방법 논문

막 단백질-억제제 결합 연구를 위한 생물층 간섭계: TACAN 돌연변이와 GsMTx4 모델 시스템

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DOI:

10.3791/69348

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2026년 5월 8일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

이 논문에서

요약

이 원고는 세제로 용해된 막 단백질의 막-리간드 상호작용을 연구하기 위한 바이오레이어 간섭계(BLI) 실험을 최적화하고 수행하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. TMEM120A M207A 돌연변이와 펩타이드 억제제 GsMTx4 간의 상호작용을 모델로 삼아 단백질 준비, 바이오센서 로딩, 그리고 동역학 데이터 획득을 설명합니다.

초록

생체층 간섭계(BLI)는 생체분자 상호작용의 실시간 정량적 분석을 가능하게 하는 효율적인 생물물리학적 기법입니다. 용해성 단백질에 일반적으로 사용되지만, 소수성과 세제 의존성 때문에 막 단백질에 적용하는 것은 여전히 도전적입니다. 본 연구는 세제에 용해된 막 단백질과 펩타이드 억제제 간의 상호작용을 특성화하기 위한 최적화된 BLI 프로토콜을 제시합니다.

모델 시스템으로서 게이팅 변형 펩타이드 그라모스톨라 메카노톡신 4(GsMTx4)가 다기능 막 단백질 돌연변이체 M207A TMEM120A 대해 시험되었습니다. FLAG 태그가 부착된 TMEM120A 변이는 태그 기반이지만 형광 및 효소 라벨이 없는 구조를 나타내는 항-FLAG 생물센서에 고정시키고, 연속 희석 GsMTx4에 노출되어 연관성 및 해리율을 측정하였다.

이 프로토콜은 Lauryl Maltose Neopentyl Glycol(LMNG)을 이용한 세제 최적화와 질량 광도 측정 및 차동 주사 형광측정(DSF)을 통한 보완적 특성 분석을 통합합니다. 이 워크플로우는 신뢰할 수 있는 운동학적 측정을 가능하게 하며 중간 처리량 스크리닝과 호환됩니다. 이 방법은 세제 안정성이 유지되는 다른 막 단백질-리간드 시스템에도 적용될 수 있습니다. 전반적으로 이 연구는 고정화 효율과 분석물 전달에 영향을 미치는 주요 매개변수를 강조하며, BLI가 억제제 프로파일링과 막 단백질 상호작용의 기전 연구에서 잠재적 유용성을 뒷받침합니다.

서론

막 단백질은 신호 전달, 이온 및 대사물 운반, 막 조직 등 필수 생리적 과정에서 중심적인 역할을 합니다. 세포 소통과 항상성에 관여하기 때문에, 임상 개발 중 약물 표적 중 상당 부분을 차지합니다. 막 단백질-리간드 상호작용을 이해하는 것은 기능을 명확히 하고 치료 설계를 안내하는 데 매우 중요합니다. 그러나 이들 단백질의 양형성 특성과 지질 환경에 대한 의존성은 정제, 안정화 및 생물물리학적 특성 분석에 큰 도전 과제를 제시합니다.

표면 플라즈몬 공명(SPR)과 등온 적정 칼로리미터법(ITC)은 막 단백질-리간드 상호작용의 동역학 및 열역학을 연구하는 데 널리 사용되는 기법입니다. 1,2. 적절히 최적화될 경우, 두 방법 모두 세제로 용해되거나 재구성된 막 단백질에 대해서도 상세한 정량적 통찰을 제공할 수 있습니다. 미세규모 열영동(MST)은 특히 막 단백질³에 대해 근자연 조건에서 결합 친화도를 평가하는 데에도 성공적으로 적용되었습니다. 그러나 이러한 접근법은 상당한 샘플 소비, 막 단백질 안정성 유지의 어려움, 특정 세제 시스템과의 한계 호환성 등으로 제한될 수 있습니다.

생체층 간섭계(BLI)는 세제 또는 앰피폴에 용해된 막 단백질을 포함한 생체분자 상호작용을 정량적으로 측정할 수 있는 실시간 광학 기법입니다. 앞서 언급한 생물물리학적 기법과 더불어, BLI는 결합 속도론(결합 속도, 즉 결합 속도(k온), 해리(k 오프), 평형 해리 상수(KD)를 직접 측정할 수 있는 효율적인 플랫폼을 제공하며, 샘플 농도는 낮고 세제 또는 나노디스크 용해성 막 단백질에 쉽게 적응할 수 있습니다. 또한 모든 생물물리학 기술과 마찬가지로 BLI에도 고유한 한계가 있다는 점도 주목할 만하며, 이는 토론 섹션에서 다룰 예정입니다.

BLI는 바이오센서 팁에서 반사된 백색광의 간섭 패턴 변화를 감지하며, 생체분자 결합 사건에 따라 광학 두께 변화가 나타납니다. 이러한 이동(Δλ, nm 단위)은 센서그램으로 기록되며, 센서 표면에 묶인 질량에 비례합니다. BLI는 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호작용(펩타이드 및 소분자 포함)에 널리 적용되어 왔으며, 나노몰에서마이크로몰 4까지의 친화도 범위에 적합합니다. 유연성, 낮은 샘플 소비량, 비교적 단순한 구성은 세제에 용해된 막 단백질 연구에 잠재적으로 유리한 도구가 될 수 있습니다 5,6,7.

본 연구는 막 단백질인 TMEM120A M207A와 펩타이드 억제제인 그라모스톨라 메카노톡신 4(GsMTx4) 간의 상호작용을 특성화하기 위한 BLI 프로토콜을 제시합니다. TMEM120A 기계적 통증 감지에 관여하는 기계적 민감 이온 채널로 제안되었습니다8; 그러나 이온 채널 활성은 여전히 논란이 많습니다. 여러 연구에서 HEK293이나 CHO 세포 1,9,10,11과 같은 이종 시스템에서 TMEM120A가 발현될 때 기계감응 전류가 없다고 보고되었습니다. 현재까지 4회 이상의 냉동 전자기(cryo-EM) 연구가 폐쇄 상태에서 TMEM120A 구조를 확인했으며, 1,9,10,11 개방 구조는 관찰되지 않았습니다.

분자 역학 시뮬레이션과 전기생리학적 분석은 야생형 인간 TMEM120A에서 메티오닌 207(M207)이 이온 전도 경로 내에서 게이팅 장벽 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이 잔기의 알라닌(M207A)으로 돌연변이는 이온 투과성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 나선 패킹을 변화시키고 Phe223과 같은 소수성 측쇄를 대체함으로써 이루어진 것으로 보입니다. 따라서 M207A 돌연변이체가 GsMTx4와의 결합 연구에 선정되었습니다.

GsMTx4는 거미 독에서 유래한 게이팅 조절 펩타이드로, 기계감성 양이온 채널을 억제합니다. 이 물질은 32개의 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 분자량은 4에서 5 kDa에 이르며, 피에조 및 TRP 채널을 포함합니다. 이는 주로 기공을 직접 차단하는 대신 지질 이중층과 상호작용함으로써 이루어집니다. 이전 연구들은 GsMTx4가 인공 이중층 시스템에서 TMEM120A 활성을 감소시키는 것으로 입증되었습니다8. BLI 분석에서 TMEM120A M207A 돌연변이를 항-FLAG 생체센서에 고정시키고 GsMTx4 농도에 노출시켜 연관(k온)과 해리(k 오프) 비율을 측정할 수 있게 했습니다.

