생 체 내 2광자 영상을 이용한 전기침술 중 체감각 피질 뉴런의 시공간 역학 시각화

Summary

이 프로토콜은 Thy1-GCaMP6f 형질전환 마우스의 두개골 창, 표준화된 전기침술, 2광자 영상을 통합하여 자극 중 밀리초 규모의 피질 앙상블 역학을 시각화하여 층 특이적 가소성을 드러냅니다.

Abstract

이 프로토콜은 EA(전기침술) 자극 중 피질 회로 역학을 조사하기 위한 포괄적인 실험 틀을 확립합니다. 이 방법론은 세 가지 핵심 요소를 통합합니다: Thy1-GCaMP6f 형질전환 마우스에서의 만성 두개골 창 이식, 2/100 Hz 이상 펄스를 이용한 ST36 경혈점에서의 표준화된 EA 자극, 그리고 고해상도 2광자 칼슘 영상입니다. 이 통합 접근법은 일차 체성감각(S1) 피질의 신경 앙상블 활동을 밀리초 단위의 시간 정밀도로 실시간으로 시각화할 수 있게 하며, 신경조절에 대한 네트워크 수준의 반응에 대한 이전에 접근할 수 없었던 세부 정보를 포착합니다. 이 기법은 뚜렷한 층 특이적 활성화 패턴과 종방향 가소성 변화를 성공적으로 밝혀내어 EA 효과의 피질 메커니즘에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 기존 fMRI와 전기생리학적 기법에 내재된 근본적인 시공간적 한계를 극복함으로써, 이 고해상도 플랫폼은 동적 신경 회로 매핑에 전례 없는 분석 능력을 제공합니다. 프로토콜의 견고한 설계와 재현 가능한 결과는 표적 신경조절 치료 최적화와 말초 자극에 대한 회로 수준의 가소성 이해 발전에 특히 가치가 있습니다.

Introduction

전기침술은 전통 침술을 현대적으로 변형한 것으로, 특정 경혈에 바늘을 통해 제어된 전류를 삽입하는 것으로, 통증 처리, 운동 조절, 자율신경 기능에 관여하는 신경 회로를 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 이 효과는 말초 감각 신경 활성화(주로 Aδ 및 C 섬유)에 의해 시작되는 복잡한 신호 전달 연쇄 반응을 포함하는 것으로 여겨지며, 이를 통해 신경전달물질(예: 오피오이드, 세로토닌, GABA)을 방출하고 척수, 뇌간, 피질 수준 ^1,2에서 조절이 일어난다. 주요 구조로는 체성감각 피질이 포함됩니다. 촉각 및 통각 정보를 처리하는 S1 피질 내에서 EA는 국소 억제-흥분 균형과 장거리 연결성에 영향을 미치는 것으로 보입니다 ^3,4. 그러나 EA 자극 중 및 직후 S1 내 다양한 신경 집단(예: 피라미드 뉴런, 인터뉴런) 및 층에서의 활성화/억제 시간적 순서^{는 앞서} 언급한 방법론적 제약으로 인해 대부분 밝혀지지 않았다 ^5,6. 이러한 실시간 역학을 이해하는 것은 EA 매개변수를 최적화하고 치료 결과를 예측하는 데 매우 중요합니다.

행동 연구나 사후 분석과 같은 전기침술(전기침)이 피질 회로에 미치는 신경 조절 효과를 조사하는 전통적인 방법들은 귀중한 통찰을 제공하지만, 실시간 신경 활동을 고시공간 해상도로 포착하는 것은 불가능하다 ^7,8. 이러한 한계를 극복하기 위해 생체 내 2광자 칼슘 영상이 강력한 대안으로 등장하여 자극 중 신경 앙상블 역학을 직접 시각화할 수 있게 합니다 ^8,9. 이 기술은 만성 종단 연구에 탁월한 이점을 제공하여, 연구자들이 깨어 있는 행동 동물의 피질 층 전반에 걸쳐 빠르고 분산된 활동을 세포 해상도로 관찰할 수 있게 합니다. 급성 전기생리학이 시간적 해상도는 높지만 공간적 범위가 제한적이지만, 2광자 영상은 정의된 시야 내에서 수백에서 수천 개의 뉴런을 동시에 대규모로 모니터링할 수 있게 합니다 ^9,10. 더욱이, 기능적 자기공명영상(fMRI)은 전체 뇌 범위에 뛰어나지만 시간 규모가 느리고 세포 특이성이 부족한 반면, 2광자 칼슘 영상은 시냅스 및 회로 수준 과정과 관련된 시간 척도에서 특정 신경 집단의 활동을 세밀하게 탐지할 수 있습니다^11,12. 따라서 2광자 영상은 말초 EA 자극이 특히 1차 체감각 피질(S1)과 같은 영역에서 시공간적으로 정밀한 피질 활성화 패턴으로 어떻게 변환되는지에 대한 우리의 이해에서 중요한 간극을 메우는 독특한 위치에 있습니다. 체성감각 처리(경혈 신호 포함)의 주요 허브로서, EA가 활성을 강하게 조절하는 점을 고려할 때, S1은 전기침술에 의해 유도된 피질 회로 역학을 연구하는 전략적 관문입니다.

