방법 논문

GMP 확장 가능한 장치에서 CAR-T 및 사이토카인 유도 킬러 세포의 효율적이고 빠른 생성

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DOI:

10.3791/69369

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2025년 12월 5일

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1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 기체 투과성 급속 증식(G-Rex) 장치를 사용하여 채택 세포 치료(ACT) 제품인 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포와 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포의 확장 가능성을 설명하며, 임상적으로 중요한 환경에서 효율적이고 견고한 성장을 입증합니다.

초록

채택 세포 치료(ACT)는 최근 몇 년간 빠르게 발전하여 암 면역치료에서 중요한 역할을 하며 치료 결과에 큰 영향을 미치고 있습니다. 세포 치료 개발에서 전임상 및 임상 단계 모두에서 중요한 단계는 제조 공정입니다. 기존의 정적 배양 방법은 빈번한 세포 조작이 필요하며, 가스 교환과 영양분 공급이 감소하여 세포 수확량과 표현형에 영향을 줄 수 있습니다. 여기서는 가스 투과성 급속 증식(G-Rex) 장치를 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)-T와 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포라는 두 가지 ACT 산물의 체외 증식을 위한 단계별로 재현 가능하며 확장 가능한 프로토콜을 제시합니다. G-렉스 장치는 영양 교환을 촉진하고 최소한의 사용자 개입으로 고밀도 배양을 지원하도록 특별히 설계되었습니다. 다양한 ACT 접근법 중에서 CAR-T 세포는 혈액학적 악성 종양 치료에 놀라운 성공을 거두어 실험 연구에서 임상 응용으로 빠르게 발전하는 데 기여했습니다. CAR-T 세포 외에도, CIK 세포는 특징적인 표현형과 치료 관련 부작용 및 이식편-대숙주 질환(GvHD)이 없기 때문에 임상시험에서 널리 적용되고 있습니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 단핵세포(PBMC)의 분리와 씨앗 투여부터 시작하여 두 세포 유형의 주요 기술적 단계를 개략적으로 설명합니다. 간단히 말해, PBMC는 항-CD3/CD28 항체로 자극된 후 렌티바이러스 전도로 CAR-T 세포를 확장하거나, 인터페론-γ(IFN-γ), 항-CD3 항체, 인터루킨 2(IL-2)로 자극하여 CIK 세포를 얻습니다. 유동 세포분석은 세포의 생존 가능성과 표현형을 모니터링하기 위해 사용되며, 기능적 분석은 세포 산물의 치료 잠재력을 확인하고 접근법의 확장성을 검증합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 전임상 환경에서 다수의 효과 세포를 생산하는 실용적인 해결책을 제공하며, 여러 면역 세포 집단에 대한 임상 적용을 용이하게 합니다. 마지막으로, 고수율 효과기 셀 제조를 위한 확장 가능한 솔루션을 제공합니다.

서론

채택 세포 치료(ACT)는 암 치료를 위한 첨단 치료의 중요한 기둥이 되었습니다. 이 접근법은 항종양 효능을 달성하기 위해 체외 확장 세포 제품을 투여하는 데 기반합니다. 현재까지 ACT에서는 항원 비특이적 접근법(예: 자연 살인자(NK)2, 사이토카인 유도 살인자(CIK)3,4, 자연 살인 T(NKT)5, γδ T 세포6부터, 종양 침윤 림프구(TILs)7 및 키메라 항원 수용체(CAR)1과 같은 조작된 세포 기반 치료제에 이르기까지 다양한 세포 유형이 사용되었습니다. 8 및 T 세포 수용체(TCR) 세포 9,10.

CAR-T 세포는 특정 분자 표적을 인식하도록 설계된 합성 면역 수용체를 발현하기 위해 외부 바이러스 전 도로 생성된 유전자 변형 T 세포입니다. CAR 구조는 항원 특이적 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체와 TCRζ 사슬 및 공공자극 분자를 포함한 세포 내 신호 도메인으로 구성됩니다. 항원 접동 시 세포 내 도메인은 T 세포 증식과 항종양 활성을 촉진하는 활성화 신호를 전달합니다11.

CIK 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC)나 탯줄혈(UCB)으로부터 체외 확장(exvi expansion) 중 CD56을 발현하는 활성화된 T 림프구 집단입니다12. 이 확장은 인터페론-γ(IFN-γ), 항-CD3 단클론 항체, 인터루킨-2(IL-2)로 자극한 후 14일간 IL-2 배양을 포함합니다. CIK 세포는 기능적으로 NK와 T 세포와 유사하며, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 독립적 기전과 의존적 기전 13,14,15,16을 통해 항종양 활성을 발휘합니다. 이러한 특성은 CIK 세포가 동종 및 자가 치료 환경에서 이식편 대 숙주 질환(GvHD) 위험이 최소화된 상태로 사용될 수 있게 합니다17.