이 연구는 바이오층 간섭계(BLI)를 이용한 세제 최적화 및 동역학적 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. BLI는 센서 과부하나 질량 수송 효과로 인한 잠재적 인공물, 빠른 결합률(k온) 상호작용에 대한 적합성 감소 등 일부 한계가 있지만, 통제된 세제 용해 조건에서 막 단백질-리간드 상호작용을 연구하는 데 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 중간에서 낮은 결합 친화도(일반적으로 나노몰에서 미세몰 범위)를 가진 시스템에 적합하며, 적절한 대조군과 완충 조건이 적용되면 다른 소수성 표적에도 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 단백질 정제 및 샘플 최적화

  1. 세포 배양 및 형질전환
    1. 120 RPM, 37 °C, 80% 습도, 8% CO₂로 설정된 진동 인큐베이터에서 20 mM L-글루타민을 보충한 무혈청 배양지에서 HEK293T/SF17 현탁 세포를 배양합니다. 세포를 5번 통로까지 통과하여 유지 가능; 세포가 약 5× 10⁶ 세포/mL의 밀도에 도달하도록 합니다.
    2. 제조사 지침에 따라 상업용 형질전환 시약을 사용해 pCDNA3.1 벡터 내 TMEM120A M207A 플라스미드(N-말단 FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A)를 세포에 트랜스펙팅합니다(재료 표 참조).
    3. 펠릿은 4 °C에서 5,000 × g 에서 15분간 원심분리하여 세포를 형질질로 전환했습니다. 세포 펠릿은 정제될 때까지 -80 °C에 보관하세요.
  2. 세포 용해 및 용해화 (그림 1)
    1. 30mL 세포 펠릿을 100 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지네탄설폰산(HEPES), pH 7.8을 포함한 용해화 완충제에 재현탁; 300 mM NaCl; 0.5% (w/v) 또는 4.98 mM 라우릴 맥아당 네오펜틸 글리콜(LMNG); 프로테아제 억제제 1회 혼합물; DNase I 50 μg; 10% (v/v) 글리세롤.
    2. 25% 진폭의 초음파 방식으로 20초 켜짐/20초 꺼지는 펄스 사이클을 사용하여 15분간 세포를 용해하며, 과열을 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관합니다.
    3. 용해액은 4°C에서 25,800 × g 에서 45분간 원심분리하여 정액합니다.
  3. 안티-FLAG 수지를 이용한 친화성 정제
    1. 평형 항-FLAG M2 수지와 평형 완충제, 25 mM HEPES, pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.05% (수량/수량) 또는 0.4975 mM LMNG; 10% (v/v) 글리세롤.
    2. 정액화된 상정액을 평형 수지와 함께 4°C에서 로커 위에서 2시간 배양합니다.
    3. 수지를 25 mM HEPES, pH 7.8의 워시 버퍼로 2번 세척합니다; 150 mM NaCl; 0.05% (수량/수량) 또는 0.4975 mM LMNG; 10% (v/v) 글리세롤.
    4. 결합된 단백질을 25 mM HEPES, pH 7.8의 용출 버퍼로 용출합니다; 400 mM NaCl; 0.001% (수/전압) 또는 0.00995 mM LMNG; 10% (v/v) 글리세롤; 200 μg/mL FLAG 펩타이드.
  4. 농도 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
    1. 30 kDa 컷오프가 있는 원심 여과 장치를 사용해 용출된 단백질을 ~500 μL로 농축합니다.
    2. 25 mM HEPES, pH 7.8로 평형화된 참조 크기 배제 컬럼을 사용하여 SEC를 수행; 200 mM NaCl; 0.00015% (w/v) 또는 0.00149 mM LMNG.
    3. 목표 단백질에 해당하는 피크 분획을 수집하고 모으세요.
    4. 최종 농도인 ~3 mg/mL로 농축합니다. 친화성 정제 후, TMEM120A M207A 단백질 단량체가 SDS-PAGE에서 약 43 kDa에 나타나는 것을 확인한다(그림 2A). SEC의 경우, LMNG에서 정제된 단백질이 약 150 kDa에 해당하는 단일 분산 피크로 이출되는지를 확인하는데, 이는 LMNG 세제 미셀과 함께 TMEM120A M207A 이합체를 나타냅니다(그림 2B).
      참고: 때때로 단량체 단백질 밴드가 약 50 kDa 정도로 나타날 수 있는데, 이는 세척제로 용해된 막 단백질에서 흔히 나타나며, 막 단백질 샘플을 끓이는 것은 일반적이지 않기 때문입니다.

2. 나노 차동 주사 형광측정법(NanoDSF)을 통한 열 안정성 분석(NanoDSF)

  1. 정제된 TMEM120A M207A 단백질을 SEC 버퍼(25 mM HEPES, pH 7.8, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG)에서 0.15 mg/mL로 희석합니다.
  2. 각 샘플당 10 μL을 고감도 모세혈관에 주입합니다.
  3. 온도 램프가 25 °C에서 90 °C로 올라가는 NanoDSF 기기에서 열 이동 분석을 수행하세요.
  4. 호환 가능한 소프트웨어를 사용해 분석법을 설정하고 자동 분석을 수행하세요.
  5. 단일 열전이(Tm) 곡선이 보이는지 확인하여 협력적 전개 사건을 나타냅니다(그림 3).

3. 올리고머 상태 결정을 위한 질량 광도 측정

  1. SEC 버퍼(25 mM HEPES, pH 7.8, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG)에서 80 nM으로 희석한 샘플을 준비합니다.
  2. 샘플을 미리 세척된 질량 광도 측정 호환 슬라이드에 넣습니다.
  3. 표준 설정을 사용하여 데이터를 획득하고 단백질 표준을 사용하여 교정합니다.
  4. 분석 소프트웨어를 이용해 데이터를 처리하여 대량 분포 히스토그램을 생성합니다(그림 4A-C).

4. 생물층 간섭계(BLI) 프로토콜

참고: 이 프로토콜은 384웰 마이크로플레이트 형식을 사용하여 FLAG 태그 TMEM120A M207A 와 GsMTx4와 같은 리간드 간의 상호작용을 연구하기 위해 설계된 BLI 동역학 분석법을 설명합니다. TMEM120A을 위해 개발되었지만, 이 워크플로우는 다른 막 단백질에도 적용할 수 있습니다. 모든 실험은 FLAG 바이오센서 프로브를 이용한 광학 간섭계 플랫폼을 사용하여 FLAG 태그가 부착된 TMEM120A M207A를 고정시켰습니다. 384웰 블랙 마이크로플레이트와 최적화된 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 버퍼가 사용되었으며, 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% (w/v) LMNG, 0.0005% Tween-20, pH 7.8을 포함하였다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해 트윈-20을 포함했습니다. 단백질 농도는 250 nM로 유지되었고, 재현성을 보장하기 위해 모든 분석은 두 번씩 수행되었다.