2광자 레이저 주사 현미경(2PLSM)과 유전자 암호화된 칼슘 지표(GECI), 예: GCaMP6는 신경과학에 혁신적인 도구입니다. 이 기술은 세포 및 아세포 특이성을 가진 생체 내 신경 활동의 만성적이고 고해상도 영상을 가능하게 합니다¹³. GECI는 세포 내 칼슘 과도기에 비례하여 형광을 발색하며, 신경 발화의 신뢰할 수 있는 대리 지표 역할을 합니다¹⁴. 특히 2PLSM이 근적외선 여기광을 사용하여 기존 현미경보다 수백 마이크론에 달하는 우수한 깊이 관통력을 제공하여, 표면층과 더 깊은 피질층(예: L2/3, L4, L5)에서의 활동을 시각화할 수 있습니다. 고유의 광학 단면 덕분에 초점 어긋난 형광과 광손상을 최소화하여,^{15, 16, 17} 주 또는 몇 달에 걸친 종단 연구에 이상적입니다. 이 기술은 EA 연구에서 혁명적인 진전을 의미하며, 자극 시 정의된 피질 부피 내에서 수백에서 수천 개의 개별 뉴런의 밀리초 규모 역학을 동시에 추적할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Protocol

모든 실험은 8-12주 된 형질전환 Thy1-GCaMP6f 쥐¹⁸을 사용했습니다. 모든 실험 절차와 동물 관리 프로토콜은 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며, 화중과학기술대학교 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 프로토콜 승인 번호: 3603). 사용된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력이 기울여졌습니다. 실험 장치의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 만성 두개창 이식