임상 실무에서는 CAR-T 및 CIK 세포 치료법 모두 다수의 세포 투여가 필요합니다. CAR-T 세포는 환자18명당 5천만에서 2억 회분의 주입을 받습니다. 마찬가지로, CIK 세포는 보통 한 번에 최대 100억 개의 세포 용량으로 투여되며, 환자들은 치료 프로토콜에 따라 여러 차례 주입을 받는 경우가 많습니다19. 플라스크나 플레이트를 이용한 전통적인 세포 배양 방법은 비효율적이고 시간이 많이 소요되며 자주 전달이 필요해 대규모 증식이 불가능하고 오염 위험이 증가합니다. 백 배양이나 바이오리액터를 이용한 자동화 또는 반자동화 시스템은 대규모 확장이 가능하지만, 전단 응력, 밀도 조절, 빈번한 매체 관류 필요성, 그리고 한 번에 한 배치씩 취급해야 하는 제한이 있어 학계 및 산업 현장 모두에서 높은 비용이 발생합니다. 이러한 어려운 상황에서 대안으로는 가스 투과성 급속 팽창(G-Rex) 장치가 있는데, 이는 유정 바닥에 실리콘 막을 사용하는 정적 배양법으로, 효율적인 산소 교환과 용기 높이 증가를 보장하여 대용량 중용량을 가능하게 합니다. 따라서 이 시스템은 배지 대체나 밀도 조절 없이도 세포 성장을 지원합니다22,23. G-Rex-M 시스템은 최대 5000 mL까지 확장성을 입증했으며, 자동 수확 시스템과 호환되어 학술 환경에서 임상 환경에서 쉽게 전환할 수 있는 오염 없는 폐쇄형 배양 플랫폼을 제공하여 첨단 치료용 의약품(ATMP) 개발에 기여할 수 있습니다24.

이 절차에서 우리는 G-Rex 장치의 장점과 특성을 활용하여 CAR-T 세포와 CIK 세포의 확장 프로토콜을 최적화했습니다. 우리는 두 세포 유형 모두 효율적으로 증식되고 확장될 수 있으며, 서로 다른 배양 시스템에서 일관된 표현형과 기능 프로필을 유지할 수 있음을 입증했습니다. CIK와 CAR-T 셀 모두에 대한 확장 프로토콜의 개략 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1
그림 1: G-24 또는 G-6M 배양 장치를 이용한 CAR-T 및 CIK 세포 확장 프로토콜 개요. CAR-T 및 CIK 세포는 0일째부터 분리된 PBMC에서 증식됩니다. CAR-T 세포 증식을 위해 PBMC는 1일째에 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극하고, 2일째에는 유전자 조작 검사를 받으며, 이후 3-4일마다 hIL-7과 hIL-15 보충제로 배양하고, 기능적 분석은 9일째에 최종 수확합니다. G-6M 형식에서는 사이토카인 보충이 2일째로 제한되며, 배양 기간 내내 추가 사이토카인 섭취는 필요하지 않습니다. CIK 세포 증식을 위해 PBMC는 1일째에 rhIFN-γ, 2일째에는 항CD3 항체와 rhIL-2로 자극받으며, 이 두 물질은 3-4일마다 투여됩니다. G-24에서는 사이토카인 보조제와 병행하여 중간 변화가 필요합니다. CIK 세포는 14일째에 하류 기능 분석(functional assay)을 위해 채취됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

병원체 오염 여부를 검사한 건강한 기증자의 익명 버피 코트(예: HIV, HCV, HBV, 매독)는 서면 동의 전에 파도바 병원 혈액은행에서 확보되었습니다. 혈액 샘플은 인증된 생물안전 캐비닛 내에서 처리되었으며, 직원들은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용했습니다.

참고: 렌티바이러스 벡터를 포함한 모든 절차는 기관 지침에 따라 생물안전성 레벨 2(BSL-2) 조건 하에 수행되었습니다. 렌티바이러스 매개체 취급은 이중 글로빙을 포함한 추가 예방 조치가 필요합니다. 생물학적 유해 폐기물(바이러스 물질, 형질 세포, 인간 유래 샘플 포함)은 폐기 전에 오토클레이션되었고, 화학 폐기물(형광 염료 및 시약 포함)은 기관 유해 폐기물 프로토콜에 따라 분리가 필요했습니다. 특정 생물안전 요건은 기관마다 다를 수 있으니 프로토콜 시행 전에 반드시 확인해야 합니다.

1. PBMC의 분리

  1. 건강한 기증자 버피 코트나 말초혈 샘플에서 밀도 구배 원심분리를 통해 PBMC를 분리합니다. 버피 코트를 멸균 1x 인산 완충 식염수(PBS)로 같은 부피로 희석하고, 희석된 혈액을 같은 부피의 림프포렙 위에 조심스럽게 겹쳐 50mL 원뿔형 튜브에 넣으세요. 말초혈에 대해 1배 PBS로 희석할 필요는 없습니다. 400 x g 에서 실온에서 브레이크 없이 20분간 원심분리기.
  2. 원심분리 후 PBMCs 층을 혈장-림프포렙 계면에서 수집하여 멸균 1x PBS로 세척합니다. PBMC를 조혈 세포배양 배양지(CM)에 원심분리하여 재현탁하며, 1% 페니실린/스트렙토마이신(이하 cCM)을 보완합니다. Trypan Blue 배제 검사법을 사용하여 세포 수와 생존 가능성을 평가합니다.