  1. 분석 설계 고려사항
    1. 온도 평형
      1. BLI 분석기 시작 전에, 버퍼, 샘플, 바이오센서 프로브 등 모든 분석 구성 요소를 실온(약 20-25°C)에 평형으로 맞추세요. 데이터 수집 중에는 단백질 안정성, 리간드 결합 및 재현성 최적화를 위해 권장되는 30°C 온도를 유지하세요.
        참고: 이 평형 단계는 일관된 운동 프로파일을 보장하고 실험 중 온도 변동으로 인한 아티팩트를 최소화합니다. 모든 시약과 바이오센서가 열 평형에 도달할 때까지 충분한 시간(최소 10-15분)을 확보한 후 분석이 시작됩니다.
    2. 센서 수분 및 재생
      1. 사용 최소 10분 전 Max 플레이트에 250 μL BLI 호환 버퍼(SEC 버퍼, 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% w/v LMNG, 0.0005% Tween-20, pH 7.8 포함)에 하이드레이트합니다.
        참고: 바이오센서는 깨끗하고 먼지 없는 핀셋으로 조심하여 오염을 피해야 하며, 오염은 신호 획득에 방해가 되어 결과가 일관되지 않을 수 있습니다. 센서 재사용을 위해서는 Q 버퍼(0.3 M 글리신, pH 3.8)를 사용해 재생을 수행하세요. 적절한 수분 공급과 재생은 센서 성능과 재현성을 유지하는 데 매우 중요하며, 특히 환경 조건에 민감한 세제 용해성 막 단백질을 다룰 때 더욱 그렇습니다.
    3. 버퍼 처리
      1. 액체를 공급할 때는 공기 방울을 피하세요. 공기 방울은 광학 신호 획득에 방해가 될 수 있습니다.
    4. 버퍼 조성 및 일관성
      1. 단백질 기능을 보존하면서 비특이적 상호작용을 최소화하는 완충제를 사용하세요. TMEM120A M207A의 경우, 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% (w/v) LMNG, 0.0005% (w/v) 트윈 20, pH 7.8을 포함한 버퍼를 준비합니다.
    5. 단백질 고정
      1. 리간드 부하를 최적화하여 센서 포화도를 50-80% 달성하세요. 250 nM의 고정된 단백질 농도를 사용하며, 일반적인 로딩 시간은 약 120초입니다. FLAG 태그가 부착된 TMEM120A M207A(250 nM)를 바이오센서에 120초간 로드하여 50-80% 포화도를 달성하세요.
      2. 로드 단계에서 바이오센서 신호가 최대 결합 용량의 50-80% 에 도달하는지 확인하세요.
        참고: 50% 미만 의 신호는 단백질 고정 불량을 나타낼 수 있으며, 80% 이상 은 질량 수송 제한이나 입체 장애를 초래하여 동역학적 측정에 영향을 줄 수 있습니다.
      3. 잠재적 질량 수송 효과를 평가하기 위해, 분석 물질 농도(예: 100 nM GsMTx4)를 일정하게 유지하고 FLAG 바이오센서에서 TMEM120A-M207A의 부하 수준을 변화시키는 대조 실험을 수행하십시오(보충 그림 S1).
        참고: 이후 측정 속도 측정(연관, 해리, 전역 결합 적합, k온/k 오프 결정 포함)은 주 검사에서 얻은 것과 유의미한 차이가 없었습니다. 이 결과는 50-80% 범위 내의 TMEM120A 부하가 유의미한 질량 수송 인위물을 유발하지 않음을 나타내며, 바이오센서 부하 수준이 신뢰할 수 있는 운동학 분석에 적합함을 확인시켜 줍니다.
    6. KD 추정
      1. 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM의 분석물(GsMTx4) 농도를 시험하여 결합 친화도(KD)를 결정합니다.
    7. 백그라운드 신호 제어
      1. 배경 신호를 정확히 빼고 신뢰할 수 있는 운동 측정을 보장하기 위한 적절한 제어 장치를 포함하세요.
      2. 분석 중 발생할 수 있는 비특이적 결합이나 드리프트를 고려하기 위해 참조 FLAG 프로브를 사용하세요.
        참고: 이 기준 프로브는 표적 단백질을 고정시켜서는 안 되며, 샘플 내 프로브에서 얻은 신호를 보정하는 기준선 역할을 합니다.
      3. 샘플 신호에서 참조 신호를 빼면 FLAG 태그가 부착된 TMEM120A M207A와 분석물 간의 특정 상호작용만 분석합니다.
        참고: 기준 FLAG 프로브가 분석기 전반에 걸쳐 최소한의 신호를 보여준다는 것을 확인하세요. 안정적이고 낮은 기준선은 무시할 정도로 비특이적 결합을 의미합니다. 기준 신호가 변동하거나 증가하면, 비특이적 상호작용을 줄이기 위해 버퍼 조성, 프로브 취급 또는 샘플 준비를 재평가한 후 동역학적 분석을 진행합니다.
  2. 동역학 분석을 위한 기본 분석 매개변수 구성
    1. 데이터 수집 주파수를 5Hz로 설정하여 5개의 데이터 포인트/초를 수집하세요(모든 동역학 분석에 권장됨).
    2. 플레이트 포맷으로 384-웰 플레이트 를 선택하세요.
    3. 셰이커 속도를 1,000 RPM으로 설정하고, 온도는 주변 온도와 30 °C 사이로 설정합니다(이 실험에서는 최적의 동역학 결과를 위해 30 °C를 사용).
  3. 플레이트 세팅을 구성하세요.
    1. 플레이트 설정 탭으로 이동하여 384웰 플레이트와 최대 플레이트 모두에 대해 웰 할당을 정의하세요.
    2. 384웰 플레이트에 웰 기능을 할당합니다.
      참고: 384웰 플레이트와 맥스 플레이트에 사용된 기호와 주석은 보충 표 S1에 요약되어 있습니다.
      1. 웰은 역할에 따라 표지하세요: 버퍼, 단백질(로딩), 리간드(샘플).
      2. 단백질 로딩 웰에 농도(예: 250 nM)를 주석으로 표시하여 동성 분석에 활용합니다.
        참고: k와K D를 계산하는 데 정확한 라벨링이 필수적입니다(보충 그림 S2A 참조).
    3. Max 플레이트 맵(프로브 플레이트)을 설정하세요.
      1. 적절한 우물에 바이오센서 프로브를 할당하세요.
      2. 프로브 재생이 계획되어 있다면, 재생 및 중화 완충 유물을 할당하세요. 재생 시 적절한 자동화를 보장하기 위해 소프트웨어에서 이 우물들을 명확히 표시하세요( 보충표 S2 참조).
        참고: 분석 완충액은 25 mM HEPES (pH 7.8), 200 mM NaCl, 0.00015% (w/v) LMNG, 0.0005% (v/v) Tween-20으로 구성되었습니다. 항-FLAG 바이오센서 프로브의 재생 단계는 0.3% 글리신(pH 3.8)을 함유한 Q 버퍼를 사용하여 수행되었고, 이어서 분석 버퍼(25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG, 0.0005% Tween-20, pH 7.8)를 사용한 중화 단계가 진행되었습니다.
  4. 분석 단계 탭을 선택하세요.
    1. 분석 단계 탭으로 이동하여 동정 분석 워크플로우를 설정하세요. 각 분석상별로 기준선, 단백질 로딩, 결합, 해리 등 웰 위치를 지정하세요(보조 그림 S3 참조).
    2. 드롭다운 메뉴에서 적절한 단계 유형을 선택하세요. 정확한 운동학적 분석을 위해 연관 및 해리 단계가 올바르게 라벨링되었는지 확인하세요.
    3. 각 단계의 시간을 초 단위로 입력하여 모든 상호작용 단계의 노출 시간을 정의합니다.
      1. 단백질 로딩 전에 센서 평형을 맞추기 위해 기준 단계 시간을 설정하세요(60초).
      2. 단백질 로딩 단계 시간을 원하는 리간드 고정 수준(60초)에 맞추도록 설정합니다(그림 5).
      3. 결합 단계 시간을 충분한 분석물 결합(300초)에 맞게 설정하세요(그림 5).
      4. 해리 단계 시간을 설정하여 분석물 해결합 동역학을 적절히 포착하도록 설정하세요(600초)(그림 5).
    4. 각 단계별로 셰이커 속도(RPM)를 설정하여 일관된 믹싱과 최적의 데이터 품질(1,000 RPM)을 유지하세요.
  5. 정렬 및 필터링 단계 ( 보충 그림 S4 및 보완 그림 S5 참조)
    1. 필요에 따라 데이터 범위를 조정하여 운동 스텝에서 발생하는 아티팩트를 제거하여 원시 데이터 보정을 수행합니다.
    2. Y축을 정렬하려면, Align Step Type에서 Association을 선택하고 Begin 옵션을 활성화하여 연관 단계 시작 시 데이터를 정렬하세요.
    3. 표준 동역학 분석 중 단계 간 연속성을 유지하기 위해 Interstep 보정 옵션을 활성화하세요.
    4. 필터링: 데이터 스무딩을 적용하여 왜곡 추세 없이 신호 잡음을 줄입니다. 처리된 데이터를 원시 신호와 비교하려면 처리됨을 선택하세요.
  6. 참조 단계를 설정하세요( 보충 그림 S6 참조).
    1. 참조 프로브를 선택한 후 Ref. 프로브 버튼을 클릭하여 참조 프로브를 지정하세요.
    2. 샘플 프로브의 해당 열 번호를 클릭하여 샘플 프로브를 선택하세요.
    3. 뺄셈 함수를 정의하려면 공식 편집기를 열고 ' Edit Formula'를 클릭한 뒤, 배경을 제거하기 위해 뺄셈 함수를 정의하세요.
    4. 참조 뺄셈이 올바르게 적용되었는지 확인하기 위해 표 뷰를 검토합니다.
  7. 결속 맞춤 단계
    1. Fitting 탭으로 이동하여 분석 매개변수를 정의하세요(보조 그림 S7).
    2. 데이터 선택: 국소 동역학적 적합을 위해 결합 및 해리 단계를 모두 포함시킴. 곡선 적합이 좋지 않거나 신호가 불규칙하면 이상치를 수동으로 제외하세요.
    3. 결합 모델 선택: 복잡한 동작이 관찰되지 않는 한 데이터를 맞추기 위해 1:1 결합 모델을 선택하세요. 곡선 오버레이와 잔차를 검토하여 모델 적합성을 검증하세요.
    4. 적합 전략: 데이터 품질과 실험 목표에 따라 다음 적합 전략 중 하나를 선택하세요:
      1. 국소: 각 분석물 농도에 개별적으로 적합하여 연관 및 해리 동역학을 독립적으로 평가할 수 있게 합니다.
      2. 글로벌: 단일 운동 매개변수 세트를 사용하여 모든 분석 물질 농도를 동시에 적합하여 데이터셋의 전체 모델을 제공합니다.
      3. 완전: 전 세계적으로 모든 집중 영역에서 연관 및 해리 단계에 해당합니다.
      4. 부분 단계: 연상 단계에만 해당하며, 해리는 무시합니다.
        참고: BLI 데이터는 국소 완전 적합을 적용한 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 분석되었습니다. 국소 적합은 각 분석 물질 농도가 독립적으로 처리되도록 보장하여, 해리 단계에서 이질성으로 인한 인공물을 최소화하면서 결합 속도론을 정확하게 표현합니다. 이 접근법은 가변적이거나 불안정한 신호가 있는 영역에서 과적합을 방지하여 운동 매개변수(k 개가 켜 지고k개가 꺼짐)를 보다 신뢰성 있게 추정할 수 있게 합니다(표 1 및 표 2).
  8. 운동 해석
    1. 적합 곡선과 잔차 검토: 적합 곡선과 해당 잔차를 검토하여 모델의 품질과 타당성을 평가합니다. 잔차가 체계적인 편차 없이 0 근처에서 무작위로 분포되어 있음을 확인한다(대표 잔차는 그림 4E 참조).
    2. 적합하지 않은 데이터 배제: 평탄하거나 잡음이 있거나 신뢰할 수 없는 신호를 보이는 분석 물질 농도를 제거하여 전체 모델 정확도를 향상시킵니다.
      참고: 예를 들어, 10 μM 농도는 5 μM 데이터셋과 겹쳐 동역학적 매개변수 추정이 왜곡될 수 있어 적합에서 제외되었습니다(그림 6A,B 참조).