1. 마취 유도 및 입체 안정화
   1. 8-12주 된 Thy1-GCaMP6f 마우스를 4-5% 이소플루란(용량/볼륨)을 100% 의료용 산소에 1L/분 유량으로 공급받는 유도 챔버에 넣어 마취를 시작하세요.
   2. 교정 반사가 상실되면(보통 2-3분 이내), 동물을 디지털 입체 프레임에 통합된 온도 조절 가열 패드(37°C로 유지)로 옮깁니다.
   3. 수술 유지 치료를 위해 1.5-2.0% 이소플루란을 공급하는 코 콘으로 쥐를 고정하세요. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고(예: Puralube Vet 연고)를 바르세요.
   4. 외상성 없는 귀 바를 외청도 내에 조심스럽게 삽입하여 조직 손상이나 고막 파열을 일으킬 수 있는 과도한 압력 없이 대칭 위치를 확보하세요¹⁹.
   5. 기도 폐쇄를 피하고 코 클램프로 상악 구개를 고정하세요.
   6. 발가락 철회 반사가 없고 발가락을 꽉 쥐는 데 대한 반응과 안정적이고 느린 호흡수(분당 80-120호흡)를 통해 깊은 마취를 확인합니다. 직장 탐침을 통해 중심 체온을 지속적으로 모니터링하고 온열 패드를 조절하세요.
   7. 피하 진통제(s.c.)를 선제적 진통제(예: 카프로펜, 5 mg/kg)와 수액 지원(멸균 생리식염수, 0.5-1 mL s.c.)을 투여합니다. 설치 전반에 걸쳐 안정적인 생리학적 지표(SpO₂ > 95%, 호흡 규칙성을 확인하세요).
2. 두개골의 외과적 노출
   1. 전동 클리퍼로 등 두피를 꼼꼼하게 면도한 후, 화학 제모 크림을 발라서 완전한 제모를 하세요. 멸균 생리식염수로 꼼꼼히 씻으세요.
   2. 순차적 소독 시행: 노출된 피부를 세 번 문지르며, 포비돈-요오드(10%)와 70% 이소프로필 알코올 면봉을 번갈아 사용하고, 마지막에는 클로르헥시딘 글루코네이트(2%) 용액으로 마무리합니다.
   3. 멸균 미세 해리 가위와 미세 겸자(Dumont #5)를 사용해 피부와 그 아래 결합 조직을 관통하는 중앙선 시상(길이 ~15-20 mm)을 하며, 눈 뒤쪽 ~2 mm 지점에서 시작해 두정골-후두부 접합부까지 이어집니다.
   4. 절개 가장자리의 모세혈 출혈을 조절하기 위해 미세 정혈 겸자나 양극성 소작(저설정)을 사용하세요. 곡선 마이크로 리트랙터나 주변 드레이프에 고정된 5-0 실크 봉합사를 사용해 피부 플랩을 부드럽게 옆으로 당깁니다.
   5. 전두골, 두정골, 두정골을 포함한 등 전체 척추뼈를 노출시킨다. 마이크로큐렛(#00)을 사용해 고배율(외과용 현미경)으로 골막(골막)을 꼼꼼히 긁어내세요.
   6. 두개골을 파내거나 손상시키는 봉합사(브레그마, 람다, 시상실, 관상실)를 피하기 위해 부드럽고 접선 방향으로 스트로크를 하세요. 정밀한 개골 절개술과 이후 접착에 필수적인 매끄럽고 무혈 뼈 표면을 만드는 것입니다.
   7. 뼈 가루를 제거하고 조직 수분을 유지하기 위해 무균 37°C의 0.9% 식염수로 밭을 자주 관개하세요.
3. S1 측지 영역의 입체 타겟팅
   1. 고정밀 입체주행 조작 팔을 사용해 미세한 수술용 마커 펜 또는 마이크로 드릴 비트 끝을 해부학적 기준점 브레그마(관상봉합선과 시상봉합선이 만나는 지점) 위에 직접 위치시킵니다. 현미경 시각화로 좌표를 확인하세요 (10배).
   2. 조작기를 조정하여 마커를 정중선(시상봉합선)에 대해 정확히 전후반(AP) -1.5 mm(후반구)와 중외측(ML) +2.0 mm(우반구)로 이동시킵니다.
      참고: 이 위치는 1차 체성감각 피질(S1) 뒷지 표현 영역(S1HL)에 해당합니다.
   3. 이 좌표에 노출된 두정골 표면에 작은 십자선(<0.5 mm)을 가볍게 에칭하여 뼈를 관통하지 않고 시야를 확보합니다.
   4. 표시된 부위를 통과하는 주요 표면 혈관이 없음을 확인하고; 상당한 혈관이 있을 경우, 경막 혈관이 파손되면 심하게 출혈하여 광학 선명도를 방해하므로 ML 좌표를 최소한(±0.1-0.2 mm)으로 조정해야 합니다.
   5. 최종 조정된 좌표를 문서화하세요.
4. 정밀 두개골 절개 수술
   1. 멸균 일회용 3mm 직경 생검 펀치를 표시된 S1HL 좌표 위에 정확히 맞춰 배치합니다. 펀치를 부드럽게 돌리면서 단단하고 꾸준한 아래로 압력을 가해 바깥 피질 뼈층을 둘레 전체에 완전히 긁어주세요. 펀치를 빼.