2. G-24 배양 용기 내 PBMC에서 CAR-T 세포 증식

  1. PBMC 활성화 (0일차)
    1. 2 x 10 6개의 신선한 PBMC를 2mL의 cCM에 5% 태아 소 혈청(FBS)(이하 cCM-F)을 보충하여 최종 씨앗 밀도 1 x 106 PBMCs/cm2/mL로 재현탁하고, 24웰 G-Rex(G-24) 배양 용기의 웰로 옮깁니다. 1일차(Step 2.2 - 1일차)에 수행할 다양한 전도(transduction) 조건 수만큼 많은 우물을 씨뿌리세요.
    2. 각 웰에 항체를 4 μl (순수 기능성, 최종 농도: 0.2 μg/mL)과 20 μl 항 CD28(순수 기능성, 최종 농도: 1 μg/mL) 항체를 직접 첨가하여 T 세포를 활성화시킵니다. 가습 인큐베이터에서 37°C,CO2 5%로 유지되는 배양 세포.
  2. 렌티바이러스 벡터를 이용한 T 세포 전달 (1일차)
    1. 하룻밤 자극 후, Trypan Blue 배제 검사법을 사용해 활성화된 T 세포를 채취하고 계수하여 생존 가능성을 평가합니다. G-24 웰(웰 면적 2 cm2)당 1 x 106개의 활성화 가능한 세포를 계산하며, 이는 0.5 x 106 셀/cm²에 해당합니다. 세포를 튜브에 넣고 300 x g에서 원심분리기로 5분간 옮깁니다.
    2. 각 웰의 전이체 배지를 준비하는데, 렌티바이러스 벡터 준비물의 농도(TU/mL)를 기준으로 적절한 렌티바이러스 벡터 부피(여기서는 St. Jude Children's ResearchHospital 25에서 얻은 CD19-CAR-BBζ 렌티바이러스 25; 감염 중복도(MOI) 20)와 5μl 전이도강화제 프로타민 황산염(8 mg/mL 정액은 프로타민 황산을 1x PBS에 용해하고 0.2 μm 필터로 멸균하여 얻음; 최종 농도) 50 μg/mL의 용량입니다. 5% FBS를 보충한 CM 배지를 사용하고, 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하지 않아 최종 부피는 0.8 mL/well(0.4 mL/cm²)로 만듭니다. 비전도(UTD) 대조를 위해서는 렌티바이러스 벡터 첨가를 피한 전도배지를 준비합니다.
    3. 펠릿 세포(단계 2.2.1)를 0.8mL/웰의 전도배지에 재현탁한 후 새로운 G-24 웰에 플레이트를 부착합니다. 37°C, 5%CO2에서 하룻밤 배양하세요.
      참고: 동일한 렌티바이러스 벡터로 여러 웰을 전도할 계획이라면, 바이러스와 프로타민 황산염을 원하는 농도로 포함하는 전도 배지를 마스터 믹스로 준비하십시오. 균질성을 위해 충분히 섞으세요. 그 후 각 펠릿 세포 튜브에 0.8mL의 마스터 믹스를 할당하여 모든 샘플에서 일관된 전이 조건을 보장합니다.
  3. CAR-T 세포 배양 및 증식 (2일차부터 9일차까지)
    1. 2일째에는 신선 cCM-F 7.2mL를 추가하여 최종 10 ng/mL(사이토카인 부피 계산)를 각각 10 ng/mL로 하여 최종 8 mL/웰로 배양 부피를 늘립니다.
    2. 5일째에는 각 웰에서 6mL의 조절된 배지를 조심스럽게 제거하고 웰 바닥 세포를 방해하지 않으며, 6mL의 신선한 cCM-F와 hIL-7, hIL-15를 보충하여 배양지를 새로 교체합니다(최종 농도: 웰당 총 부피 8mL를 기준으로 계산). 여러 웰을 다루는 경우, cCM-F 배지에 hIL-7 및 hIL-15 사이토카인을 보충한 마스터 믹스를 준비하여 사이토카인의 고르게 분포하도록 합니다.
    3. 9일째에는 CAR-T 셀이 효율적으로 확장되어 후속 응용을 준비합니다. CAR-T 세포를 채취하려면 5mL의 조절된 배지를 부드럽게 제거하여 버립니다. 1000 μL 피펫을 사용해 남은 3mL 배지에 CAR-T 세포를 재현탁하고 15 mL 튜브로 옮깁니다. CAR-T 세포를 세고 Trypan Blue 배제 검사법을 사용해 생존 여부를 확인하세요. 일반적으로 각 G-24 우물에서 약 3개의 107 CAR-T 셀(3.24 ± 1.67 x 107 셀)이 얻어집니다(보충표 1).

3. G-24 배양 용기에서의 CIK 확장

  1. PBMC 활성화 (0일차)
    1. G-24 배양 용기의 각 웰마다 신선하게 분리된 1 x 106개의 PBMC를 8 mL cCM에 재조합 인간 인터페론-γ(rhIFN-γ, 최종 농도: 1000 IU/mL)을 시딩합니다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 배양하세요.
  2. CIK 세포 자극 및 확장(1일차부터 14일차까지)
    1. rhIFNγ 자극 후 1일째 22-24시간, 각 웰에 항CD3 항체 4 μL(최종 농도: 50 ng/mL)과 재조합 인간 인터루킨-2(rhIL-2, 최종 농도: 500 IU/mL) 4 μL을 직접 첨가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 배양하세요.
    2. 세포 배양 5일, 9일, 12일차에 3일에서 4일마다, 6mL의 조절된 배지를 신선한 cCM과 rhIL-2(최종 농도: 500 IU/mL)로 교체하며, rhIL-2의 최종 농도를 전체 8mL 부피에 비교해 계산합니다.
    3. 14일째에는 5mL의 조절된 배지를 버리고 나머지 3mL의 조절된 배지에 재현탁하여 CIK 세포를 채취합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 Trypan Blue 배제 검사법을 사용해 총 세포 수와 세포 생존성을 평가합니다. 일반적으로 각 우물에서 약 8 x 107 벌크 CIK 셀(8.6 ± 4.58 x 107 셀)이 얻어집니다(보충표 2).
      참고: 배지 교체 시에는 세포층 집단을 교란시키거나 기체 투과성 막에 닿지 않도록 주의하여 상정액을 조심스럽게 흡인하십시오. 막의 손상은 가스 교환을 저해하고 세포 생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

