우울증 및 파킨슨병 마우스 모델에서 복내측 전전두엽 피질의 각성 전기생리학적 프로파일링

요약

배측 상관핵(DR)에서 돌연변이 인간 알파-시누클레인(h-α-Syn)을 과발현하는 파킨슨병(PD) 유사 마우스 모델을 사용하여, PD의 우울/불안 장애에서 복측 전전두엽 피질(vmPFC)-DR 회로의 역할을 조사하는 전기생리학적 기록 방법을 개발했습니다.

초록

파킨슨병(PD)은 주로 운동 장애로 알려져 있지만, 운동 장애가 나타나기 전에 비운동 증상이 나타나며 질병 진행에 큰 영향을 미치며 모든 질병 단계에서 매우 중요합니다. 이 중 우울증과 불안이 가장 흔한 증상이며, 여성에게 남성보다 더 큰 증상 부담을 줍니다. 세로토닌(5-HT) 시스템의 변화는 종종 기분 장애와 연관되며, 파킨슨병(PD)과 우울증 환자의 5-HT 관핵(RN)에서 α-시누클레인(α-Syn)의 축적이 관찰되었습니다. 따라서 이러한 비운동 증상의 근본적인 신경 회로를 이해하는 것이 매우 중요합니다.

여기서는 암컷 마우스 모델을 이용한 돌연변이 인간 α-합성(h-α-Syn)을 과발현한 암컷 마우스 모델을 사용하여, PD 관련 기분 장애에서 복측내측 전전두엽 피질(vmPFC)-배측 광선핵(DR) 회로의 역할을 조사하는 개선된 프로토콜을 제시합니다. 우리 방법은 기저 조건과 혐오 조건화 및 소소 시에 하하 피질(IL) 및 변연기(PL) 피질의 신경 활동을 고해상도로 평가할 수 있게 합니다. 깨어 있는 머리를 고정한 마우스에서 톤-라이트 감각 조건 형성 패러다임을 사용하여, 다중 채널 전기생리학적 탐침을 사용해 신경 반응을 기록합니다. 실험은 가상현실 복도에서 실시되었으며, 원통형 러닝머신과 듀얼 스크린 시각 디스플레이를 결합하여 행동 참여를 유지하면서 감각 자극의 정밀한 제어와 안정성 기록을 보장했습니다.

이 프로토콜은 IL과 PL 피질이 공포 조건화 및 소멸에 관여한다는 확립된 기반을 바탕으로 하며, 파킨슨병에서 우울증 및 불안 유사 행동과 관련된 회로의 동적 신경 활동을 연구할 수 있는 견고한 틀을 제공합니다. 통제된 조건 하에서 동시에 행동 및 전기생리학적 측정을 가능하게 함으로써, 이 접근법은 파킨슨병에서 비운동 증상의 신경생물학적 기전을 밝히고 잠재적 개입을 검증하는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

파킨슨병(PD)은 운동 장애이지만, 비운동 증상이 운동 증상 이전에 나타나는 것으로 알려져 있으며, 모든 병기^{1, 2, 3, 4} 단계에서 중요하다. 이 중 우울증과 불안은 가장 흔한 신경정신과 증상으로, PD 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미치고 여성에게 남성보다 더 큰 증상 부담을 줍니다. 그럼에도 불구하고 이들은 종종 과소진단되고 부^{적절한 치료를 받습니다}. 이 모든 이유로, 환자를 계층화하고 보다 개인화된 치료를 제공하기 위해서는 PD의 신경생물학적 증상과 관련된 회로를 이해하는 것이 필수적입니다.

파킨슨병의 병인은 부분적으로 명확하지 않지만, 몇 가지 주요 신경병리학적 특징이 확인되었습니다. 이 질환은 흑색선조계에서 도파민성 뉴런과 섬유가 점진적으로 퇴행하고 손실되는 것이 특징이며, 이는 PD ^7,8과 관련된 전형적인 운동 결손을 초래합니다. PD의 또 다른 특징은 주로 단백질 α-시누클레인(α-Syn^)9,10으로 구성된 루이체(LB)와 루이 신경돌이(섬유 단백질 응집체에 의해 형성되는 세포 내 포함물)의 존재입니다. 신경영상 연구는 또한 DA 관여 이전에도 영향을 받는 다른 신경전달물질 시스템임을 밝혀냈는데, 그중 11,12,13은 세로토닌(5-HT) 시스템이다. 세로토닌성 시스템(5-HT) 시스템의 변화는 기분 장애와 흔히 연관되며, 파킨슨병(PD)과 우울증 진단을 받은 개인의 5-HT 관상핵(RN)에서 α-시누클레인(α-Syn) 침착이 검출^{되었습니다.}