   2. 0.5-0.8mm 카바이드 버를 사용하는 고속 미세 수술 드릴을 입체 팔에 부착하고, 0.9% 식염수 세척(냉각 및 이물질 제거) 하에 고정하여 상한 원 안의 뼈를 조심스럽게 얇게 만듭니다.
   3. 가볍고 접선 방향의 밀링 동작으로 짧게 연속으로 드릴하며, 주변부에서 중심부로 체계적으로 진행하세요. 확대 렌즈로 뼈 반투명도를 면밀히 관찰하세요.
   4. 기저 경막에 미묘한 '홍조' 현상이 나타나면 즉시 드릴을 중단하는데, 이는 최소 골밀도(<50 μm)를 나타냅니다. 미세한 겸자(Dumont #5/45)와 마이크로 가위로 전환하여 남은 얇은 뼈 조각을 중앙에서 방사형 방향으로 정밀하게 들어 올리고 벗겨내세요.
   5. 경막을 온전하게 보존하세요 - 찢어짐이나 심한 출혈 없이 반투명하고 반짝이는 모습을 유지하세요. 경막막 출혈은 0.9% 생리식염수 또는 트롬빈에 적신 멸균 압축 폼 플레젯으로 부드럽게 압박하여 즉시 조절하세요.
   6. 노출된 경막부를 따뜻하고 멸균된 인공 뇌척수액(aCSF) 또는 0.9% 식염수로 듬뿍 세척하여 모든 뼈 이물질을 제거하세요. 건조 방지^{17, 20}.
5. 만성 두개골 창문 이식 및 머리 고정
   1. 직경 3mm, 두께 #1(약 150μm) 무균 원형 유리 커버슬립을 준비합니다. 선택적으로 내부 표면에 얇은 실리콘 엘라스토머 층을 코팅하여 광학 투명도와 접착력 감소를 높일 수 있습니다.
   2. 가늘한 겸자를 사용해 커버슬립을 정확히 두개골 절개술 위에 위치시킵니다. 제조사 지침에 따라 빠르게 경화되고 광경화된 치과용 시멘트(예: Metabond 또는 Charisma)를 준비하세요.
   3. 빠르게 작업하면서(<90초 작업 시간), 커버슬립 가장자리에 얇은 시멘트 구슬을 마른 깨끗한 두개골 표면에 직접 발라. 시멘트가 커버슬립 가장자리를 완전히 밀봉하되, 아래쪽에서 듀라에 흡수가 닿지 않도록 하세요.
   4. 즉시 치과용 경화등(청색광, 450nm)을 사용해 사분면당 20-30초에 경화시키세요. 밀봉을 여러 겹 더 천히 경화하는 5mL 자가 경화 아크릴 치과 시멘트(예: Jet Repair Acrylic 또는 Paladur)로 보강하고, 두개골 절개술 가장자리를 넘어 몇 밀리미터 더 확장되는 견고하고 저프로파일(
   5. 초기 경화 단계에서 경량의 맞춤 스테인리스 스틸 또는 티타늄 헤드바(예: 중앙 구멍 15-20mm 길이)를 시멘트 캡에 삽입합니다.
   6. 헤드바가 시상실 봉합선과 평행하게 위치하고 창문 중앙에 위치하도록 하여 향후 현미경 아래 머리 고정을 위한 단단하고 균형 잡힌 고정점을 제공하여 광학 접근을 방해하지 않도록 하세요.
   7. 시멘트가 완전히 경화될 때까지 기다려 주세요(≥15분). 완전한 지혈과 창문 명료함²¹.
6. 수술 후 회복 및 모니터링
   1. 시멘트 경화 후에는 귀걸이와 코 클램프에서 쥐를 조심스럽게 떼어주세요. 이소플루란을 중단하고 자연 호흡이 완전히 재개될 때까지 100% 산소를 투여하세요.
   2. 수술 직후 부프레노르핀 HCl(0.05-0.1 mg/kg)을 진통 목적으로 투여하세요. 동물을 깨끗한 종이 깔개로 안감한 30-32 °C의 산소 보충 회수 챔버로 옮기세요.
   3. 흉골 누워 완전한 보행 가능을 회복할 때까지(보통 30-60분) 지속적으로 관찰하세요. 수술 후 24시간 후에 카프로펜(5 mg/kg) 두 번째 투여를 합니다. 필요하다면 수분 보충을 위해 가열한 젖 링거 용액(1mL s.c.)을 제공하세요.
   4. 쥐는 둥지 재료로 풍부한 표준 케이지에 단독으로 가두어 우리가 머리 이식물을 손상시키지 못하도록 합니다. 환경 조건(22-24°C, 습도 40-60%, 밝고 어둠 주기 12:12)을 유지하며, 음식과 하이드로겔을 자유롭게 섭취하세요.
   5. 수술 후 7일 동안 최소 하루 두 번 쥐를 통증/고통(구부정한 자세, 음술 발기, 활동 감소, 체중 감소>15%), 감염(고름성 분비물, 부기, 발적), 신경학적 결손, 머리 막대 이완 등의 징후를 모니터링하세요.
   6. 급성 수술 염증 해소, 정상 행동 회복 및 교구 정리 회복, 기저 피질 활동 안정화를 보장하기 위해 실험적 시술(영상 검사 또는 EA)을 시작하기 전에 최소 ≥7일의 회복 기간을 확보해야 합니다. 회복 기록을 위해 매일 체중을 재세요²².