4. 대규모 CAR-T 및 CIK 셀 제조

참고: 2절과 3절에서 설명된 CAR-T 및 CIK 세포 확장 프로토콜은 G-6M 포맷과 같은 더 큰 G-Rex 배양 장치로 쉽게 확장할 수 있습니다. G-24 포맷(표면적: 2 cm2)에서 G-6M 장치(표면적: 10 cm2)로 전환할 때, 모든 농도와 밀도는 일정하게 유지되며, 모든 부피와 절대량은 증가한 표면적에 맞춰 5배 비율로 증가합니다. 즉, 세포 시딩 밀도, 배지 보충 농도, 사이토카인 농도는 변하지 않지만, 배지의 총 양, 시딩된 세포 수, 추가된 사이토카인의 절대량은 비례적으로 확대됩니다. 이 확장성 기능은 소규모 연구 프로토콜에서 전임상 또는 초기 임상 제조로의 원활한 전환을 큰 프로토콜 수정 없이 가능하게 하여 일관된 효과기 셀 특성을 유지합니다.

  1. G-6M 포맷 소자에서의 CAR-T 셀 확장
    1. 1절에 설명된 대로 0일차에 PBMC의 활성화를, 1일차에 렌티바이러스 전도(lentiviral transduction)를 수행하여 모든 농도와 밀도를 유지하면서 부피와 절대량을 5배 증가시킵니다.
    2. 2일째에는 cCM-F 배지를 사용해 배양 부피를 총 100mL로 늘리세요. 최종 농도인 10 ng/mL를 산출하여 hIL-7과 hIL-15를 추가하세요.
      참고: G-24 형식과 달리, G-6M 장치의 더 높은 설계는 더 큰 배지 부피를 가능하게 하여 배양 기간 내내 배지 교체 없이 안정적인 영양분과 사이토카인 공급을 가능하게 합니다('채우고 잊기' 방식). 따라서 5일째에는 추가 사이토카인이 필요하지 않습니다.
    3. 9일째에 CAR-T 세포를 채취하려면, 혈청학적 피펫을 사용해 각 웰에서 약 90mL의 배지를 버리고 나머지 10mL에 세포를 재현탁합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮겨 이후 검사에 사용하세요.
  2. G-6M 형식 장치의 CIK 셀 확장
    1. 3절에 설명된 프로토콜에 따라 0일에 PBMC 시딩을 수행하고, 모든 부피와 시약을 5배 크기로 확장하여 더 큰 장치 포맷(G-6M)에 맞추세요.
    2. 첫날에는 cCM 배지를 사용해 배양 부피를 총 100mL로 조정합니다. 각 웰에 최종 농도인 500 IU/mL rhIL-2와 50 ng/mL 항-CD3를 첨가합니다.
    3. 각 웰에 매 3-4일(5일, 9일, 13일차)마다 매개체 매체 교체 없이 500 IU/mL rhIL-2를 보충합니다.
    4. 14일째에 혈청학적 피펫으로 각 웰에서 약 90mL의 배지를 추출하여 CIK 세포를 채취합니다. 남은 10mL의 세포를 재현탁하여 15mL 튜브로 옮겨 후속 검사에 사용합니다.

5. 유세포분석을 통한 효과 세포 표현형 특성

참고: 확장 프로토콜 종료 시, CAR-T 및 CIK 세포에 대해 유세포분석법을 이용한 표면 표지 분석이 수행되어, 이들의 표현형을 평가합니다. 여기에는 나이브(CD45RA+CD62L+), 중앙 메모리(CM, CD45RA-CD62L+), 효과기 메모리(EMA, CD45RA+CD62L-)가 포함됩니다. 보조 그림 1A-B).

  1. 각 염색관마다 3개의 10개5셀을 채취하세요. 세포를 1% FBS(PBS-F)와 함께 1x PBS에 세척하고, 300 x g에서 원심분리기에서 5분간 가동한 후, 원하는 염색 패널에 따라 50 μL 항체 혼합액(1 부분 브릴리언트 스테인 버퍼와 1 부분 PBS-F)에 재현탁합니다(표 1 및 표 2).
  2. 4°C에서 빛을 차단한 상태로 20분간 배양한 후 염색된 세포를 세척하고 원심분리기를 사용하세요. 두 번째 염색 단계가 필요하다면, 앞서 설명한 대로 특정 항체 혼합물(단계 5.1)으로 염색을 수행합니다.
  3. 마지막으로, 세포를 세척하고 생존 염료인 Fixable Viability Stain 780(FVS780)을 50 μL 1x PBS에 4 °C 빛으로부터 보호한 상태로 15분간 배양합니다. 생존 염색 후에는 세척 단계가 필요하지 않습니다. 배양 후에는 각 샘플에 1x PBS 200 μL 주를 추가하고 유세포 추출을 진행합니다. 상세한 게이팅 전략은 보충 그림 1A-B에 나와 있습니다.
과녁클론플루오로크롬농도/희석목적
첫 번째 착색 단계rhCD19-그의//2 μg/mLCAR 분자 검출
4°C에서 20분간 부화
세척 단계
두 번째 염색 단계그의GG11-8F3.5.1체육1/50CAR 분자 검출
CD3UCHT1BV5101/40혈통
CD4SK3BV6501/40혈통
CD8RPA-T8BV4211/20혈통
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83성숙
CD62LDREG-56FITC1/10유도, 활성화
4°C에서 20분간 부화
세척 단계
세 번째 염색 단계FVS780//1/5000생세포/죽음세포 구별
4 °C에서 15분간 부화

