 채취할 때 벌이 이 화학물질에 접촉할 수 있어 꿀 생산에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 이는 독성 잔류물로 인해 꿀에 오염될 수 있습니다. 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)은 활엽 잡초를 제어하도록 설계되었지만, 꽃에 도달해 벌의 생산을 오염시켜 꿀벌의 건강과 삶의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 이유로 꿀을 주기적으로 분석하여 제초제 잔류물 존재를 감지하고 필요시 시정 조치를 취하는 것이 중요합니다. 이 연구는 아르헨티나 중부 및 북부 벌 제품 샘플에서 2,4-D 통제 및 모니터링을 위한 전통적인 기법에 대한 새로운 대안 방법론 개발을 제안합니다. 샘플은 pH = 7.0에서 음이온 계면활성제 도데실 황산나트륨(SDS) 존재 하에 조절되었으며, 고체 지지물로서 블루밴드 필터 페이퍼를 통해 시스템을 여과한 후 고체 형광으로 결정했습니다. 최적의 작업 조건에서는 각각 0.33 ng/L와 0.90 ng/L의 검출 및 정량 한계가 달성되었고, 0.90 x 10³ ng/L에서 1.13 x 10³ ng/L의 선형성 범위가 달성되었습니다. 이 새로운 방법의 장점 중 하나는 저렴한 기기와 친환경 용매의 사용, 저폐기물 발생, 그리고 그에 따른 친환경 화학 원칙의 일부 보호입니다.

Introduction

꿀 생산과 작물 수분에 꿀 건강은 필수적입니다. 건강한 군집은 적절한 영양, 위생 수칙, 질병 예방 및 치료를 포함한 포괄적인 건강 관리에 달려 있습니다. 책임감 있게 꿀 생산이 이루어진다면 벌에 해를 끼치지 않으며, 양봉가들은 전체 꿀의 일부만 채취하여 군집을 위한 비축분을 남깁니다 ^1,2.

꿀 생산은 제초제 사용으로 인해 부정적인 영향을 받을 수 있는데, 벌이 처리된 식물에서 꿀과 꽃가루를 채취할 때 이 화학물질에 접촉해 농약 잔류물로 인해 꿀이 오염될 수 있습니다. 또한 글리포세이트와 같은 일부 제초제는 벌의 발달과 행동에 직접적인 영향을 미쳐 채집 능력과 생리적 발달을 저하시킬 수 있습니다 3,4,5,6. 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 제초제는 활엽수초 방제를 위해 설계되었지만, 꽃에 도달해 꿀을 오염시켜 꿀 건강과 꿀 품질에 영향을 미칠 수 있습니다 ^7,8,9.

최근 몇 년간 국내외 꿀 및 기타 벌 제품 무역은 생산량 증가로 나타나^{10, 11, 12} 증가로 나타나 상당히 지속적인 성장을 보였습니다. 유엔 식량농업기구(FAO) 자료에 따르면, 전 세계에는 중국, 아르헨티나, 터키, 미국, 우크라이나의 5개 주요 꿀 생산국이 있습니다. 이 중¹³개가 있습니다. 양봉 생산은 아르헨티나에서 매우 중요하며, 최근 몇 년간 등장한 수출 시장 기회로 인해 지속적으로 성장하고 있습니다. 아르헨티나의 환경 조건(기후, 식물상 등)과 생산에 투자된 기술 덕분에 아르헨티나는 전 세계적으로 중요한 위치에 자리 잡을 수 있었습니다. 반면, 외계생물의 존재는 다른 국가와 마찬가지로 독해 영향으로 인해 꿀 마케팅과 소비자 건강에 영향을 미치기 때문에 우려되는 문제이며 감시가 필요합니다^14,15.

2,4-D는 널리 사용되는 선택적 전신 제초제로, 합성 옥신 역할을 하여 활엽 잡초의 통제 불능 성장과 죽음을 유발합니다. 농업, 원예, 임업에 사용되며, 밀, 옥수수, 쌀과 같은 작물의 잡초 방제에 특히 유용하다. 잔디나 곡물에 해를 끼치지 않기 때문^이다. 2,4-D는 식물 성장 조절제로도 사용할 수 있으며, 아민 및 에스터 염 등 다양한 제형으로 다양한 용도로 제공됩니다. 2,4-D 기능은 투여된 용량과 특정 종 및 조직 유형의 감수성에 의해 영향을 받습니다^17,18. 예를 들어, 2,4-D 접촉은 생식 결과 부정성과 생식 유전적 유전적 변형에 연관되어 있어 유전독성 효과가 주목할 만한 것으로 나타났습니다¹⁹.