배측 라페핵(DR)은 RN¹⁵에서 가장 큰 5-HT 핵으로, 감정 조절, 지각, 보상, 공격성, 사회적 상호작용에 중요한 역할을 합니다. 따라서 DR의 기능 장애는 스트레스, 불안, 우울증과 같은 신경정신과적 장애와 관련이 있습니다^15,16. 이 시점에서 DR과 전전두엽 피질(PFC) 사이의 강력하고 양방향적인 기능적·해부학적 연결을 강조하는 것이 중요합니다. PFC는 고차원 뇌 기능에 필수적인 뇌 영역입니다. PFC의 등 쪽 부위는 인지 기능과 관련이 있지만, 복측 부위(vmPFC)는 감정 조절, 행동 조절, 기억, 의사결정에 근본적인 역할을 합니다^17,18. 따라서 vmPFC와 DR은 함께 기분에 큰 영향을 미치며, 이 회로의 활동 변화는 우울 증상과 연관되어 있습니다¹⁸. 더욱이, RN 내 5-HT 뉴런에 집단된 형태의 α-Syn 형태가 축적되면 불안과 우울 유사 표현형을 유발하는 것으로 나타났습니다 19,20,21.

우울형 표현형을 가진 PD 암컷 마우스 모델을 이용하여, 돌연변이 A53T 형태의 인간 α-신(h-α-Syn)을 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 통해 과발현하는 우울증 표현형을 가진 PD 암컷 마우스 모델을 활용하여 전기생리학적 기록 방법을 개발하였습니다. 이 방법은 PD의 우울/불안 장애에서 vmPFC-DR 회로의 역할을 조사하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법은 각성 중인 쥐에서 단일유닛 및 국소 필드 전위(LFP) 기록을 통해 하엽(IL) 및 전변연기(PL) 피질의 신경 활동을 평가하는 것을 포함합니다. 이는 다중 채널 프로브와 가상현실 러너를 함께 사용하여 수행됩니다. 혐오 조건화에 PL과 IL 피질이 관여한다는 점을 인식하여, 이러한 패러다임 내에서 이들의 활동을 측정하여 스트레스 상황에서의 기능을 평가합니다. PL이 주로 조건부 반응을 유발하는 반면, IL 피질이 이러한 반응의 소멸에 핵심적인 역할을 한다는 점을 이해하는 것이 중요합니다^22,23.

다음 프로토콜은 헤드바를 이식하고 생체 내에서 PL과 IL 피질의 전기 활동을 예리하게 기록하는 단계를 설명합니다. 우리는 머리를 고정한 쥐를 위한 원통형 러닝머신과 더블 스크린 시각 디스플레이를 결합한 가상현실 복도를 통해 이를 달성합니다. 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다: (1) 헤드바 이식 수술, (2) 습관화, (3) 기록 및 신호 획득, (4) 데이터 분석: 스파이크 분류 및 데이터 전처리.

뇌 5-HT 시스템에서 h-α-Syn 과발현을 유도한 지 3주 후, 쥐는 머리 고정 수술을 받아 이후 머리 고정을 가능하게 합니다. 1주일간의 회복 기간 후, 쥐는 4일 동안 실험자와 러닝머신 및 머리 고정 시스템에 익숙해집니다. 기록일에는 이 장비를 사용하여 PL과 IL 피질의 신경 활동을 기초 조건과 혐오 조건화 중에 기록합니다. 원시 신경 데이터는 Kilosort4를 이용한 자동 스파이크 정렬을 거쳐 Phy2에서 수동 선별하여 고품질 단일 유닛 클러스터를 추출하여 추가 분석을 수행합니다(그림 1).

제안된 깨어 있는 머리 고정 다채널 vmPFC 녹화 프로토콜은 마취 또는 체외 준비, 자유롭게 움직이는 동물의 무선 기록과 같은 고전적 대안과 비교해 여러 가지 장점을 제공합니다. 마취 또는 체외 접근법과 달리, 이 방법은 가상현실 환경에서 통제된 시각 및 청각 자극 하에서 vmPFC 활동을 평가할 수 있게 하여, 혐오적 조건화 패러다임 구현에 필수적입니다^24,25. 자유롭게 움직이는 녹음과 달리, 머리 고정 구성은 감각 입력과 과제 우발에 대한 정밀한 실험 제어를 제공하여 변동성을 줄이고 일관된 시험 구조를 가능하게 합니다. 더 나아가, 머리 고정은 자유롭게 움직이는 패러다임에서 특히 혐오 자극 하에서 관찰되는 과제 이탈 위험을 줄이면서도 고음율 안정적인 다중 채널 녹화를 가능하게 합니다²⁶.