표 1: CAR-T 세포 염색에 사용되는 항체 패널. CAR 발현, T 세포 표현형, 분화 상태를 평가하는 염색 패널. 각 관심 표적별로 항체 클론, 농도, 그리고 결합 형광색소 색소가 보고됩니다.

과녁클론플루오로크롬희석목적
첫 번째 착색 단계CD56HCD56체육1/40혈통
NKG2D1D11APC1/83활성화
CD3UCHT1BV5101/40혈통
CD4SK3BV6501/40혈통
CD8RPA-T8BV4211/20혈통
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83성숙
CD62LDREG-56FITC1/10유도, 활성화
4°C에서 20분간 부화
세척 단계
두 번째 염색 단계FVS780//1/5000생세포/죽음세포 구별
4 °C에서 15분간 부화

표 2: CIK 세포 염색에 사용되는 항체 패널. 염색 패널은 CIK 아집단, 표현형 및 분화 상태를 평가하는 데 사용되었습니다. 각 관심 표적별로 항체 클론, 농도, 그리고 결합 형광색소 색소가 보고됩니다.

6. CAR-T 및 CIK 세포의 특이적 세포독성 활성 평가

참고: CAR-T 세포와 CIK 세포의 세포독성 활성은 목표 세포와 원하는 이펙터-표적 세포 비율(E:T)로 공동 배양하여 측정합니다. 분석 유형은 표적 세포의 유형에 따라 달라지며, 표적 세포가 고형 종양에서 유래했는지 혈액학적 악성 종양에서 유래했는지에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서는 현탁 세포에 대한 형광 세포 염료 기반 유세포 분석법과 부착 세포에 대한 임피던스 기반 실시간 세포 분석(RTCA) 분석법을 설명합니다.