꿀벌은 진사회성, 학습, 기억 연구의 주요 수분 매개자이자 모델 생물로서, 밭에서 사용되는 농약으로 인한 직접적인 중독에 매우 취약합니다²⁰. 개화 기간 동안 제초제와 살충제를 공중 살포하면 꿀벌의 사망률이 크게 높아지고 꿀 생산량이 크게 감소할 수 있습니다. 살충제 혼합물은 비치명적 용량이라도 채집 중인 벌을 혼란스럽게 하고, 기억력을 저하시키며, 채집 효율을 저하시킬 수 있습니다. 이로 인해 꽃가루와 꿀 수집이 줄어들어 군집이 약해져 영양 결핍이 발생합니다. 또한 꿀 샘플에서 2,4-D가 검출되었으며, 오염된 꽃가루와 꿀이 군통 짝 사이에 퍼질 수 있습니다²¹.

꿀에 제초제 잔여물이 있는지 주기적으로 분석하고, 필요 시 교정 조치를 취하는 것이 중요합니다. 제초제와 같은 식품 오염물질의 검출 및 정량화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 기구 방법은 크로마토그래피, 즉 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS), 그리고 가스 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(GC-MS/MS)^{22,23,24,25,26}입니다. 그러나 연구자들은 주기적으로 2,4-D에 대한 새로운 모니터링 방법을 제시하는데, 이는 기존 정량화 방법^{27, 28, 29}에 비해 장점이 있습니다. 예를 들어, 저렴한 기기 사용, 조작 간편성, 용매 사용 감소, 더 복잡한 시료 적용 등이 있습니다.

고체 형광은 분자 형광과 고체 상 추출 방법을 결합하여 이미 높은 형광 기기 감도를 향상시키는 다목적 기법입니다. 또한 매트릭스 효과를 줄이거나 제거하여 선형성 범위와 선택성을 향상시킵니다^30,31.

본 연구에서는 2,4-D를 모니터링하고 정량화하는 새로운 분석 방법론을 제안하여 아르헨티나 중부 및 북부의 꿀 및 기타 벌 샘플에 적용합니다. 샘플에는 알 수 없는 양의 2,4-D가 포함되어 있습니다. 알려진 것은 샘플에서 제공하는 2,4-D 농도와 합쳐진 슈퍼 첨가 농도입니다. 이 후자의 값은 알려져 있어 회수량을 계산할 수 있게 해줍니다. 새로운 방법론은 고체 형광을 이용한 분석물의 직접 결정에 기반하며, 장비 절감, 운영 비용 절감, 환경 보호 측면에서 여러 이점을 입증합니다.

Protocol

이 원고에는 저자들이 수행한 인간 참가자나 동물을 대상으로 한 연구는 포함되어 있지 않습니다.

사용 장비
분광형광측정 측정은 150W 제논 램프가 장착된 PC 기반 분광형광측정기를 사용하여 수행되었습니다. 고체 표면 형광(SSF) 측정에는 샘플 홀더가 사용되었습니다. 2,4차원 정량화에 사용된 매개변수는 다음과 같았습니다: λ_em= 580 nm, λ_ext=555 nm(슬릿 3-3), 고체 샘플 홀더를 사용).

샘플 채취 및 샘플 처리
2025년에 생산된 꿀 샘플 생산에 관한 이 연구는 아르헨티나 북중부 지역의 산루이스, 산후안, 후후이, 살타 주에서 수행되었습니다. 분석된 샘플은 네 가지 다꽃 꿀, 두 가지 프로폴리스 꿀, 순수 꿀 사탕, 그리고 지역 양봉가로부터 구입한 꿀, 코카, 프로폴리스 혼합물로 만든 사탕이었습니다. 연구된 꿀은 생산된 후 1주일 이내에 벌통에서 추출한 신선한 꿀로, 다양한 메커니즘에 의한 2,4-D 분해를 방지하기 위한 것이었습니다. 모든 샘플은 새롭고 멸균된 용기에 담겨 즉시 실험실로 운송되었습니다. 분석할 때까지 어두운 곳에서 4-8°C에 보관되었습니다. 고체 캐러멜은 절구와 공으로 균질화되었으며; 그 내용물은 5mL의 초순수수에 희석되었고, 그 용액에서 0.5 μL를 추출했습니다.