2. 전기침 자극

1. ST36 경병점의 정확한 해부학적 위치
   1. 쥐 뒷다리의 해부학적 특징을 바탕으로 ST36("주산리") 경혈점을 목표로 삼으세요. 바늘 삽입 전에 경골 근위부를 촉진하여 경골결절(무릎 관절 바로 앞쪽, 슬개개골 인대가 삽입되는 부위)을 확인하세요.
   2. 미세한 캘리퍼스나 멸균 마커를 사용해 경골 결절 중심에 대해 외측(비골 쪽) 2mm, 후방 2mm 꼬리(후쪽)를 측정합니다. 이 위치는 경골 전근 복부에 해당하며, 심부 비골신경 가지의 표면과 전경골동맥의 분기점 근위에 위치합니다.
   3. 필요하다면 환광 검사를 통해 부위에 주요 표재성 혈관이 없음을 확인하십시오.
      참고: 정확도가 매우 중요하며, 약간의 편차(>0.5 mm)가 자극된 신경 구조와 이후 피질 반응에 큰 변화를 줄 수 있습니다. 랜드마크 식별은 운용자 간 변동성을 최소화하기 위해 훈련된 인력에 의해 일관되게 수행되어야 합니다 ^23,24.
      참고: 바늘 안정성을 보장하는 방법은 다음과 같습니다: (i) 바늘 삽입 및 고정 후에는 쥐가 적응하고 초기 저항을 줄이기 위한 적응 기간이 허용됩니다. (ii) 전기침술 자극기에서 발생하는 진동 주파수(예: 2 Hz)는 본질적으로 진폭이 낮습니다. 더불어, 사용되는 미세 바늘(예: Φ0.16 mm)은 이 최소 진동을 효과적으로 견딜 수 있을 만큼 충분한 강성을 가지고 있습니다. (iii) 실험 내내 조작자는 바늘 끝 위치를 지속적으로 모니터링합니다. 동물 이동으로 인한 유의미한 이동이 관찰될 경우 시험 데이터는 제외됩니다.
2. 멸균 바늘 삽입 기법
   1. 피부 소독(70% 에탄올과 클로르헥시딘 스크럽을 번갈아 사용)을 ST36 표지판 기준에 살균 일회용 스테인리스 침술 바늘(명목 직경: 0.18 mm, 36게이지 기준; 길이 13 mm)을 수직으로 피부에 삽입합니다.
   2. 바늘을 피부, 피하 조직, 그리고 전경골근 밑 근육을 부드럽게 회전시키는 동작으로 천천히 밀어 넣어 조직 외상을 최소화합니다.
      참고: 표적 삽입 깊이는 피부 표면에서 3mm 떨어져 있습니다. 이 깊이는 유형 II/III 근 구심성(Aδ 섬유)과 잠재적으로 체세포 소구름 섬유를 최적의 결합 없이 경골이나 심부 신경혈관 다발과 접촉할 위험을 방지합니다.
   3. 바늘 허브를 작은 멸균 접착 패드나 맞춤형 클립으로 단단히 고정하여 이후 전기 자극 시 빠짐과 미세한 팔다리 움직임을 방지하세요.
   4. 삽입 시 미세하고 일시적인 국소 근육 섬유 경련을 관찰하여 바늘 위치를 안정적으로 확인하세요. 이는 올바른 근육 내 위치의 생리학적 지표입니다.
   5. 감염을 예방하기 위해 특히 만성 자극 패러다임에서 엄격한 무균 기술을 유지해야 합니다²³.
3. 전기침 자극 매개변수화 및 투여
   1. 삽입된 바늘의 절연 손잡이를 프로그래밍 가능한 전기침 자극기(예: HANS 경혈 신경 자극기, 모델 LH202)의 양극(+) 출력 채널에 연결한다.
   2. 기준 음극(-) 전극(보통 전도성 젤로 코팅된 작은 스테인리스 스틸 판이나 클립 전극)을 동측 뒷발(예: 발뒤꿈치 근처)에 위치시킵니다.
   3. 두 지점 모두에서 안전한 접촉과 낮은 임피던스(<5 kΩ)를 보장하세요. 자극기를 이상 정사파 펄스(양극/음상의 균형)를 전달하도록 프로그래밍하여 전극 편극과 조직 손상을 최소화합니다.
   4. 자극 패러다임을 조밀-분산 모드로 설정하세요: 3초간 2Hz(저주파)의 폭발 신호를 번갈아 가고, 이어서 3초간 100Hz(고주파)를 반복합니다.
      참고: 이 결합된 주파수 패턴(종종 2/100 Hz로 표기됨)은 단일 주파수 단독보다 내인성 오피오이드(예: β-엔도르핀, 엔케팔린)와 모노아민(예: 세로토닌, 노르에피네프린)을 중추신경계에서 더 효과적으로 증진시키는 것으로 경험적으로 입증되었습니다.
   5. 현재 강도를 0.1 mA부터 점진적으로 조절하여 가벼운 마취 하에서 성체 쥐에서 보통 1.0 mA 사이에서 가볍고 리드미컬한 발바닥 경련(손가락이나 발목의 굽힘)이 시각적으로 관찰됩니다. 이 경련 임계점은 운동 원심 및 관련 대구리 구심성(Aβ 섬유)의 충분한 동원을 나타내며, 고통이나 격렬한 저항 없이 생리적 활성화를 확인시킨다. 이 조정된 강도를 20분^{자극 세션 내}내 유지^하세요.
4. 중요한 절차적 통제 및 생리학적 모니터링
   1. 자극 인공물 완화
      1. EA 케이블을 영상 장비나 헤드스테이지에서 물리적으로 분리하세요.
      2. 견고한 접지 구현: 자극기의 접지 단자를 전용 접지에 연결하고, 현미경 프레임과 동물 가열 패드가 공통 접지 지점을 공유하도록 하세요.
      3. 가능하다면 현미경의 블랭킹 신호와 시간 동기화 신호를 사용하거나, 사후 신호 처리를 통해 칼슘 흔적에서 잔여 전기 아티팩트를 제거하세요.
   2. 생리적 안정성
      1. 20분 EA 세션 동안 코어 체온(피드백 제어 온열 패드로 37.0 ± 0.5 °C로 유지), 호흡 속도(분당 80-120회), SpO₂(>95%)를 지속적으로 모니터링하세요.
      2. 영상/자극 중 움직임 정지 시 경미 이소플루란 마취(1.0-1.5%)를 유지하세요. 유발된 발바닥 경련을 지속적으로 관찰하세요; 만약 감소하거나 멈추면 바늘 접촉과 임피던스를 점검하고, 강도를 약간 조절(≤0.1 mA 단위로) 조절하여 일관되고 가벼운 운동 활성화를 유지하세요.
      3. 고통의 징후(예: 빈호흡, 격한 몸부림)가 나타나면 즉시 자극을 중단하세요.
   3. 재현성
      1. 모든 동물과 세션에서 동일한 바늘 종류, 삽입 깊이, 자극기 모델, 보정 방법(발 근육 위치 역치)을 사용하세요. 각 피험자별로 사용된 최종 자극 강도를 문서화하세요.
      2. 마취 종료 또는 추가 시술 전에 최소 5분 이상의 회복 시간을 허용하세요^27,28.