실용적인 관점에서 이 프로토콜은 동물들이 머리 고정과 러닝머신 달리기에 익숙해져야 하지만, 상업적으로 구할 수 있는 비교적 저렴한 원통형 러닝머신을 포함한 머리 고정 시스템의 이점을 누릴 수 있습니다. 이로 인해 프로브는 최대 ~10회 삽입까지 재사용할 수 있어 만성 자유 이동형 임플란트에 비해 비용을 크게 절감할 수 있어 소규모 실험실에서도 접근이 가능해졌습니다. 따라서 이 방법은 실험적 통제, 행동 관련성, 비용 효율성 간의 균형을 제공합니다. 또 다른 고려 요소는 혐오 조건화 패러다임의 구현입니다. 이 연구에서는 설치류가 빛을 자연스럽게 싫어하는 특성을 기반으로 한 실험 설계를 적용했습니다: 10개의 청각 신호(조건 자극)를 한 뒤 각각 강한 빛에 잠시 노출(조건 없는 자극)을 보였습니다. 이 패턴은 전기 충격과 같은 다른 고전적 조건화 방법보다 덜 스트레스를 주지만, 실제 세계에서는 더 유사한 스트레스 요인을 형성합니다.

프로토콜

모든 실험은 연령에 맞는 대조군과 함께 수행되었으며, 동물 시술은 3R 규칙에 따라 설계되었다; EU 지침 2010/63(2010년 9월 22일), 스페인 법률(RD 1201/2005, L.32/2007, L.6/2013)에 명시된 윤리 지침에 따라 수행되었으며, 발렌시아 자치정부(Generalitat Valenciana, ES462500001003; ref. 2023-VSC-PA-0073)와 발렌시아 대학교 지역 생명윤리위원회(참조 A20230214153605)의 승인을 받았습니다.

참고: 안전을 보장하고 오염을 방지하기 위해 전체 절차 동안 일회용 장갑과 부티, 실험복, 마스크, 헤어넷 등 개인 보호 장비를 착용하세요. 지역 규정과 해당 국가 회수 프로그램에 따라 사용으로 인한 잔류물 처리를 위해 수의용 약품 회수 시스템을 사용하세요.

1. 마우스 모델 생성

참고: 성체 암컷 C57BL/6J 쥐(9주)는 통제된 환경 조건(22± 1°C; 12시간 빛/어둠 주기) 하에 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 방치되었습니다.

1. 마우스 마취실에서 이소플루란 마취(유도 4%, 유지 2%)를 하, 마우스를 무작위로 입체형 미세주사(브레그마 좌표: 전후측 [AP] −4.5 mm, 중측 [ML] −1.0 mm, 등복측 [DV] −3.2 mm; 주입각: 20°)를 자동 마이크로인젝터로 무작위로 할당하여 0.4 μL/min의 유량으로 투여합니다. 앞서 언급한^{19, 27, 28}.
2. 각 마우스가 인간 h-α-Syn의 5-HT 뉴런(n = 4) 과발현을 유도하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 1/2(AAV1/2; 농도: 5.16 ×^{10 12} gp/mL)를 총 0.6 μL로 투여하여 DR의 5-HT 뉴런(n = 4) 과발현을 유도하거나, 비암호화 스터퍼 DNA를 포함하는 빈 AAV1/2 벡터(AAV-EV)를 투여해야 합니다. 대조군으로 사용됨(n=5).
3. 역류를 막기 위해 바늘을 추가로 8분간 제자리에 둔 후 320-400 μm/분 속도로 천천히 빼세요.
   참고: 안전을 위해 입체 수술 전에 마취 증기를 포집할 수 있도록 스캐빈징 시스템이 제대로 작동하는지 확인하세요(1, 2절). 증기 충전 중 이소플루란이 유출될 경우, 톱밥과 같은 불활성 흡수 물질로 즉시 청소하세요. 지역 규정에 따라 이소플루란 필터와 사용으로 인한 잔류물을 폐기할 때 수의용 의약품 회수 시스템을 사용하세요.

2. 헤드바 이식 수술

참고: 마우스 모델 생성 후 3주 후에 아래 단계에 따라 헤드바 이식 수술을 수행하십시오.