결과

TMEM120 M207A 돌연변이는 pCDNA3.1 벡터를 사용하여 N-말단 FLAG 태그를 인코딩하여 HEK293SF-17 현탁 세포에서 발현되었습니다( 그림 1). 일시적 형질전환은 재조합 단백질 발현을 가능하게 했습니다. 세포 채취 후, 막 단백질은 0.5% 라우릴 말토스 네펜틸 글리콜(LMNG)에 용해되었으며, LMNG는 막 단백질 용해성 유지에 적합한 비이온 세제입니다.

용해된 분획은 anti-FLAG M2 수지를 이용한 친화성 정제에 노출되었습니다. 수지는 0.01% LMNG가 포함된 버퍼로 세척되어 비특이적 결합 단백질을 제거했고, M207A TMEM120 0.001% LMNG가 포함된 버퍼에서 용출되었습니다. 용출은 샘플 수율에 따라 분자량 컷오프가 30 kDa 또는 100 kDa인 원심 필터를 사용해 농축되었습니다. 추가 정제는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 수행되었습니다. 마지막 SEC 단계는 0.00015% LMNG를 포함한 버퍼에서 수행되어, 이후 구조 및 기능 분석에 적합한 균질하고 안정적인 단백질 준비물과 일치하는 단분산 용출 프로파일을 생성했습니다(그림 2B).

FLAG 태그 TMEM120 M207A의 최적화 및 생물물리학적 특성 분석은 그림 2에 요약되어 있습니다. SDS-PAGE는 약 50 kDa의 단일 밴드를 확인하여 발현과 정제를 확인했습니다. 관찰된 이동은 단량체 형태의 예상 분자량보다 약간 높았으며(그림 2A), 이는 전기영동 이전에 비끓인 샘플 때문인 것으로 보입니다. SEC 크로마토그램은 약 0.00015% (w/v) LMNG 내에서 약 150 kDa의 외관분자 질량에 해당하는 단일 대칭 피크가 용출되었음을 보여주었으며(그림 2B), 이는 LMNG 세제 미셀 내 TMEM120A M207A 이합체와 일치합니다. 이 용출 행동은 균일하고 단일분산된 단백질 집단을 나타내어 하류 생물물리학적 특성 분석에 적합합니다.

실험적 완충 조건 하에서 LMNG의 세제 미셀 특성을 질량 광도계를 사용해 분석하였다. 단백질이 없는 상태에서 LMNG 농도가 다양한 SEC 버퍼에서 세제 미셀이 투명 분자질에 미치는 기여도를 평가하기 위해 측정이 수행되었습니다. 임계 미셀 농도(CMC)보다 높은 0.001% (w/v) LMNG에서는 약 69 kDa에서 우세한 피크가 검출되었으며, 이는 단백질 없이 LMNG 미셀만 존재하는 수준에 해당합니다 (그림 4A). LMNG 농도가 CMC 이하로 0.0001%(w/v)로 낮아지자, 주요 종은 ~48 kDa로 이동하여, 단백질이 없는 더 작은 잔류 LMNG 집합체 또는 아미셀러 조립체가 존재함을 나타냈다(그림 4B). 더 나아가서(그림 4C) TMEM120A M207A는 질량 광도계를 통해 올리고머 상태를 평가하기 위해 다양한 LMNG 농도의 SEC 버퍼에 희석되었습니다. 0.00001% LMNG(CMC 약 20배 낮은 마젠타)에서 약 42 kDa에서 우세한 피크가 관찰되었으며, 이는 M207A의 단량체TMEM120A 해당합니다. 0.00015% LMNG(CMC 약 10배 낮은 파란색)에서 주 개체군은 ~86 kDa에서 이중체 존재를 나타냈습니다. LMNG 농도를 0.001%(CMC보다 ~2배 높은 주황색)로 증가시켰을 때, 주요 종 ~150 kDa가 나오며, 이는 단백질-세제 복합체와 일치합니다. 0.002% LMNG(CMC ~4배 위, 녹색)에서는 약 180 kDa 중심의 넓은 분포가 검출되었으며, 이는 더 큰 미셀 연관 조립체 또는 고차 올리고머를 나타냅니다. 이 결과는 SEC 버퍼 내 LMNG 농도가 TMEM120A M207A의 투명 올리고머 상태에 강한 영향을 미치며, CMC 아래에서는 단량체-이합체 평형이 관찰되고 세제-단백질 복합체 형성이 CMC 위에서 우세함을 보인다.

주 SEC 피크에서 수집된 TMEM120A M207A의 열역학적 안정성은 SEC 버퍼(25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% (w/v) LMNG, pH 7.8)에 보관됨을 열변성 분석을 통해 평가되었습니다. 단백질은 약 46 °C에서 융해점(Tm)에 해당하는 변곡점을 보였으며, 이는 세제 용해된 조건에서 해당합니다. 이 Tm 값은 중간 정도의 열적 안정성을 나타내며, M207A TMEM120A LMNG 미셀 내에서 적절히 접힌 구조를 유지하지만 더 높은 온도에서 펼쳐지거나 응집되기 시작할 수 있음을 시사합니다.

생물층 간섭계(BLI)는 M207A TMEM120A GsMTx4T 간의 μM 결합 친화도를 보여줍니다. 그림 5 의 흔적은 다섯 가지 실험 단계를 보여줍니다: (1) 기준선, (2) TMEM120A M207A 샘플 로딩, (3) 비특이적 결합 및 과잉 TMEM120A M207A 제거 기준선, (4) 결합, (5) 해리. 고정된 TMEM120A M207A와 상호작용하는 GsMTx4(0, 5, 10, 20, 30, 50, 100 μM) 농도가 증가함에 따라 파장 이동(nm)을 기록합니다.