3. EA 중 2광자 이미징

1. 동물 준비, 머리 고정 및 생리적 유지
   1. 수술 후 회복 ≥7일, 모터 구동 XY 스테이지에 장착된 맞춤형 진동 감쇠 고정 장치 내 이식된 헤드바를 사용해 Thy1-GCaMP6f 마우스를 헤드픽스합니다.
   2. 동물을 저마찰, 공기 윤활된 원통형 러닝머신 위에 편안하게 위치시켜 뒷다리가 자유롭게 움직일 수 있도록 하세요. 100% 산소에 0.5-0.8% 이소플루란을 노스콘 투여하여 가벼운 외과적 마취를 유지하세요. 이 낮은 이소플루란 수치는 신경 활동 억제를 최소화하면서도 고해상도 영상 촬영에 충분한 움직임 없음을 보장합니다.
   3. 핵심 체온(피드백 제어 온열 패드를 통해 37.0 ± 0.2 °C로 유지), 호흡 속도(분당 100-140호흡), 말초 산소포화도(SpO₂ > 95%)를 지속적으로 모니터링하고 기록합니다.
   4. 장시간 영상 촬영 중 각막 건조를 방지하기 위해 안과 젤을 바르세요. ST36에서 EA 바늘 삽입을 위해 S1HL 두개골 창문에 맞춰 뒷다리 같은 쪽이 접근 가능한지 확인하세요.
   5. 머리 고정 후 생리적 안정화를 위해 15-20분간 두^{어 영상 촬영}을 시작하세요.
2. 레이어 II/III 이미징을 위한 광학 타겟팅 및 최적화
   1. 고품질 신경 신호를 획득할 초점면을 정확히 결정합니다. 이 인증 절차를 따르세요.
      1. 레이저 출력을 낮은 수준(일반적으로 영상 출력의 10-20%, 예: 5-10 mW)로 낮춰 불필요한 광표백과 광손상을 방지하세요.
      2. 2광자 현미경의 Z축 구동기를 사용해 대물렌즈를 천천히 마이크론 단위로 이동시킵니다. 두개골 창문 표면부터 시작해 뇌 조직 깊숙이 진행하세요.
      3. 라이브 미리보기 모드에서는 3.2.1.4 및 3.2.1.5 단계에 설명된 시각적 표시기를 사용하여 초점면을 식별합니다.
      4. 신경 세포 소마층의 올바른 초점면을 위해: 이미지에 명확하고 밝은 점형 구조(신경 세포 소마타)가 둥글거나 타원형으로 나타나고 배경 대비가 좋은지 확인하세요. 세포 경계가 뚜렷하고 독특한 '소금과 후추' 같은 모습을 보이도록 하세요.
      5. 초점면이 잘못된 경우: 이미지가 흐릿하거나 균일하게 보이며 명확한 점상 구조가 없다면, 초점이 소마타가 없는 영역에 있음을 인식하세요. 크고 어둡고 구조화되지 않은 혈관 그림자가 보인다면, 이를 혈관층으로 식별하세요.
   2. 적절한 형광 기준선 검증
      1. 실험 자극을 적용하기 전에 건강한 형광 기준선을 확인하여 이후 칼슘 신호(ΔF/F)의 유효한 해석을 보장합니다. 3.2.2.2-3.2.2.4 단계를 수행하세요.
      2. 레이저 출력을 공식 영상 수준(예: 30-50 mW)으로 조정합니다.
      3. 빠른 저해상도 미리보기 모드에서 몇 초간 이미지를 캡처하세요.
      4. 실시간으로 표시되는 평균 형광 강도를 관찰하거나 이미지 밝기를 직접 모니터링하세요. 실험 데이터 수집에 들어가기 전에 신호가 안정적이고 급격한 광표백 징후가 없는지 확인하세요.
   3. 영상 시야를 두개골 창 안에 중심에 두세요.
      1. 대물렌즈와 커버슬립 사이에 초음파 젤이나 증류수를 적용하여 침지 결합을 진행하세요. 적외선 닷트 그라디언트 콘트라스트 또는 후반형광 조명을 사용하여 표면 혈관을 식별하고 시야각(FOV)을 정렬하여 큰 표면 혈관(> 20 μm 직경)을 피합니다.
      2. 조절 가능한 펨토초 펄스 Ti:사파이어 레이저를 사용해 2광자 여기 모드로 전환하세요. 여기 파장 을 920 nm로 설정하세요 - GCaMP6f(최대 ~920 nm)를 여기시키기에 최적이며, 짧은 파장에 비해 녹색 자가형광과 광손상을 최소화합니다.
      3. 레이저 출력을 점차 증가시키고(일반적으로 샘플에서 측정된 20-50 mW), 투명한 경막을 통해 피질 표면(피아-마터)으로 초점을 맞추세요. 압전 나노포커스 장치를 사용해 대물의 Z 위치를 조정하여 피알 표면 아래 200± 10 μm 깊이, 즉 피질 II/III층에 해당합니다.