  1. 형광세포 염료 기반 유세포분석 분석
    참고: 혈액 악성 종양에 대한 항원 특이적 세포독성은 형광세포 염료 기반 유세포분석 검사법을 사용하여 평가할 수 있습니다. 공동 배양 전에 표적 세포를 형광 염료로 표지하여 식별을 가능하게 합니다. 효과자 세포와의 공동 배양 후, 생존성 염료로 염색하여 표적 세포 사멸을 평가합니다. 유동 세포분석 분석은 비생존 형광 염료 양성 세포의 비율을 바탕으로 항원 특이적 살해를 정량화할 수 있게 합니다.
    1. 각 공동 배양 조건에 대해 2개의 105 표적 세포를 채취하여 400 μL 완전 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도는 5 x 105 세포/mL를 달성합니다. 최종 농도는 5 μM(여기서는 Cell Trace Violet 염료, CTV)의 형광 염료를 첨가합니다. 37°C에서 30분간 부양시키고, 빛을 차단하세요. 인큐베이션 후에는 세포를 완전한 배지로 한 번 세척한 후 최종 농도인 4 x 105 cells/mL로 재현탁합니다.
    2. 실험 설정에 따라 500 μL의 염색된 표적 세포 현탁액(여기서는 CD19+ 현탁 표적 세포 모델로 2 x 105 Raji 세포)을 깨끗한 5mL 튜브에 투여합니다. 형광 염료에 양성인 표적 세포를 식별하여 유세포분석을 통한 염색 성공을 확인한다(SSC-A 대 CTV). 형광 염료 양성 세포의 약 98%가 권장됩니다.
    3. 병행하여 각 공동 배양 조건에 대해 효과 세포(여기서는 5 x 10 6개의 CD19 CAR-T 세포)를 세고 준비합니다. 세포를 세척한 후 원하는 이펙터-표적(E:T) 비율에 맞는 적절한 농도로 전체 배양 배지에 재현탁합니다. 각 표적 세포가 포함된 해당 튜브에 500 μL의 이펙터 셀 현탁액을 추가합니다.
      1. 25:1 E:T 비율을 달성하기 위해, 각 튜브에 5 x 106 효과기 CD19 CAR-T 세포를 2개 x 105 라지 타깃 셀에 추가하고, 실험 설계에 필요한 만큼 튜브를 준비합니다.
    4. 공동 배양균을 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 6시간 배양합니다. 자발적 세포 사멸을 측정하기 위해 표적 세포만 포함하는 대조 조건을 포함하세요. 이 대조군은 배경 사멸과 효과기 세포 특이적 세포독성을 구분하는 데 중요합니다.
    5. 공동 배양된 세포를 세척한 후 1x PBS에 희석한 FVS780 생명력 염료(최종 희석 1:5000)로 염색합니다. 빛을 차단한 채 4°C에서 15분간 부양하세요. 세포를 세척한 후 최종 세포 펠릿을 600 μL PBS-F 버퍼에 재현탁합니다. 유동세포 검사를 통해 이펙터 세포 특이적 세포독성을 평가합니다.
      1. 플로우 사이토미터 게이팅 전략을 다음과 같이 수행하라: 형광 염료에 양성 세포를 표적 세포로 식별한 후(SSC-A 대 CTV), 이 집단 내에서 죽은 표적 세포의 비율(SSC-A 대 FVS780, 보충 그림 1C)을 계산한다. 특이적 용해를 효과체 세포 특이적 세포독성(효과자-표적 공동 배양 조건에서 CTV+ 내 %FVS780+)에서 빼서 계산합니다.
  2. 실시간 셀 분석(RTCA) 분석법
    참고: RTCA 분석법은 부착 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 세포독성 활성을 평가하는 방법입니다. 표적 세포 사멸은 xCELLigence 장치에 연결된 E-플레이트 웰에서 세포가 분리되어 임피던스 신호가 달라지는 현상으로 감지됩니다. 최적의 분석과 재현성을 보장하기 위해 제조사가 권장하는 프로토콜에 따라 RTCA 분석을 수행하세요.
    1. 세포 분석의 하루 전(1일차)을 타겟으로 하여 0일차까지 세포가 60%-80% 합류율을 달성하도록 합니다. 이 단계는 실험 시작 시 세포가 활발히 증식하는 상태를 유지하는 데 매우 중요합니다. 최적의 세포 성능을 보장하기 위해 5-20 통과 사이에 표적 세포를 사용하는 것이 선호되며, 해동 후 최소 1주(3-4 통과) 후에 사용하는 것이 선호됩니다.
    2. 0일째에 각 E-플레이트 웰에 50 μL의 배양지를 조심스럽게 추가하고, 장치 내부의 플레이트를 작동시켜 배경 신호를 획득합니다. 그 후 플레이트를 다시 후드로 옮겨 세포 씨앗 단계에 넣습니다.
    3. 표적 세포를 세기 후 필요한 총 수를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 세포를 적절한 양의 배양지에 재현탁하여 E-플레이트에 씨앗을 심을 수 있도록 하고, 각 웰에 100 μL의 표적 세포를 옮깁니다(여기서는 부착 종양 세포주 모델로 MCF-7 세포 4 x 104 개). 플레이트를 후드 내부에서 최소 30분 이상 실온에 두어 표적 세포가 고르게 부착되도록 하세요. 장치 내부의 판을CO2 인큐베이터에서 37°C에서 작동시키고 실시간 획득(획득 간격 15분, 22시간)을 시작합니다.
      참고: 제조사의 권장대로 새로운 표적 세포주를 사용하기 전에 표적 세포 적정을 수행하십시오.
    4. 대상 세포 시딩 후 약 20-22시간 1일째에 이펙터 세포를 세고 신선한 배양 배지에 재현탁하여 원하는 이펙터-표적(E:T) 비율을 맞추기 위해 세포 농도를 조정합니다. 예를 들어, 10:1 E:T 비율을 달성하려면 각 웰마다 4 x 105 이펙터 CIK 셀과 4 x 104 MCF-7 타깃 셀을 추가합니다.
    5. 멸균된 96웰 U-바닥판을 사용해 각 처리 조건을 기술적으로 복제하여 준비하고, 37°C에서 15분간 평형을 맞추세요. 각 조건마다 다채널 피펫을 사용해 50 μL의 이펙터 셀 현탁액을 분사합니다. E-플레이트를 다시 기기에 넣고 실시간 획득(24시간 동안 15분 획득 시간)을 계속하세요. 다음 식으로 특정 용해를 계산합니다:
      방정식 1

결과

여기서 설명한 프로토콜은 분리된 PBMC에서 추출한 CAR-T 및 CIK 세포에서 이펙터 셀을 체외 증식과 엔지니어링하는 데 효율적이고 견고한 워크플로우를 제공합니다. 이 방법은 최소한의 세포 조작이 필요하며, G-Rex 장치의 기체 교환 능력을 활용하여 기존 정적 배양 시스템에 비해 우수한 영양소 가용성과 산소 공급을 제공합니다23,24. 이 프로토콜의 주요 장점은 전임상 연구에 적합한 소규모 24웰 장치(G-24)에서 비례적 확장 외에는 프로토콜에 변경 없이도 번역 또는 임상 제조 요구에 부합하는 대형 6M 장치(G-6M)까지 확장성이 본질적으로 가능하다는 점입니다.

이 프로토콜을 사용하여 CAR-T 세포와 CIK 세포가 건강한 기증자 PBMC에서 G-24 및 G-6M 포맷으로 병행하여 성공적으로 증식되었으며, 이는 2-4절에 설명되어 있습니다. 배양 기간 말에 두 세포 유형 모두 높은 접힘 확장과 생존력을 보였으며, 두 장치 형식 간 증식량도 비슷하게 나타났습니다(그림 2, 보조 표 1, 보충표 2). 이는 프로토콜이 서로 다른 배양 규모에서 재현성을 입증했습니다.