초기 기준선(1단계) 동안 신호는 안정적으로 유지되어 버퍼 내 센서 평형을 확인했습니다. M207A 부하(2단계)TMEM120A 센서 전반에 걸쳐 약 50-80%의 프로브 포화에 해당하는 신호 증가가 특징적으로 증가했습니다. 부하 단계는 급격한 고원 대신 약간 곡선 반응을 보였는데, 이는 부분 질량 수송 제한을 반영할 수 있습니다. M207A 확산이 센서 표면으로의 확산이 결합 속도보다 느리TMEM120A 이는 막이나 세제로 용해된 단백질에서 흔히 나타나 표면 덮개에 영향을 줄 수 있습니다.

이후 기본 단계(3단계)는 M207A를 묶지 않았거나 느슨하게 부착된 TMEM120A 효과적으로 제거했습니다. 결합 단계(4단계) 동안 GsMTx4 농도가 증가하면 파장 이동이 농도에 따라 명확하게 증가했습니다. 해리 과정(5단계) 동안, 바이오센서는 CMC 약 10배 아래에 LMNG가 포함된 SEC 버퍼에 배치되었습니다. 해리 초기 5-10초 동안 신호가 급격히 감소했는데, 이는 쉽게 접근 가능한 부위에서 GsMTx4가 빠르게 방출되었음을 나타내며, 이어서 느린 해리 동역을 가진 더 안정적인 TMEM120A M207A-GsMTx4 복합체를 반영하는 느린 붕괴가 이어졌다. 실험 내내 기준 프로브 신호는 평평하게 유지되어 비특이적 결합이 최소화되었음을 나타냈다. 전반적으로 이 데이터는 M207A-GsMTx4 TMEM120A 상호작용을 보여줍니다; 그러나 세제 환경과 잠재적 질량 수송 효과로 인해 관측된 동역학은 신중하게 해석되어야 합니다.

참조 프로브 감산 후 처리된 데이터의 연관 및 해리 센서그램(그림 6A)은 GsMTx4에 대해 5-100 μM 범위의 농도 의존적 반응을 보였다. 리간드 농도가 증가할수록 점점 더 높은 파장 이동이 발생했고, 이후 200초 해리 단계에서 점진적이고 느리게 감소했다. 10 μM 데이터셋은 5 μM 트레이스와 겹쳐 적합에서 제외되어 전체 모델 품질이 향상되었습니다.

동역학적 분석은 개별 분석물 농도를 공유된 동역학적 틀 내에서 독립적으로 적합된 국소 완전적합 전략과 함께 1:1 랭뮤어 연관-해리 모델을 사용하여 수행되었습니다(그림 6B). 적합된 곡선(빨간색)은 실험 흔적과 잘 일치하여 저미세몰 범위의 추정 해리 상수(KD)를 산출했다. 잔류 분석(그림 6C)에서는 주요 체계적 편차가 발견되지 않아 적용된 모델이 데이터셋에 적합함을 나타냈습니다. 초기 결합 단계에서 관찰된 미세한 차이는 대량 수송의 한계나 세제 미셀 환경의 영향을 반영할 수 있습니다. 추가 적합 연관 및 해리 곡선, 잔류 플롯, 여러 분석 복제 및 프로브 위치에 걸친 적합 통계 예시는 보충 그림 S8에 나와 있습니다.

원시 데이터(그림 5)에서 해리 초기 5-10초 동안 신호가 급격히 감소했는데, 이는 쉽게 접근 가능한 부위에서 GsMTx4가 빠르게 방출되었음을 나타내며, 이어서 느린 붕괴가 이어지는데, 이는 더 안정적인 M207A-GsMTx4 복합체가 느린 해리 동역을 TMEM120A 반영할 수 있습니다. 따라서 표 2에서는 처음 100회의 해리가 적합에서 제외되었습니다. 체계적 편차가 없다는 것은 모든 검사 농도에서 TMEM120A M207A에 대해 국부적인 완전 적합 랭뮤어 1:1 모델의 적합도를 잘 나타냅니다(그림 7).

GsMTx4가 M207A TMEM120A에 결합하는 운동학적 분석은 5-100 μM 리간드 범위에서 농도 의존적 연관 및 해리 행동을 보였다(표 1). 관찰된 연관률 상수(kon)는 GsMTx4 농도 상승에 따라 약 1.0 × 10⁻⁶에서 3.2 × 10-6 1/M·s까지 소폭 증가했으며, 추정 해리율 상수(koff)는 실험 오차 내에서 거의 0에 가까웠으며, 이는 시험 조건에서 느리거나 무시할 수 있는 해리 위상을 시사합니다. 계산된 평형 해리 상수(Kd)는 저에서 중간 마이크로몰라 범위(~0.8-3.3 μM)로, 중간 정도의 친화력 상호작용과 일치하였다. Langmuir 1:1 결합 모델을 사용한 국소 완전 적합은 모든 GsMTx4 농도에서 고품질 적합을 보여주었으며, 상관계수는 0.99를 초과하고 결합 및 해리 단계 모두에서 낮은 상대 χ2 값을 보였습니다(표 1). 계산된 평형 해리 상수는 농도와 복제에 관계없이 일관되었으며, KD 값은 저미세몰 범위(~1-2 μM)에 위치해 M207A와 GsMTx4 간의 중간 정도TMEM120A 특이적 결합을 나타냈다.

각 농도별 복제 데이터셋은 연관 적합과 해리 적합 모두에서 높은 상관계수(R² > 0.99)로 재현성을 보였다. 전체 및 상대 χ² 값은 모두 낮고 복제체 간 유사성을 보였으며, 이는 분석에 적용된 1:1 랭뮤어 결합 모델의 견고성을 더욱 뒷받침하였습니다. 더 높은 리간드 농도(≥50 μM)에서는 k온 과 KD 값이 약간 증가했는데, 이는 진정한 친화성 변화보다는 미미한 질량 수송 효과나 국소 표면 이질성을 반영할 수 있습니다. 여러 복제와 프로브 위치에 걸친 운동 일관성은 보충 그림 S9에서 더 자세히 설명되어 있습니다.

이 동역학 프로파일은 GsMTx4가 TMEM120A M207A와 특이적이고 안정적으로 상호작용하며, 느린 해리와 미세몰 결합 친화성을 특징으로 하는 비교적 안정적인 복합체를 형성함을 보여줍니다.