      4. 특징적인 신경 밀도와 형태를 통해 깊이를 확인하라: 눈에 보이는 첨단 수상돌기(10-15 μm 직경)의 소에서 중간 크기의 피라미드 신경 세포 집단이 밀집되어 있다.
      5. 레이저 출력 및 광증배관(PMT) 게인 설정을 최적화하여 포화도(픽셀 강도 ~검출기 최대 50-70%)와 최소 배경^30,31 없이 강한 기본 GCaMP6f 형광(F₀)을 달성합니다.
         참고: 영상 촬영 중 920 nm 여기광의 평균 출력은 목표 지점에서 30-50 mW로 정확히 유지되었습니다. 이 출력 수준은 동일한 수술 절차를 받은 동물 조직을 대상으로 한 파일럿 실험을 통해 검증되었으며, 최대 25분간의 스캔 지속 시간 동안 효과적인 신호 획득을 보장하면서 광손상과 형광 표백을 최소화했습니다.
3. 고속 칼슘 영상 획득 프로토콜
   1. 고속 프레임 획득을 위해 공명 스캐너를 구성하세요:
      프레임 크기: 512 × 512 픽셀 (일반적인 FOV: ~450 × 450 μm, 픽셀 크기 ~0.88 μm)
      프레임 속도: 양방향 스캐닝(~14kHz 라인 속도)을 통해 달성한 초당 7프레임(fps). 이 속도는 GCaMP6f 감쇠 속도론(τ~500ms)을 충분히 샘플링하면서 신호 대 잡음비(SNR)를 균형 있게 조절하고 광표백을 최소화합니다.
      픽셀 체류 시간: ~0.8 μs (7 Hz에서 SNR 최적화).
   2. 획득 소프트웨어(예: ScanImage, Prairie View)를 사용하여 연속 타임랩스 획득을 시작하세요. EA 자극 시작 전 5분간의 기준 시간을 기록하여 자극 전 신경 활동 역학(F₀)을 확립합니다.
   3. 정확히 t = 5분에 ST36에서 EA 자극을 시작하며 영상 촬영은 중단 없이 계속됩니다. 20분 EA 자극 기간 동안 데이터를 지속적으로 수집하세요. 총 스캔 시간 = 25분 (1500초, ~10,500프레임).
   4. 데이터를 멀티-TIFF 스택 또는 TTL 입력 채널을 통해 EA 트리거 펄스에 동기화된 내장된 타임스탬프를 가진 독점 바이너리 형식으로 저장할 수 있습니다.
   5. 레이저 출력 안정성과 초점 드리프트(< μm)를 실시간으로 모니터링; 중요한 드리프트가 발생할 때(예: >5 μm) 잠시 멈춰 재초점을 맞추며, 시점^32,33을 기록합니다.
4. 엄격한 모션 보정 및 공간 등록
   1. 획득 후에는 MATLAB의 NoRMCorre(비강성 모션 보정)를 사용해 원시 영상 스택을 처리하여 잔여 미세한 움직임(예: 호흡, 맥박)으로 인한 공간적 아티팩트를 제거합니다.
   2. 먼저, 스택을 겹치는 공간 패치(예: 64 × 64픽셀, 50% 겹침)로 나누세요. 각 패치마다 기준선 기간의 높은 SNR 프레임을 평균하여 참조 템플릿을 계산합니다.
   3. 푸리에 기반 교차상관을 사용하여 템플릿에 대해 모든 프레임에 대해 X-Y 평진 이동을 계산합니다. 이 이동은 서브픽셀 보간을 통해 적용합니다.
   4. 다음으로, 비강체 변형을 다루고, 조각별 아핀 변환(평행 + 전단)을 사용하여 패치 내 국소 왜곡을 모델링합니다. 템플릿을 반복적으로 업데이트하여 등록 정확도를 높이세요. 주요 기준:
      max_shift: 20픽셀 (번역 제한)
      max_dev: 3픽셀 (최대 비강체 편차)
      bin_width: 50프레임 (템플릿 업데이트를 위한 시간적 비닝)
   5. 프레임 간 상관관계 플롯을 점검하여 보정 효과를 시각화하고(보정 후 1.0 가까이 안정화됨), 평균 영상 투영 차이 지도(보정 전/후 기준)를 생성하세요. 모션 보정 스택은 후속 분석용으로 저장하세요. 이 단계는 특히 EA로 인한 미묘한 사지 움직임 시 칼슘 과도성을 정확히 픽셀 단위로 분석하는 데 매우 중요합니다.