1. 수술 전 준비 및 마취
   1. 아이소플루란 증기 기화기를 통해 투여하는 이소플루란(유도 시 4%, 유지 시 1.5-2%)으로 동물을 마취합니다.
   2. 입체형 장치에서 온열 패드 위에 마우스를 위치시켜 시술 내내 체온을 유지하세요.
   3. 마우스의 입을 부드럽게 벌려 이빨을 교합봉에 대고, 입체흡입기구에 연결된 마스크를 부착하여 마취 유지를 위한 지속적인 이소플루란 투여를 보장합니다.
   4. 안구 궤양을 예방하기 위해 점안액을 사용하세요.
   5. 메스 절개 최소 10분 전에는 부토르판올(5 mg/kg, 식염수 용액)을 피하 주사하여 진통을 투여하십시오.
   6. 귀 봉에서 오는 불편함을 줄이기 위해 지역 리도카인(양쪽 귀에 0.03 mL, 4 mg/kg, 최대 용량 7 mg/kg 또는 리도카인/프릴로카인 크림 [리도카인 25 mg/g 리도카인과 25 mg/g 프릴로카인 크림]을 초과하지 마십시오).
2. 입체 위치 및 두개골 준비
   1. 귀 봉을 머리를 단단히 고정하도록 위치시켜 대칭과 최소한의 움직임을 확보하세요.
   2. 앞니 바를 조정해 브레그마와 람다가 같은 수평 높이로 맞추고, 두 부분이 중앙선에 있는지 확인하세요.
   3. 발 철수 상실, 백 반사, 호흡 감소, 수염 움직임 부재 등을 확인하여 마취 유도를 확인합니다.
   4. 마우스가 입체 택시 프레임에 올바르게 위치하고 이어바를 신중하게 조정하세요.
   5. 수술 부위를 면도하고 소독 용액(포비돈-요오딘 뒤에 70% 에탄올)을 사용해 감염 위험을 최소화하세요.
   6. 두피 중앙에 절개를 하고 밑 조직을 부드럽게 젖혀 두개골을 노출시키면서 지혈을 유지하세요. 피부가 충분히 열려 두정측두엽 능선이 시각적으로 보이도록 하세요. 이를 위해 피부 아래 근막에 네 개의 가느다란 불독 클램프를 놓아 노출을 극대화하세요.
   7. 노출된 두개골을 깨끗이 청소하고 철저히 말려 해부학적 특징(bregma와 lambda)을 명확히 볼 수 있도록 하세요.
   8. 브레그마와 람다를 같은 수평면에 정렬하여 두개골을 전후축에서 평평하게 만듭니다.
   9. 두개골을 양측두엽 능선의 깊이를 맞추어 중앙외측축에서 평평하게 만듭니다.
3. 드릴 및 임플란트 삽입
   1. 좌표 AP: +1.75에서 vmPFC 위에 직경 1mm 구멍을 드릴링하세요; ML: −0.4; DV: +3.1 (그림 2). 녹화 당일에 실리콘 프로브 삽입을 안내하기 위해 입체 조정 암을 사용해 잉크로 네 개의 꼭짓점을 표시하세요. 또한, 앞서 설명한 지점들을 메스로 연결하고 잉크를 듬뿍 발라서 절개 부위에 침투하여 자국이 안정적으로 유지되도록 하여 십자가를 그리세요. 70% 알코올에 적신 면봉으로 잉크를 제거하세요.
   2. 소뇌 위 두개골 뒤쪽에 두 개의 추가 구멍을 뚫으세요. 각 구멍에 각각 한 개의 선을 수동으로 삽입하여 향후 참고용과 접지용으로 사용하세요(그림 2).
      1. 또는 스테인리스 스틸 나사(A2 스테인리스 스틸, M1 × 2 사이즈, 또는 18-8 스테인리스 스틸, 직경 0.061" × 길이 3/16" 또는 스테인리스 스틸 수컷 점퍼를 사용할 수 있습니다. 어떤 선택을 하든, 전기 접촉을 제공하는 요소가 조직 손상을 방지하거나 동물 복지를 저해하거나 기록 품질에 부정적인 영향을 주지 않도록 압력을 가하지 않고 뇌 표면과 직접 접촉하도록 해야 합니다.
   3. 노출된 두개골에 얕은 홈을 만들어 표면적을 늘려 임플란트 접착을 개선하세요.
   4. 중간 치과 접착 수지를 세척 후 건조된 두개골에 두 겹으로 순차적으로 발라줍니다: 먼저 기본 촉매 혼합물을 사용해 완전히 건조시키고, 그 다음에는 분말 함유 혼합물로 전체 표면과 두개골 가장자리를 덮습니다. 진행하기 전에 두개골과 미래 임플란트 시멘트 사이의 접착 결합이 완전히 굳어졌는지 핀셋으로 확인하세요.
   5. PFC 기록 구멍과 기준/접지 구멍 사이에 스테인리스 헤드바를 놓으세요(그림 2). 헤드바를 입체 탐사 암과 정렬하여 두개골과 완전히 수평이 되도록 하여 고정 시절과 이후 실리콘 프로브 삽입 시 정확한 입체 좌표를 유지합니다.
   6. 모든 금속 부품은 치과용 시멘트로 두개골에 접착하며, 시멘트가 기록 구멍으로 들어가지 않도록 주의하세요.
   7. 두개골 절개부는 이성분 수술용 실리콘으로 덮으세요.
      참고: 모든 단계를 신중히 따르면, 착상 및 이후 헤드바의 기능 수행이 합병증 없이 진행될 것으로 예상되며, 성공률은 95% 이상으로 추정됩니다.
4. 수술 후 관리
   1. 뇌 수술 후 쥐의 회복 상태를 주의 깊게 관찰하여 동물이 의식을 회복하고 체온을 유지하며 통증 완화를 경험하는지 확인하세요.
   2. 쥐는 개별적으로 우리에 가두고 완전히 회복할 때까지 관찰하세요.
   3. 수술 후 3일간 12시간마다 피하 부토르판올(5 mg/kg 식염수)을 투여합니다.
      참고: (중요) 수술 과정 내내 활력 징후(심박수 및 호흡수, 산소포화도, 혈압)를 지속적으로 모니터링하세요. 각막 건조나 손상을 예방하기 위해 필요에 따라 점안액을 사용하세요.