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그림 1: HEK293SF-17 부탁 세포에서 발현된 M207A 돌연변이체TMEM120A 정제 작업 흐름. 단백질 정제 절차의 개략 개요. TMEM120A M207A는 HEK293SF-17 세포에서 pCDNA3.1 플라스미드에서 발현되었습니다. 세포는 0.5% LMNG에 용해되었고, 이어서 항-FLAG M2 수지를 이용한 친화성 정제가 이루어졌습니다. 수지는 0.01% LMNG가 포함된 버퍼로 세척하여 비특이적 결합 단백질을 제거했습니다. TMEM120A M207A는 0.001% LMNG가 함유된 버퍼에서 용출되었습니다. 엘루에이트는 100 kDa 또는 30 kDa 분자량 차단 필터를 사용해 농축되었고, 0.00015% LMNG를 포함한 완충액에서 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 정제된 TMEM120A M207A의 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS PAGE, LMNG 세제 (A) 크기 배제 크로마토그래피로 정제된 FLAG 태그 TMEM120A M207A SDS-PAGE. 단백질 밴드는 레인 1에서 ~50 kDa 크기에 나타나며, 이는 예상 단량체에 해당합니다. (B) 정제된 TMEM120A M207A의 SEC 컬럼에서 SEC 버퍼(25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0.00015% LMNG, pH 7.8)의 SEC 프로파일. 단백질 용출은 하류 생물물리학적 분석에 적합한 우세한 단일 분산 종을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: LMNG에서 정제된 TMEM120A M207A의 차동 주사 형광측정. DSF는 46 °C에서 열역학적 변곡점을 밝혀 테스트된 완충 조건에서 단백질의 열 안정성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 질량 광도 측정 기법을 이용한 LMNG 세제 내 정제 TMEM120A M207A 특성 분석. (A,B) 다양한 LMNG 농도를 가진 SEC 버퍼의 질량 광도 측정. 0.001% LMNG(임계 미셀 농도인 CMC 이상)에서는 겉보기 분자량이 ~69 kDa로, 주로 LMNG 미셀에 해당합니다. LMNG 0.0001%(CMC보다 10배 낮음)에서는 ~48 kDa에서 정상이 나타납니다. (C) LMNG 농도 의존적 TMEM120A 올리고머화 영향에 대한 질량 광도 분석. 0.00001% LMNG(CMC보다 약 20배 낮은 자주색)의 TMEM120A은 약 42 kDa(단량체)에서 주요 개체군을 보입니다. 0.00015% LMNG(CMC ~10배 낮은 파란색)에서는 ~86 kDa 개체군이 관찰되며, 이는 다이머와 일치합니다. 0.001% LMNG(CMC 약 2배 높은 주황색)에서는 ~150 kDa의 주요 종이 단백질-세제 복합체에 해당합니다. 0.002% LMNG(CMC ~4배 위, 녹색)에서는 ~180 kDa 중심의 넓은 분포는 더 큰 미셀 연관 조립체 또는 고차 올리고머를 나타냅니다. 이 결과들은 LMNG 농도가 TMEM120A의 겉보기 올리고머 상태에 강한 영향을 미치며, CMC 아래에서는 단량체-이합체 평형이 관찰되고 CMC 위에서는 단백질-세제 복합체 형성이 우세함을 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 소프트웨어에서 나온 원시 데이터, TMEM120A M207A-GsMTx4 상호작용. 생물층 간섭계는 TMEM120A(M207A)가 기계감응 채널 억제제인 GsMTx4에 미세몰 친화력으로 결합함을 입증합니다. 그림은 Gator Prime 소프트웨어에서 얻은 원시 BLI 반응 데이터를 보여주며, 다섯 가지 주요 분석단계를 구분합니다: (1) 신호가 안정적으로 유지된 초기 기준선; (2) 단백질 고정(로딩)으로 인해 약 1.5 nm의 파장 이동이 증가함; (3) 결합되지 않았거나 느슨하게 결합된 단백질을 제거할 수 있는 2차 기준선; (4) 결합상(리간드 결합), GsMTx4 농도가 증가하면 300초 이내에 ~~5 nm까지 반응 상승이 나타납니다; 그리고 (5) 해리 단계(리간드 방출)는 600초 동안 점진적으로 신호 감쇠를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 6: TMEM120A M207A와 GsMTx4 펩타이드의 결합 동역학. (A) 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM 다섯 농도에서 TMEM120A M207A의 결합 및 해리 센서그램이 GsMTx4와 상호작용. 10 μM 데이터셋은 5 μM 곡선과 겹쳐 전체 모델 적합도가 향상되어 적합도에서 제외되었습니다. 세로 점선의 빨간 선은 해리 단계의 시작과 종료를 나타냅니다. (B) 센서그램 적합은 Local Full Fitting Langmuir 1:1 연관-해리 모델을 사용해 수행되었다. 빨간 곡선은 적합 모델을 나타내며, 실험 흔적은 각 GsMTx4 농도별 측정된 연관 및 해리 데이터(조건당 두 번의 복제)에 해당합니다. (C) 실험 데이터와 적합 모델 간의 연관 및 해리 단계 모두에서 편차를 보여주는 잔여 플롯으로, 적합도의 우수성을 확인함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 7: 적합 결합 곡선에 해당하는 잔여 플롯. 각 그래프는 단일 GsMTx4 농도(5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM)에 대한 잔차(실험 데이터와 적합 모델 간 차이)를 나타냅니다. 잔차는 시프트 편차(nm)와 시간(s) 대비로 표시되며, 결합 및 해리 상 모두에서 0 근처의 무작위 분포를 나타냅니다. 체계적인 편차가 없다는 것은 모든 시험 농도에서 M207A에 대해 Local Full Fitting Langmuir 1:1 모델TMEM120A 잘 적합함을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: GsMTx4에 결합한 TMEM120A M207A 반응 속도 매개변수 요약. 동역학 파라미터는 랭뮤어 1:1 결합 모델을 이용한 국소 풀 피팅에서 얻어졌습니다. 각 GsMTx4 농도와 복제에 대해 연관(k온), 해리(k오프), 관찰된 속도 상수(kobs), 평형 해리 상수(KD)가 보고됩니다. 적합성 질은 완전 단계, 연관 단계, 해리 단계에 대해 R² 및 χ² 값을 사용하여 평가하였다. 모든 농도에서 적합은 높은 상관계수(R² > 0.99)와 낮은 상대 χ² 값을 보여 신뢰할 수 있는 모델 성능을 나타냈다. 노트: M Conc.는 GsMTx4(μM)의 농도를 나타냅니다. KOBS 는 관측된 속도 상수를 나타내며, 결합된 연관 및 해리 과정을 반영합니다. kobs, kon, k off 에 대한 보고된 오류는 적합 불확실성을 반영합니다. R² 값은 완전, 연관, 해리 단계에 대한 적합도를 나타냅니다. 상대 χ² 값은 정규화된 적합도(goodness-offit) 지표를 나타내며, 절대 χ² 값은 관측된 데이터와 적합 데이터 간의 잔여 편차를 나타냅니다. 약어: kon = 연관 속도 상수 (1/M·s); koff, = 해리 속도 상수 (1/s); kobs = 관측된 속도 상수(1/s); KD = 평형 해리 상수; Rmax = 최대 응답; Req = 평형 반응. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 처리 매개변수 및 운동학 적합의 잔차. 처리 매개변수: 연관 시작 0초; 어소시에이션 엔드, 300 남반; 해리 시작 시 100초; 해리 종료 300초. 최소 R² 값 0.9; 최대 χ² 값, 8. 정렬 단계: 한 단계 끝(지수 = 1, 평균 = 0). 연관 단계에서 단계별 보정이 적용되었습니다. 협회 평균 50점; 해리 평균은 0. 사비츠키-골레이 평활화는 비활성화되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S1: 고정된 농도(100 nM)의 GsMTx4 펩타이드와 함께 항FLAG 프로브에 다양한 농도의 M207A 단백질을 적재하는 최적화 실험TMEM120A. (A) 동역학 측정의 다섯 단계를 보여주는 원시 BLI 센서그램: (1) SEC 버퍼 또는 분석 버퍼(25 mM HEPES, pH 7.8; 200 mM NaCl; 0.00015% (w/v) LMNG; 0.0005% (v/v) 트윈-20); (2) FLAG 프로브에 네 가지 농도의 M207A TMEM120A 적재, 참조 프로브(주황색)를 음성 대조군으로 사용하여 비특이적 결합 부재를 확인; (3) 2베이스라인 스텝에서; (4) 연상 단계, (5) 해리 단계. (B) 100 nM GsMTx4 펩타이드와 상호작용하는 네 가지 TMEM120A M207A 농도에 적합한 글로벌 1:1 결합 모델. (C) 결합 및 해리 단계 모두에 대한 잔류 플롯으로, 적합 모델과의 편차가 최소화된 것으로 보입니다(<0.05 nm). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 S2: 플레이트 설치 및 분석 구성. (A) 384웰 플레이트를 위한 플레이트 설계, 다양한 매개변수를 할당할 수 있는 경우. 샘플은 다양한 농도에서 리간드(GsMTx4)에 해당합니다. 주황색 웰은 250 nM TMEM120 M207A 단백질임을 나타냅니다. 웰은 250 nM에서 단백질 복제를 나타내며, 동일한 버퍼를 기준선, 연합, 해리 단계에 사용했습니다. (B) Max 플레이트 뷰에서 네 개의 안티-FLAG 바이오센서 프로브를 보여줌: 참조 프로브 1개와 단백질 복제용 3개 프로브. 모든 프로브는 분석 버퍼에서 미리 습윤된 후 Q 버퍼에서 재생된 후 분석 버퍼에서 중화되었습니다. 동일한 완충 장치는 기저선, 연상, 해리 단계 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S3: 분석법 설정 주기, 기준선, 단백질 로딩, 2차 기저선, 연관, 해리를 포함합니다. 약어: B = 버퍼; L = 하중; 0, 5, 10, 20, 30, 50, 100 = GsMTx4 농도(μM)입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보충 그림 S4: 새로운 운동학(K) 분석 워크플로우. 단일 실험 내에서 수행된 모든 분석의 개요를 제공하는 실험 아이콘을 선택하세요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S5: 새로운 운동학(K) 분석 워크플로우.정렬 및 필터 아이콘으로, 연관 및 해리 단계의 원시 데이터를 검토하고 분석할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S6: 새로운 운동학(K) 분석 워크플로우.배경 뺄셈과 정확한 데이터 해석을 위한 적절한 참조 센서를 선택하는 데 사용되는 참조 아이콘을 설정하세요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S7: 운동 분석 워크플로우에서의 바인딩 피팅 단계. 결합 상호작용 데이터를 분석하는 데 사용되는 운동 적합 매개변수 설정. 이 모델은 단일 리간드 결합 부위와의 1:1 상호작용을 가정합니다. 적합 유형은 Local로 설정되어 각 집중 곡선을 전역적으로 적합하지 않고 독립적으로 적합합니다. 풀 스티치가 활성화된 풀 피팅 옵션은 연속 연관 곡선과 해리 곡선을 모두 포함합니다. 연상 단계와 해리 단계의 시간 창은 각각 0에서 300초, 0에서 200초로 설정되어 있습니다. 배경에서는 바인딩 적합 그래프, 잔차 그래프, 개별 분석 곡선이 적합 품질과 실험 변동성을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S8: 운동 분석 워크플로우에서의 결합 적합 단계. 결합 적합 그래프는 여러 분석법 복제 및 프로브 위치(C1 및 D1)에서 결합 및 해리 단계를 보여줍니다. 아래 잔차 그래프는 적합 품질을 평가하며, 잔차는 실험 데이터와 적합 모델 간의 차이를 나타냅니다; 0에 가까운 값은 좋은 적합을 반영합니다. 첨부된 표는 각 복제에 대한 전체 R², 연관 R², 해리 R², 카이제곱(X²) 값을 포함한 적합 통계량을 요약합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 S9: 운동 분석 워크플로우에서 바인딩 피팅 단계. 다중 복제와 프로브 위치(C1 및 D1)에서의 결합 상호작용의 동역학적 분석. 센서 반응 이동(nm)은 시간에 따른 연관 및 해리 단계를 나타내며, 각 곡선은 분석법과 프로브 위치에 따라 색상으로 구분됩니다. 세로 점선의 빨간 선은 연관(0-300초)과 해리 단계 사이의 전환을 표시합니다. 아래 표는 1:1 결합 모델 적합에서 도출된 운동학적 매개변수를 보고하며, 여기에는 분석물 농도(M Conc.), 결합률 상수(kon), 해리율 상수(koff), 오차, 평형 해리 상수(KD)가 포함됩니다. 일관된 적합 품질은 운동 측정의 견고함을 뒷받침합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 S1: 384 웰 판과 맥스 판에 사용된 기호를 보여주는 표. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 S2: 고정된 kon 및 koff 값을 사용하여 FLAG 바이오센서에 적재된 TMEM120A M207A 4가지 농도의 동역학적 매개변수를 100 nM GsMTx4 펩타이드와 상호작용합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주십시오.