4. 시공간 역학 분석

모션 보정 영상 스택은 Python의 Suite2p 파이프라인(v0.12.3)을 사용하여 자동 신경 분할과 신호 추출을 수행합니다. 주요 처리 단계는 다음과 같습니다:

1. 공간 발자국 식별
   1. 제약 비음 행렬 분해(CNMF)를 적용하여 스택을 공간 구성 요소로 분해합니다.
   2. 상관관계 기반 접근법을 사용하여 관심 영역(ROI)을 초기화합니다: 공간 교차상관이 > 0.7이고 국소 SNR이 4인 픽셀을 후보 ROI로 합>. 체세포 ROI는 크기(직경 8-15 μm)와 원형성(조밀도 임계값>0.6)으로 수상돌기/축삭과 구분합니다.
2. 뉴로필 오염 교정
   1. 각 ROI에 대해 동심원 신경 고리(내부 반경: 1.5× ROI 반경, 외측 반경: 2.5× ROI 반경)을 정의합니다.
   2. 최소 제곱 회귀를 통해 뉴로필 계수(r_neuropil)를 계산합니다:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0.7 × F_neuropil(t)
      (계수는 Thy1-GCaMP6f 마우스에 대해 경험적으로 검증됨).
3. 신호 디컨볼루션
   1. AR(2) 노이즈 모델을 이용한 OASIS(l₁-정규화 디컨볼루션)를 사용하여 ΔF/F 트레이스에서 스파이크 확률 S(t) 를 추정하는 스파이크 활동을 추론합니다:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      여기서 'k'는 칼슘 과도 핵이고 ε 는 가우시안 잡음이다.
4. 품질 관리
   1. SNR <3, 공간 중첩 >30%), 신경 상관관계 >0.3을 포함하는 ROI는 제외합니다. 시각적 검증은 Suite2p GUI³⁴를 통해 수행됩니다.
      구체적인 작업 및 인터페이스 요소는 보조 파일 1에 제공됩니다. 위에서 생성된 모션 보정 TIFF 파일은 Suite2p 파이프라인에 직접 입력되었습니다. Suite2p의 통합 환경에는 자체 강체 모션 보정이 포함되어 있지만, 더 정밀한 비강체 보정이 이미 적용되어 있어 이 중복된 내부 단계가 비활성화되었습니다. 자동 추출된 신경 ROI는 보조 파일 2에서 확인할 수 있습니다.

Results

S1 피질의 구조적 특성화 및 기초 신경 활동
우리는 먼저 영상 실험을 위한 고충실도의 구조적·기능적 기준선을 설정했습니다. 조직 형태학 분석 결과, 비(그림 2A)과 덮개슬립 적용(그림 2B) 두개창 준비물 사이에 뚜렷한 구조적 차이가 확인되었습니다. 커버슬립 적용은 약간의 압축 인위(화살촉, 그림 2B)를 유발했지만, 관심 영역의 전체 구조적 완전성을 효과적으로 유지하여 안정적인 만성 영상 촬영에 매우 중요했습니다. 이후 피질 기둥을 통한 2광자 z-투영은 L2/3층에서 L5층까지 이어지는 매우 분지된 첨단 수상돌기들의 밀집된 네트워크를 드러냈습니다(점선, 그림 2C-E

Discussion

전기침술(EA)의 피질 효과를 실시간으로 관찰하는 데 있어 중요한 격차를 메우기 위해, 광학 접근을 위한 만성 두개창 이식, 표준화된 EA 자극, 그리고 일차 체감각(S1) 피질을 겨냥한 종단 2광자 칼슘 영상을 결합한 포괄적인 통합 프로토콜을 제시합니다.

이 통합 프로토콜은 EA의 피질 효과를 연구하는 데 있어 전통적인 방법보다 여러 가지 뚜렷한 장점을 제공합니다. 첫째, EA 자극³⁶ 중 S1 네트워크 내 수백 개 뉴런에서 동시에 밀리초 규모의 신경 활동 역학을 포착하는 전례 없는 시공간 해상도를 제공합니다. 이는 적절한 라벨링과 결합하여 활성화의 정확한 시간적 순서, 활동파의 공간적 확산, 그리고 다양한 신경 하위 유형 간의 반응 이질성을 밝혀낸다. 둘째, 만성 두개골 창은 종방향 영상을 가능하게 하여, 연구자들이 반복되는 EA 세션³⁷

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
카프로펜	MCE	해당 없음	진통을 위해 5 mg/kg
디지털 입체 프레임	후륜구동	코프프 모델 1900
전기침 자극기	HANS LH202 (2/100 Hz 이상 펄스)	해당 없음	HANS LH202 (2/100 Hz 이상 펄스)
이소플루란	후륜구동	R510-22-10	의료용 등급, 100% 산소 운반체
마이크로 드릴 시스템	후륜구동		0.5mm 카바이드 버, 염수 냉각
포비돈-아이오딘	MCE	HY-B2234	10% 해법
스캔이미지	스캔이미지	https://scanimage.org/
멸균 생리식염수	베윤톈	ST341-500ml	0.9% NaCl
외과용 현미경	자이스	https://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html	10-40번; 확대
Thy1-GCaMP6f 형질전환 마우스	사이겐	5523978	8-12주 생, 수컷/암컷
2광자 현미경	니콘 A1MP	니콘 A1MP	Ti:사파이어 레이저 (920 nm 여기)