3. 습관

참고: 쥐가 수술 전 체중을 회복하면(수술 후 약 5일에서 7일), 4일간의 적응 프로토콜을 시작하여 동물들이 실험 환경에 점차 적응하도록 하세요.

1. 1일차: 두 번의 10분 만질 세션을 수행하고, 세션 사이에는 1시간 휴식 시간을 두어 쥐들이 실험자에 익숙해질 수 있도록 합니다. 쥐가 팔뚝에 있을 때 부드럽게 만져서 실험자에게 익숙해지도록 하세요.
2. 2일차: 5분씩 핸들링 세션 두 번 수행. 각 세션 후에는 쥐를 머리 막대에 10초 간격으로 부드럽게 잡아 총 5분간 유지합니다.
3. 3일차: 짧은 다루기 세션 후, 쥐들이 러닝머신에서 7분간 자유롭게 달리도록 합니다. 그 후 머리를 고정하고 쥐를 머리 고정 상태로 5분간 유지하세요.
4. 4일차: 15분간 머리를 고정한 러닝머신 러닝 세션을 진행합니다.
   참고: (중요) 동물복지 지침에 따라 과도한 체중 감량, 이발, 탐색 행동 감소 또는 운동성 저하를 보이는 동물은 연구에서 제외되어야 합니다. 임플란트는 완전히 안정적으로 유지되어야 합니다. 변위는 기록 중 다채널 프로브를 손상시키거나 불안정하고 잡음이 많은 신호를 초래할 수 있으므로 동물을 연구에서 제외해야 합니다.

4. 프로브 준비

참고: 프로브를 어댑터에 연결하려면 다음 단계를 따르세요(그림 3A):

1. 프로브 어댑터/커넥터를 입체 방향성 암 어댑터에 연결하세요.
2. 헤드스테이지 어댑터 2개(각 Om32)를 프로브 어댑터(그림 3A)와 결합하여 방향이 일치하도록 하고 과도한 힘을 피합니다.
3. 프로브를 어댑터에 연결하세요(그림 3B). IL과 PL 영역에서 64가지 서로 다른 깊이에서 동시에 기록을 가능하게 하려면, 1 shank, 64채널 실리콘 프로브(Shank Length: 8 mm; 샤크 두께: 15 μm) (그림 4A).
4. 프로브의 위치 확인을 용이하게 하기 위해, 조직학적으로 호환되는 형광 염료나 강자성 입자를 코팅하여 기록 부위의 사후 검증을 가능하게 합니다.
5. 다음 방법 중 하나로 염료를 도포하세요:
   1. 샹크 전체를 용액에 담가세요.
   2. 마이크로피펫에서 용액을 소량 떨어뜨려 프로브에 떨어뜨리고 생크 전체에 펴 바릅니다.
   3. 용액에 적신 가는 붓으로 프로브 뒷면을 칠하세요.
   4. 4.5.2 및 4.5.3 단계에서는 샹크의 적절한 코팅을 위해 최소 세 번의 스트로크를 적용하세요.
      참고: 4.1부터 4.3까지는 프로브를 처음 사용할 때만 필요하며, 여러 녹음 세션에 걸쳐 재사용할 수 있습니다. 녹음 후에는 프로브를 어댑터와 어댑터에 연결한 채 직렬 주변기기(SPI) 케이블을 분리하세요.