토론

막 단백질 상호작용의 특성화는 세밀한 단백질 정제, 세제 농도의 세밀한 최적화, 정밀한 분석 설계 필요성 때문에 여전히 어렵습니다. 본 연구는 M207A TMEM120A 상세한 워크플로우를 제시하며, GsMTx4를 이용한 생물층 간섭계(BLI)를 이용한 정제 및 동역학적 분석을 모두 보여줍니다.

중요한 단계와 최적화:
중요한 단계 중 하나는 세제 농도였으며, 이는 단백질 안정성의 주요 결정 요인으로 확인되었습니다. 정제 과정은 0.5% LMNG를 포함한 버퍼로 세포를 용해시키고, 0.005% LMNG로 순차적으로 세척하며, 0.001% LMNG를 사용한 용출, 그리고 0.00015% LMNG를 함유한 버퍼에서 최종 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 거치는 과정을 포함했습니다. LMNG의 낮은 임계 미셀 농도(CMC)와 느린 오프 속도를 기반으로 한 이 세제 전략은 정제 시 미셀 내 단백질의 안정성을 향상시켰습니다. SEC 버퍼에는 LMNG의 CMC보다 10배 낮은 농도(0.001%)의 세제가 포함되어 있어, 하류 생물물리학적 분석에 미치는 영향을 효과적으로 최소화했습니다. 질량분석과 열안정성 분석을 통해 단백질 균질성과 응집의 부재가 확인되었습니다. 그림 2, 그림 3, 그림 4 는 CMC 이하 세제 농도에서 정제 및 단백질 안정화의 성공적인 최적화를 보여줍니다.

바이오센서의 단백질 고정은 50-80%의 프로브 포화 도로를 달성하도록 엄격히 조절되었습니다. 50-80%의 적재 수준은 어느 정도 대중 운송 제한을 초래할 수 있습니다; 이 범위는 프로브가 분석 중 웰 사이를 이동하는 BLI 시스템에서 적절한 신호 세기를 제공하기 위해 선택되었습니다. 이 수준의 리간드 고정 달성은 일관된 신호 품질을 유지하는 데 도움이 되었으나, 이러한 부하 수준에는 장점과 잠재적 한계가 모두 존재합니다. 기준 탐침을 포함하는 것은 BLI 실험에 매우 중요했습니다.

추가 대조 실험에서는 단일 펩타이드 농도(100 nM)로 네 가지 서로 다른 수준의 고정 TMEM120A을 시험했습니다. 이 자료들은 이제 개정된 원고(보충 도표 S1)에 포함되어 있습니다. 고정된 단백질의 양을 늘리면 더 높은 부하 신호가 발생했으나, 모든 경우에 기저선에서 1nm 이하로 이동이 유지되었습니다(보충 그림 S1A). 우리는 전역 1:1 결합 모델을 사용하여 적합 연관 및 해리 곡선을 보고했으며, 적합 데이터와 실험 데이터 간에 미세하고 유의하지 않은 차이를 보여주는 잔여 그래프도 포함하였다.

주요 동역학 분석(5-100 μM 분석물)에서는 적합된 속도 상수가 예상되는 농도 의존적 추세를 보였다. k오프 값은 약 1.48 × 10⁻⁴에서 1.43× 10⁻³ s⁻¹ 사이였고, k오프 값은 1.12 × 10²에서 1.26 × 10¹ M⁻¹ s⁻¹까지 다양했습니다. 농도 시리즈 전반에 걸친 이러한 점진적 변화는 정상적인 분석물 의존적 연관 및 해리 행동과 일치합니다.

대조 실험에서는 단일 분석 농도(100 nM)에서 서로 다른 프로브 부하 수준을 시험했으며, 네 가지 트레이스 모두 매우 유사한 운동 상수를 보였습니다. k오프 값은 모든 하중 수준에서 1.42 × 10⁻¹ s⁻¹이었고, kon 값은 10³ M⁻¹ × 2.76 일관되게 유지되었습니다. 이러한 변이의 부재는 결합 및 해리 단계가 프로브 밀도, 질량 수송 제한, 분석 물질 재결합에 의해 영향을 받지 않았음을 시사합니다.

또한 대조군 실험에서는 100 nM에서의 해리가 더 빠르게 나타나는 것으로 예상됩니다. 100 nM 분석 농도는 KD보다 약 10배 낮은 수준이며, KD 이하 농도에서는 복합체가 덜 안정되고 유효 점유율이 낮아집니다. 이러한 조건에서는 낮은 분석 농도에서 결합 친화력이 약해지고 해리 단계 중 재결합이 최소화되어 해리가 더 빠르게 진행됩니다. 이 행동은 분석물 농도가 KD보다 현저히 낮을 때 일반적으로 관찰되는 현상과 일치합니다.