방법론
0.5 μL 또는 1 μL 2,4-D 알리코트(1.23 ng/L 및 3.49 ng/L), 샘플 100 μL, SDS 250 μL (1 x ^10-4 mol/L), 인산염 완충제 100 μL (1 x ^10-4 mol/L, pH=7)을 첨가하였으며, 혼합물의 부피는 이중 증류수를 첨가하여 3 mL로 만들었다. 혼합물은 고체 지지대(종이 필터; 자세한 내용은 재료표 참조)를 통해 필터링되었습니다. 고체 지지대는 실온에서 건조된 후, λ_em= 580 nm에서 λ_ext=555 nm(슬릿 3-3)와 고체 샘플 홀더를 사용하여 고체 표면 형광(SSF)을 측정했습니다.

위는 각 매개변수를 연구하고 최적화한 개발 방법론의 일반적인 절차를 설명하며, 결과(Results) 섹션에 나와 있습니다.

pH와 완충제의 영향
pH 최적화는 염산이나 수산화나트륨을 사용해 연구 대상 pH에 맞게 시스템을 조정하여 필요한 값(측정 범위 pH 5-7)으로 맞추는 방식으로 수행되었습니다. 그 후, 적절한 분석 신호를 달성하기 위한 가장 적합한 pH 범위가 얻어지면, 사용할 버퍼가 선택되었습니다.

테스트된 완충제는 인산염, 트리스, 붕사로, 1 x ^10-4 mol/L 농도로 준비되었습니다. 이들의 부피는 최상의 형광 강도 신호를 얻기 위해 조절되었습니다. 형광 강도를 개선한 유일한 완충 인산염의 결과와 해당 최적 농도가 나타난다. 여기서 선택된 완충제는 인산염이었고, pH = 7이었습니다.

계면활성제 농도
분자 형광에서 다양한 계면활성제를 사용하는 것은 연구 대상 분석물의 결정 능력을 향상시키는 장점을 제공합니다. 미셀라 배지는 분석물과 시료 기질 성분 간의 분자 간 상호작용을 최소화하기 위해 사용됩니다. 더 나아가, 형광 용질의 광물리학적 특성을 미셀러 배지에서 수정하여 형광 감도를 향상시킬 수 있습니다. 다양한 계면활성제(SDS 및 HTAB)가 고체 표면 형광(SSF)을 이용한 2,4-D 정량에 미치는 영향도 연구되었습니다. 8.3 x 10^⁻6 mol/L 농도의 음이온 계면활성제 SDS가 연구 대상 제초제의 형광 강도를 증가시키는 것으로 나타났습니다.

견고한 지지
평면 구성이 여기된 형광 상태에서 에너지적으로 선호되므로, 제초제가 고체 지지대에 머무르는 방안도 연구되었습니다. 시스템은 나일론, 셀룰로오스 아세테이트, 혼합 에스터, 블루 리본 필터 페이퍼 등 다양한 막을 통해 필터링되었습니다. 여과된 용액은 별도의 깨끗한 용기에 수집되었고, 막은 상온에서 건조되었습니다. 이후 막을 고체 샘플 홀더에 넣고 고체 형광(SSF)을 기록했습니다. 필터 종이에서 적절하고 선택적인 보존이 관찰되었으므로, 이 지지 지지가 고체 형광 결정에 선택되었습니다. 여과된 용액은 분자 형광으로도 분석되었습니다. 2,4-D 복합체가 없어 제초제가 필터 종이에 남아 있음을 보여주었다.

회복 연구
2,4-D는 각 샘플의 적절한 부피에 첨가되었으며(꿀 샘플은 0.5 μL, 다른 샘플은 1 μL 사용), 점차 농도는 1.23 ng/L와 3.49 ng/L로 증가했습니다. 분석 농도는 이 방법론을 사용하여 6회 복제 평균(n = 6)으로 결정되었습니다.

정밀 연구
방법의 반복성과 일중 정밀도는 2,4-D 1.23 ng/L 및 3.49 ng/L 샘플(n = 6)을 반복 검사하고 분석 성분을 결정하여 연구하였습니다. 또한, 동일한 시스템에 대해 7일간 반복 정밀도를 평가했습니다.