5. 녹음 및 신호 획득

1. 질 도말에서 세포 유형학을 기반으로 한 비침습적 프로토콜을 사용하여 발정 주기를 모니터링하여 여성이 디스트러스기에 있는지 확인하세요^29,30.
2. 입체 프레임이 통합된 원통형 러닝머신에 동물을 머리를 고정시키는 자세로 고정합니다(그림 4B). 러닝머신과 프레임이 적절히 정렬되어 있어 피험자 간 안정성과 비교 가능성을 확보하세요.
3. 신호를 기록하고 획득하려면 5.3.1-5.3.15 단계를 따라 하세요.
   1. 확대 렌즈를 사용해 임플란트가 완전히 움직이지 않도록 하세요.
   2. 프로브 어셈블리(프로브, 어댑터, 헤드스테이지 어댑터로 구성)를 스테레오택식 프레임의 어댑터 암에 장착하세요.
   3. 이전에 획득 보드에 연결된 SPI 케이블을 헤드스테이지에 연결하세요(그림 3B). 각 헤드스테이지에 연결된 SPI 케이블을 기록하세요. 이 대응은 이후 자동 스파이크 분류 시 전극 배치를 유지하는 데 필수적입니다.
   4. 프로브 어댑터에서 기록된 반구의 수성 브리지에 접지선을 연결하고, 기준선을 반대쪽에 연결하세요. 뇌에 박힌 전선에 소량의 납땜 주인을 바른 후, 잠시 열을 가해 연결을 고정하세요. 기저 조직이나 어댑터 전자장치에 손상을 주지 않도록 과도한 열을 피하세요.
   5. 확대 렌즈를 위치시켜 PL과 IL 피질에 탐침 삽입을 위해 생긴 구멍을 시각화하세요. 잉크 랜드마크가 항상 명확하게 보이도록 하여 시술 중 정확한 입체 배치를 유지하세요.
   6. 입체 유도 암과 미리 표시된 랜드마크를 이용해 프로브를 vmPFC 구멍의 중심으로 유도합니다.
   7. 탐침을 조심스럽게 두개골 절개술 중앙에 위치시키고 뇌 표면을 부드럽게 만집니다. 노출된 조직에 따뜻한 식염수를 발라서 건조를 막으세요.
   8. 조직 염증을 최소화하기 위해 50 μm/분 속도로 프로브를 4-5분 동안 낮추기 시작하세요. 초기 삽입 시 프로브 샹크가 휘지 않도록 주의하세요.
   9. 녹음 부위의 임피던스를 측정하고 제조사에서 제공하는 값과 비교하세요. 이 초기 평가는 삽입 과정에서 뇌에 접근하는 첫 채널이 손상되거나 막히지 않았음을 보장합니다.
      참고: (중요) 전극 임피던스는 제조사의 기준값과 비교해야 합니다. 최대 ~30%의 편차도 일반적으로 허용되며 녹음 품질에 영향을 주지 않습니다. 30%에서 100% 사이의 증가도 여전히 사용할 수 있으나, 주의와 면밀한 모니터링이 필요합니다. 100%를 초과하는 변화는 종종 손상이나 막힘을 나타내며, 영향을 받은 부위는 신뢰할 수 없는 것으로 간주해야 합니다. 이런 경우에는 앞서 설명한 것처럼 임피던스를 줄이기 위해 프로브를 청소해야 합니다. 임피던스가 허용 범위로 회복되지 않으면 프로브를 폐기해야 합니다. 그러나 궁극적으로 탐침을 버리기 전에 얼마나 많은 신뢰할 수 없는 채널을 허용할 수 있는지는 실험자의 판단에 달려 있습니다; 일반적으로 적용되는 표준은 채널의 최대 10%를 넘지 않아야 한다는 것입니다.
   10. 뇌로 들어오는 채널에서 실시간 신호를 모니터링하면서 탐침을 50 μm/분 속도로 계속 내립니다. 이 신호들이 이전에 평가된 채널과 유사한지 확인하여 올바른 삽입을 확인하세요.
   11. 탐침을 +3.1 mm DV 깊이까지 전진시키고, 내리는 동안 따뜻한 식염수를 발라하여 두개골 절개술을 수분 상태로 유지합니다.
   12. 확대 렌즈를 제거하고 방 안의 다른 전기 소음 원인을 제거하세요.
   13. 프로브 내림 중에 녹음 부위가 막히지 않았는지 확인하기 위해 임피던스를 재측정하세요.
   14. 기준으로 4-5개의 연속 채널에서 신호를 모니터링하고, 프로브 신호 안정화를 90-120분 정도 기다립니다. 이 안정화 기간 이후에는 신호 드리프트가 최소화되어 이후 자동 스파이크 분류가 단일 단위 클러스터를 신뢰성 있게 분리할 수 있도록 해야 합니다.
   15. 데이터 수집을 시작하기 전에 임피던스를 재측정하여 적절한 기록 현장 상태를 확인하고 기준선 임피던스 측정을 확립합니다. 조직이 건조해지지 않도록 따뜻한 식염수를 정기적으로 바르세요. 녹화 파일을 이진 파일(예: .dat 또는 .bin)로 저장하여 데이터 전처리를 용이하게 합니다.
4. 안정되면 5.4.1-5.4.6 단계를 따르세요.
   1. 30분간 기초 신경 활동을 기록합니다 (그림 4C).
   2. 기준선 기록 30분 후에 아두이노를 사용해 혐오 조건화 프로토콜을 시작하세요. 이 음은 10개의 청각 음(10 s/톤)으로 구성되며, 1분당 10분 동안 전달됩니다. 각 음 뒤에는 가상현실 미로 화면을 통해 10초간의 빛 자극이 즉시 나타납니다(그림 4C).
   3. 조건화 자극 없이 10분 동안 신경 활동을 기록하세요.
   4. 소거 프로토콜 동안 10개의 청각 톤이 제공되지만 이후의 빛 자극 없이 플래 및 인리노 피질 활동을 기록하세요.
   5. 자극이 전혀 없는 상태에서 10분 동안 신경 활동을 기록하세요.
   6. 녹화 중지.
5. 녹화 후 절차: 녹음 세션을 마친 후 5.5.1단계를 따라갑니다.
   1. 탐침 제거: 따뜻한 식염수를 투여하고 100-150 μm 속도로 탐침을 조심스럽게 빼내면서 전극 신호를 지속적으로 모니터링하여 탐침의 기계적 손상과 조직 신장 방지를 통해 이후 조직학적 재구성을 방해할 수 있습니다.
   2. 프로브가 뇌에서 제거되면, 부착된 조직이 마르지 않도록 즉시 샹크를 증류수에 10분간 담가세요.
   3. 동물에게 펜토바르비탈 나트륨(100mg/kg)으로 마취하세요. 그 후 화학 훈기 후드 내에서 80mL의 식염수(0.9%)를 경관류하고, 이어서 80mL의 파라포름알데히드(4%)를 PB(0.1 M, pH 7.6)에 희석하여 관류합니다.
      1. 파라포름알데히드, 접촉 및 흡입을 피하려면 눈/얼굴 보호 장비, 화학물질 보호 장갑, 방진 마스크를 사용하세요. 관류가 끝나면 남은 파라포름알데히드를 비할로겐화 용매용 용기에 담아둡니다.
      2. 유출 시 먼지 분산을 막기 위해 재료를 적셔 밀봉 용기에 보관하세요. 오염된 지역과 작업장은 표백제로 깨끗이 청소하여 파라포름알데히드를 중화하세요.
   4. 뇌를 제거한 후 4°C에서 하룻밤 고정한 후, 30% 자당에 PB(0.1 M, pH 7.6)에 4°C에서 냉동 보호를 위해 보관합니다. 냉동 미세절기를 사용해 30 μm 코로나 절편을 얻고, 그 조각을 젤라틴화된 유리 슬라이드에 장착합니다.
      참고: 이 절편들은 면역조직화학(^{이전의 19, 20, 21})과 프로브 위치를 통해 DR α-Syn 과발현을 확인하는 데 사용됩니다.
   5. 프로브 세척: 탐침의 이식 가능한 부위를 1% 효소 세제 용액에 증류수에 1시간 동안 담가둡니다.
   6. 프로브 샹크를 증류수에 10분 더 담가서 세제 잔여물을 제거하세요.
   7. 20-30분 동안 똑바로 서 있는 상태로 말립니다. 건조 후에는 현미경으로 프로브를 점검하여 기록 부위에 조직이나 이물질이 남아 있지 않은지 확인하세요. 프로브가 완전히 깨끗하면, 고급 이소프로필 알코올에 1분간 담근 후 원래 정전기 방지 상자에 보관하세요.