배양 장치의 확장성을 검증하기 위해 효과기 세포는 표현형과 기능적으로 추가로 특성화되었습니다. CD19 CAR-T 세포에 대해서는 CAR 발현을 정량화하고 CD4+ 및 CD8+ 하위 집합을 평가했으며, CD19 CAR+ CD8+ T 세포가 우세함을 확인했습니다(그림 3A-B, 보충표 1). CIK 세포의 경우, T(CD3+CD56-), NK(CD3-CD56+), CIK(CD3+CD56+) 집단의 빈도(그림 3D)와 활성화 수용체 NKG2D의 발현(그림 3E, 보충표 2)을 평가하였습니다. 더욱이, CAR-T와 CIK 세포 모두에서 G-24와 G-6M 배양 포맷 간 특정 집단 표지자의 전반적으로 유사한 표현형과 발현을 관찰했습니다. CD19 CAR-T 및 CIK 세포 제품의 분화 상태를 CD62L과 CD45RA 염색을 통해 분석되었으며(그림 3C-F, 보충표 1, 보충표 2), G-24 및 G-6M 포맷 배양 세포 간 유사한 기억 및 효과기 표현형이 발견되었습니다. 이 결과는 과정을 확장하는 것이 확장된 효과 세포 집단의 표현형 무결성이나 분화 상태를 훼손하지 않는다는 것을 보여줍니다.

마지막으로, 기능적 효능을 평가하기 위해 표적 특이적 세포독성 검사를 사용했습니다. 두 기기 내에서 증식된 CD19 CAR-T 및 CIK 세포 모두 강력한 세포 분해 활성을 보여, 척도에 걸쳐 기능적 특성이 유지됨을 확인했습니다(그림 4). 전반적으로 이러한 결과는 확장된 제품들이 전임상 모델과 잠재적으로 임상 시험에서의 후속 응용에 적합함을 뒷받침합니다.

그림 2
그림 2: CD19 CAR-T 및 CIK 세포의 증식 및 생존 가능성. G-24 및 G-6M 플레이트에서 PBMC에서 증식된 CAR-T 세포(n = 5)와 CIK 세포(n = 6)를 각각 증식 9일차와 14일째에 수집하여 세포 수와 생존 가능한 세포의 (A-C) 주름 증가 및 (B-D) 비율 평가를 수행하였습니다. 히스토그램은 표준편차(SD)± 평균 표현을 나타내며, 점은 단일 기증자를 나타냅니다(개별 값은 보충표 1 과 보충표 2 참조). 데이터는 양측 다중 쌍 t-검정(A-C) 또는 다중 양측 Wilcoxon 매칭 쌍 순위 검정(B-D)으로 분석되었으며, 다중 비교에 대해서는 Holm-Sidak 보정(*p < 0.05)을 적용하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3: G-24 및 G-6M 장치에서 확장된 CD19 CAR-T 및 CIK 세포의 표현형 평가. CD19 CAR-T 세포(n = 5)에서의 CAR 분자 발현은 유세포분석으로 분석되어 (A) G-24 및 G-6M 확장 프로토콜에서의 전도 효율, 그리고 (B) CD4+/CD8+ 및 (C) CD3+CAR+ 하위 집합에서 순진/기억 하위 집단의 발현을 평가하였습니다. 유세포검사를 통해 유세포분석법으로 CIK 세포(CD3+CD56+), NK(CD3-CD56+), T(CD3+CD56-)의 비율과 CD3+CD56+ 하위 집합(G-24 n=5, G-6M n=6)의 발현을 조사하였습니다. 순진(CD45RA+CD62L+), 중앙 메모리(CM, CD45RA-CD62L+), 효과기 메모리(EM, CD45RA-CD62L-), 효과기 메모리 CD45RA-양성(EMRA, CD45RA+CD62L-). 히스토그램은 SD± 평균 표현을 나타내며, 점은 단일 기증자를 나타냅니다(개별 값은 보충표 1과 보충표 2 참조). 데이터는 양측 다중 쌍 t-검정(B-C-D-F) 또는 양측 윌콕슨 매칭 순위 검정(A-E)으로 분석되었으며, 다중 비교에 대해서는 Holm-Sidak 보정(*p < 0.05)을 적용하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4
그림 4: CD19 CAR-T 및 CIK 세포 독성 평가. (A) 버킷 림프종 라지 세포주에 대해 6시간 유세포 분석 기반 살상 분석법을 통해 CD19 CAR-T 세포(주황색, n = 5) 또는 비형질(UTD) 세포(회색, n = 5)의 특이적 용해를 수행하였다. 결과는 SD± 평균 특이적 용해로 나타난다. (B) G-24(연한 파란색, n = 7) 또는 G-6M(짙은 파란색, n=6)에서 배양된 CIK 세포의 세포독성이 유방암 MCF-7 세포주(부착 세포주 모델로서)는 실시간 세포 분석기를 사용해 24시간 동안 15분마다 모니터링되었다. 결과는 SEM± 평균 특이적 용해로 표시됩니다. 데이터는 Mann-Whitney 검정, Holm-Sidak 보정으로 분석되어 다중 비교를 위해 사용되었습니다(*p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 유세포 분석에 사용되는 게이팅 전략. (A) CAR-T 세포 표현형 특성화와 (C) 형광세포 염료 기반 세포독성 분석의 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 그래프들입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 1: 개별 기증자의 CD19 CAR-T 세포 배양의 성장, 생존 가능성 및 표현형. 각 기증자별로 각 기증자별로 배양 9일째에 채취된 CD19-CAR T 세포의 총 세포 수, 접힘 증가, 생존율 및 표현형 특성 분석을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 2: 개별 기증자의 CIK 세포 배양의 성장, 생존 가능성 및 표현형. 각 기증자별로 G-24 및 G-6M 장치에서 배양 14일째에 채취된 CIK 세포의 총 세포 수, 접힘 증가, 생존 가능성 및 표현형 특성 분석을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 G-Rex 배양 시스템을 사용하여 PBMC에서 CAR-T 세포와 CIK 세포라는 두 가지 다른 ACT 제품을 생성하기 위한 효율적이고 확장 가능한 플랫폼 구현을 개략적으로 설명합니다. 우리는 접근법의 확장성을 검증하기 위해 개념 증명 기능 및 표현형 분석을 구현했습니다. 확장된 세포의 표현형과 활성 모두 스케일업 과정에서 유지되어, 연구 응용과 직접적인 임상 번역에 적합함을 보장함을 보여주었습니다. 실제로 우리는 CAR-T와 CIK 세포가 높은 세포 수율로 효율적으로 증식할 수 있으면서도 기능적 효과기 표현형과 강력한 항원 특이적 세포독성을 다양한 배양 장치에서 유지할 수 있음을 성공적으로 입증했습니다.