종합적으로, 프로브 부하 전반에 걸친 동역학 매개변수의 일관성과 저분석 농도에서의 예상 거동은 관측된 속도 상수가 표면 하중이나 질량 수송 효과의 인위적 효과가 아닌 진정한 결합 특성을 반영한다는 점을 뒷받침합니다.

결합 운동학과 해석:
동역학적 분석은 개별 분석물 농도를 공유된 동역학적 틀 내에서 독립적으로 적합된 국소 완전적합 전략과 함께 1:1 랭뮤어 연관-해리 모델을 사용하여 수행되었습니다(그림 6B). 이 접근법은 전통적인 전역 적합 대신 선택된 이유는, 특히 낮은 리간드 농도에서 일부 데이터셋이 질량 수송 제한과 세제 미셀의 단백질 확산 효과로 인해 미세한 중복이나 초기 단계 편차가 발생했기 때문입니다. 전역 적합은 모든 흔적이 동일한 운동학적 거동을 엄격히 따른다고 가정하며, 표면 접근성이나 국소 미세환경이 농도별로 약간 달라질 경우 이 거동이 손상될 수 있습니다. 국소 완전 적합은 각 분석물 농도를 독립적으로 모델링하면서도 일관된 동역학적 프레임워크를 유지할 수 있게 해주었고, 도출된 매개변수가 각 농도의 거동을 정확히 반영하도록 보장했습니다. 적합된 곡선(빨간색)은 실험 흔적과 매우 일치하여 저소몰 범위에서 추정된 해리 상수(KD)를 산출했다. 잔류 분석(그림 6C)에서는 주요 체계적 편차가 발견되지 않아 이 모델이 세제로 용해된 막 단백질 상호작용에 적합함을 지지하였습니다.

TMEM120A M207A와 GsMTx4는 저미세몰 범위(∼0.8-3.3 μM)의 KD 값을 보였다. 연합률(kon)은 리간드 농도에 따라 소폭 증가한 반면, 해리 속도(koff)는 매우 느리게 유지되어 안정적인 복합체 형성을 나타냈다. 해리 초기 5-10초 동안 급격히 신호 감쇠가 일어났을 가능성이 높으며, 느린 상은 더 안정적인 상호작용을 나타냈다(그림 6A). 이러한 관찰은 세제에 용해된 막 단백질을 분석할 때 해리 창을 신중하게 선택하고 질량 전달 한계를 고려하는 것이 중요함을 강조합니다(표 2).

제한 사항 및 문제 해결:
세제로 용해된 막 단백질인 TMEM120A M207A에 대해서는 여러 제한점이 고려해야 합니다. 질량 전달 효과는 초기 결합 단계에서 발생할 수 있는데, 단백질이 천천히 바이오센서 표면으로 확산되어 운동학적 측정이 약간 왜곡될 수 있습니다. 프로브 포화도가 권장 50-80% 범위를 초과하면 센서 과부하가 발생할 수 있으며, 이는 전역 운동 분석의 정확도를 제한하고 kon 및 koff 값에 영향을 줄 수 있습니다. 세제 의존적 영향은 특히 CMC 이상의 또는 근처에서 단백질 안정성, 올리고머 상태 또는 표면 접근성에 영향을 미칠 수 있습니다. 추가 요인으로는 미세한 기준선 드리프트, 비특이적 결합, 매우 느린 해리의 동역학 포착 어려움이 있습니다.

이러한 문제들 중 많은 부분은 단백질 과포화를 방지하기 위해 단백질 부하를 줄이고, 버퍼 조성을 최적화하며, 기준선 드리프트나 비특이적 신호를 보정하기 위한 참조 프로브 포함 등 간단한 조정으로 완화할 수 있습니다. 본 연구에서는 0.00015% LMNG와 낮은 농도의 Tween-20을 포함한 SEC 버퍼가 단백질 안정성을 유지하면서 비특이적 결합을 효과적으로 최소화하였습니다. 운동 적합을 위한 해리 창을 신중하게 선택하고 복제 측정과 잔류 분석을 수행하는 것도 운동 매개변수의 신뢰성을 확인하는 데 중요했습니다. 이러한 전략들은 일반적으로 재현성을 높이고 보다 견고하고 해석 가능한 데이터를 생성하는 데 도움을 줍니다. 전역 적합 대신 국소 완전 적합이 사용되어 개별 리간드 농도에서 미세한 차이를 반영하여, 각 데이터셋의 동작을 정확히 반영하는 동역학적 매개변수를 보장했습니다.

BLI 및 기타 생물물리학적 기법:
표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 등온 적정 양량계(ITC)와 비교할 때, 생물층 간섭계(BLI)는 막 단백질-리간드 상호작용 분석에 여러 실용적인 이점을 제공합니다. SPR 및 ITC와 마찬가지로, BLI는 복잡한 마이크로유체 시스템이나 높은 단백질 농도 없이도 결합 상호작용에 대한 상세한 통찰을 제공할 수 있습니다. 여기에는 결합률(k온), 해리율(k오프), 평형 해리 상수(KD)가포함됩니다. 오픈 웰, 딥 앤 리드 형식은 빠른 버퍼 교환과 다중 샘플의 병렬 처리를 가능하게 하여 더 높은 실험 처리량을 지원합니다. ITC는 대량의 고순도 단백질을 필요로 하고 열역학적 데이터를 제공하지만, BLI는 나노몰 내 최소 샘플 농도에서 복합체 형성 속도와 해리 속도를 모두 측정할 수 있습니다. BLI는 세제 또는 지질 함유 완충제와도 호환되어, 다른 생물물리학적 방법으로 연구하기 어려운 저수율 또는 불안정한 막 단백질에 적합합니다. 이러한 장점에도 불구하고, SPR 또는 ITC와 같은 보완적 기법은 세제 없이 또는 세제 조건에서 열역학적 일관성 확인과 결합 매개변수 교차 검증에 여전히 유용하지만, 높은 단백질 농도가 필요합니다.

향후 방향:
이 워크플로우는 다른 막 단백질, 단백질-지질 상호작용, 또는 소분자 조절자 스크리닝 연구로 확장될 수 있습니다. BLI를 질량 광도계, 구조 특성화, 냉동 전자기(cryo-em)와 같은 직교적 접근법과 결합하면 올리고머화, 화학양론, 결합 메커니즘에 대한 더 상세한 통찰을 제공할 수 있습니다. 추가 최적화는 고친화성 리간드, 다가 상호작용, 또는 더 토착 지질 환경에서의 복합체 분석도 가능하게 할 수 있습니다.

결론적으로, 단백질 고정, 세제 농도, 완충 조건을 세밀하게 제어함으로써 BLI는 M207A 및 유사한 도전적인 막 단백질에 대해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 동역학 데이터를 생성할 수 TMEM120A 있습니다. 본질적인 한계가 존재하지만, 이 방법은 명확한 실험 조건 하에서 특이적이고 중간 친화도를 가진 단백질-리간드 상호작용을 연구할 수 있는 견고한 플랫폼을 제공합니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

멜버른 대학교의 연구 플랫폼인 멜버른 단백질 특성화(MPC) 시설에 단백질 정제 및 특성 분석에 대한 지원을 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 국립보건의학연구위원회(NHMRC)의 아이디어 보조금(2020/GNT2000934 I.R.에 지원)과 호주 연구 위원회(산업 전환 훈련 센터, IC200100052 I.R. 및 M.M.)의 지원을 받았습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008정제
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10ML정제
BioRenderBioRenderhttps://biorender.com그림 1 제작 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8질량 광도법
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019세포 배양
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNA정제
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001정제
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9정제
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524형질주입
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061세포 배양
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268세포 배양
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940정제
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001정제
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006열역학적 안정성
Prometheus PantaNano TemperNA열역학적 안정성
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNA정제
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44정제
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNA플라스미드
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNA질량 광도법
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참고문헌

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