간섭 연구
3.49 ng/L의 2,4-D를 포함한 다양한 양의 일반 이온을 시험액에 첨가하고 방법론을 적용하였다. 다음 잠재적 간섭 요소들이 시험되었습니다:

간섭물질/2,4-D 몰 비율 = 1000:1:00, Na⁺, K⁺, Cl^-, Fe³⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Sb³⁺, Mn^{2+, S} ₃^2-, SO₄^2-, Ca²⁺, Mg²⁺, NO^3-, Ni²⁺, 과당, 포도당, 자당, 맥아당, 2,4,5-T, 설포메투론-메틸, 글리포세이트, 아트라진.

간섭물/2,4-D 몰 비율 = 500:1:00, Zn²⁺, Co²⁺, Al³⁺, 클로르설푸론, 벤술푸론-메틸, 트리아설푸론에 대해 측정됩니다.

분석 품질 매개변수 계산
분석 품질 매개변수는 검출 한계(LOD)와 정량화 한계(LOQ)입니다. 이 값은 다음 단계를 적용하여 계산되었습니다. 배경 잡음은 분석물이 없는 15개의 빈 샘플의 반응을 측정하여 배경 소음 데이터셋을 얻었습니다. 노이즈의 표준편차가 계산되었습니다. 이것은 LOD 값으로 받아들여집니다. 검출 한계는 블랭크 표준편차의 3.3배(N = 15)를 기준으로 합니다. 정량화 한계는 블랭크의 표준편차의 10배(N = 15)를 기준으로 합니다.

Results

아래에 제시된 결과들은 일반 절차에 영향을 미치는 각 변수, 최적화, 그리고 도달한 최적의 작업 조건에 대한 연구가 단계별로 어떻게 접근되었는지를 보여줍니다.

2,4차원 스펙트럼 특성화
2,4차원 특성 분석은 UV-Vis 분광법과 분자 형광을 통해 수행되었으며, λ_em= 580 nm에서 형광 강도 최대치를 관찰하고, λ_ext=555 nm(슬릿 3-3; 그림 1). 형광 신호의 증강 효과는 농도를 높여 직접 정량화할 수 있게 함으로써 입증되었습니다(그림 2). 직접 분석물 정량화는 여러 가지 장점을 제공하기 때문에 매우 중요합니다. 즉, 간접 방법과 달리 다른 형광 물질의 형광 신호를 어떻게 변형하는지 평가하는 방식과 달리, 운용 및 계산적 ...

Discussion

인구 증가에 따른 식량 수요를 충족하기 위해 아르헨티나와 전 세계에서 제초제 사용이 기하급수적으로 증가했습니다. 이러한 제품의 사용이 적절하고 합리적이며 주기적으로 모니터링된다면, 기대되는 이점을 훼손하거나 환경 전체에 부정적인 영향을 미치지 않을 것입니다. 2,4-D는 전 세계적으로 널리 사용되었으며, 많은 연구에서 이 제초제가 비표적 생물에 변화를 유발한다는 것이 입증되었습니다. 따라서 벌과 같은 다양한 생태계와 생명체에 제초제가 미칠 위험을 계속 평가하는 것은 매우 중요합니다 35,36,37,38,39,40.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	49083
아세트산/아세테이트	말린크로드 화학 공장
블루 리본 필터 페이퍼	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	WHA1001929	2-5 & mu; 기공 크기와 직경 12.5cm;
셀룰로오스 아세테이트 막	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국		0.45 & μ; m개의 공 크기와 47mm
헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(HTAB)	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	H5882
염산	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	1.09063
임모빌론(+) 막	밀리포어, 상파울루, 브라질	HATF04700	0.45 & μ; m개의 공 크기와 47mm
혼합 에스터 막	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국		0.45 & μ; m개의 공 크기와 47mm
나일론 막과 nbsp; 그리고 nbsp;	밀리포어, 상파울루, 브라질	Z290793	0.45 & μ; m 공극 크기와 47mm 직경
pH미터(오리온 확장 이온 분석기) 및 nbsp;	오리온 리서치, 미국 매사추세츠주 케임브리지	EA 94 모델.
이하이드로인산칼륨  그리고 nbsp;	Biopack, 부에노스아이레스, 아르헨티나	2000168900
프탈레이트 칼륨	머크 & 컴퍼니, Inc
도데실 설페이트 나트륨	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	11667289001
수산화나트륨	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	S2770
사트라보레이트 나트륨	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	221732
분광형광계	시마즈	RF-5301	150W 제논 램프와 1.00cm 석영 전지를 장착했습니다
트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미국	77-86-1