6. 데이터 분석: 스파이크 정렬 및 데이터 전처리

참고: 세포외 신경 기록을 분석하고 개별 스파이크를 특정 뉴런에 귀속시키려면 Kilosort4³¹ 스파이크 분류 알고리즘을 사용하세요.

1. Kilosort4³¹을 사용해 자동 스파이크 정렬을 수행하세요. Kilosort4 GUI에서 바이너리 기록 파일을 선택하고 제조사의 구성 시트에 따라 프로브 레이아웃을 지정합니다. 기본 매개변수를 사용하여 스파이크 정렬을 실행하는데, 이는 IL과 PL 피질에 기록된 파형을 추가 조정 없이 포착하는 데 이상적입니다.
2. Phy2(kwikteam/phy)를 사용해 Kilosort 출력물을 검사해 추가 수동 관리가 필요합니다. 커뮤니티에서 개발한 플러그인(petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin)을 도입하여 Phy2에 추가 기능을 추가하고 큐레이션 데이터의 품질을 향상시키세요.
3. 노이즈로 라벨링하고, 주파수 <0.05Hz이거나 스파이크 수가 500개 미만인 클러스터는 버리세요.
4. 또한, 다음 클러스터들을 노이즈로 표시하세요:
   1. 삼각형 모양의 자동상관도를 나타내는 것들은 잡음으로 표시하세요.
   2. 스파이크와 닮지 않은 파형 모양을 가진 것은 노이즈로 표시하세요.
   3. 단일 녹음 채널이나 진폭이 다른 모든 채널에서 감지된 것을 노이즈로 표시하세요.
   4. 자동상관문자에서 강한 주기성을 보이는 경우는 노이즈로 표시하세요.
5. 생리학적으로 적합한 파형, 자기상관도에서 불응성 골짜기 증거, 그럴듯한 진폭 변화, 명확히 분리된 주성분을 가진 클러스터만 선택하세요.
6. 각 클러스터를 수동으로 청소하여 마할라노비스 거리 기반 이상치 제거를 적용하세요.
7. 수동 청소의 타당성을 판단하는 주요 지표로서 파형 형태와 진폭 변화를 계속 검토하세요.
   참고: 스파이크 정렬이 완료되면 vmPFC의 신경 활동 패턴을 Python에 구현된 루틴을 사용해 분석할 수 있습니다.

결과

상세한 실험 프로토콜을 활용한 PL 및 IL 피질 활동의 최근 기록은 중요한 발견을 보여줍니다: DR에서 h-α-Syn 과발현이 암컷 쥐에서 불안과 유사한 표현형을 유도하며, 복측 vmPFC 활동도 변화시킵니다. Python 기반 분석을 통해 DR 핵의 5-HT 뉴런에서 α-Syn 과발현이 vmPFC-DR 회로의 발화 역학과 기능 조직을 변화시켜 신경 하위 유형 간 전기생리학적 구분을 감소시킨다는 것을 입증했습니다. 대조군 동물에서는 신경 하위 유형이 전기생리학적 특성에 따라 명확히 구분되어 SST+, 피라미드형, PV+ 뉴런을 정확히 분류할 수 있었습니다. 반면, A53T α-Syn 과발현은 분리 가능성이 현저히 상실되어 특징 공간이 겹치고 신경 집단 간 광범위한 오분류가 발생했습니다(그림 5). 이러한 교란은 발화율 분포의 붕괴를 반영하며, α-신 병리학이 정상 조건에서 회로 수준의 조직을 유지하는 독특한 전기생리학적 정체성을 손상시킨다는 것을 시사한다.

토론

이 프로토콜은 가상현실 통로 시스템을 활용하여 깨어 있는 머리 고정 마우스의 PL 및 IL 피질을 생체 내 전기생리학적 평가에 대한 견고한 방법론을 제시합니다. 이 방법의 중요성은 PD 모델 내에서 깨어 있는 상태에서 vmPFC-DR 회로를 직접 조사할 수 있다는 점에 있습니다. 머리 고정이 동물의 움직임을 제한하고 스트레스를 줄 수 있지만, 정밀한 자극 제어와 안정성 기록, 지각 및 인지 과정 연구에 적합하지만 자연스러운 행동을 반영하지 않을 수 있다^24,25. 이 접근법은 특히 혐오적 조건화 중 스트레스 관련 상황을 모델링하는 생리학적으로 더 관련 있는 상태에서 신경 활동을 연구할 수 있게 해주어 체외 또는 마취 제제에 비해 상당한 이점을 제공합니다^32,33

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AAV1/2-CMV/CBA-인간 A53T aSyn-WPRE-BGH-polyA	찰스 강	GD1001-RV	인간 A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Empty-WPRE-BGH-polyA	찰스 강	GD1004-RV	빈 벡터 제어
ADPT A64-Om32x2	케임브리지 뉴로테크	옴네틱스 2228	어댑터
이성분 외과용 실리콘	월드 프리시전 인스트루먼트	퀵-실
부토르파놀과 nbsp;	토르부게식 베테랑 / 시미트 퀴아커트; 마이카	67753-31-5
듀라레이	릴라이언스 덴탈 매뉴팩처링 / 칼마	43640	덴탈 시멘트
H9 다채널 프로브	케임브리지 뉴로테크	ASSY-77 H9
EMLA 크림(리도카인 / 프리콜레인)과 nbsp;	리리오스 반틸데; 그리고 고성; 셈페레 약국	679290
마이크로인젝터	월드 프리시전 인스트루먼트	KDS-310-플러스
MSS 이소플루란 베이퍼라이저	의료용품 및 서비스, 영국	MSSVAP02
오픈 Ephys 인수 위원회	오픈 에피스	OEPS-9029	획득 위원회; Open Ephys 획득 위원회는 USB를 통해 최대 512채널의 신경 데이터를 컴퓨터로 스트리밍할 수 있습니다
C& B 메타본드	파켈	S380-RD	빠른 접착 시멘트
펜토바르비탈	돌리탈 베토퀼 / 머크 생명과학, S.L.U.	P-010-1ML	바비튜레이트
RHD 32채널   헤드스테이지	인탄 테크놀로지스	#C3314	헤드스테이지 어댑터
시카플루이드	테아 S.A. 연구소 / 리리오스 밴틸데; 그리고 고성; 셈페레 약국	6515167	안과 젤
입체형 장치;	스톨팅	51730U
입체 프레임	나리시게	SR-6N/SM-15R
테르가자임	시그마 올드리치	Z273287	프로브 클리닝 용액