배양 장치의 가스 투과성 막 기술과 결합되어, 이 확장 프로토콜은 증기 속도 속도를 높이고 수동 조작을 줄이며, 기증자 간에 일관된 높은 수율을 가능하게 합니다. 이러한 특징들은 프로토콜을 매우 재현성이 높게 하며, 표준 배양 시스템(20,21)과 비교해 다중 배지 교환과 세포 손실 및 오염 위험 증가를 수반하는 것과 비교해 노동 집약적도 적게 만듭니다.

더불어, 이 프로토콜은 제조 규모 간 원활한 전환을 가능하게 합니다: 소규모 오픈 시스템(예: CAR 구성체, 사이토카인 조합, 기증자 변이성 등 전임상 연구 및 스크리닝에 적합한 G-24)에서 대규모 오픈 시스템(G-6M, 프리-GMP 검증), 그리고 궁극적으로는 대규모 폐쇄 시스템(GMP 생산용)으로의 전환이 가능합니다. 이 연구에서 설명한 바와 같이, 소규모 개방 시스템에서 대규모 개방형 시스템으로의 발전은 장치 크기에 비해 부피와 셀 입력의 비례 조정만으로 이루어지며, 이는 상당한 실질적 이점을 제공합니다. 마찬가지로, GMP 제조에서 개방 시스템에서 폐쇄 시스템으로의 전환, 그리고 G-6M 프로토콜을 대규모 GMP 생산에 적응시키기 위해 필요한 유일한 구현은 적절한 GMP 등급 시약과 폐쇄형 시스템 장치(표면적 10cm2의 G-10M-CS, 단일 G-6M 우물에 해당, 또는 표면적 100cm²의 G-100M-CS, 프로토콜 자체의 추가 수정 없이 G-100M 오픈 대응 버전에 해당합니다. 이 폐쇄 장치는 자동 매체 취급을 위한 무균 튜빙 연결부를 통합하여 액체 취급 펌프(GatheRex)와 함께 완전히 폐쇄된 환경을 만듭니다. 이 폐쇄형 시스템 접근법은 수동 매체 교환을 없애고 오염 위험을 줄여, 멸균성과 재현성이 가장 중요한 GMP 준수 제조 환경에 이상적입니다. 특히 자원이 제한된 학계나 초기 생명공학 환경에서 초기 발견과 임상 전환 간의 간극을 메우는 중요한 요소입니다.

이 프로토콜의 완전한 GMP 준수를 위한 추가 시행은 FBS 함유 배지에서 혈청 무제/제종 없는 제형으로 전환하는 것을 고려해야 하며, 이는 FDA와 EMA의 현재 규제 동향에 부합하여 배치별 변동성을 제거하고, 잠재적 외계 유전자 오염 위험을 제거하며, 규제 준수를 강화하는 것입니다27.

더불어, 제안된 확장 시스템이 요구하는 최소한의 개입은 제조 과정에서 표현형 분석을 방해할 수 있는 절차로 인한 인공물을줄여 다차원 표현형 프로파일링을 구현하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 또한 CAR-T 및 CIK 세포를 넘어, 이 시스템은 다른 림프구 집단과 조작된 면역 세포에 매우 적응성이 높아 면역치료 개발에 대한 활용도를 확장할 수 있습니다29,30.

프로토콜은 견고하고 수정이 필요하지 않지만, 성공을 위해서는 몇 가지 단계가 특히 중요합니다. CIK 세포 증식을 위해서는 최적의 분화와 확장을 보장하는 사이토카인 첨가 시기가 필수적입니다. CAR-T 세포의 경우, 효율을 극대화하기 위해 활성화 후 24시간 이내에 전도가 이루어져야 하며, 렌티바이러스 알리코트는 한 번만 해동해야 합니다. 반복적인 동결-해동 사이클은 전도 효율을 크게 떨어뜨리기 때문입니다31.

1차 세포 준비물 간의 생물학적 변이성은 기증자의 다양성을 반영하여 팽창률과 기능 활성의 차이에 자연스럽게 기여합니다. 이러한 불가피하고 내재된 변동성은 여러 기증자로부터 병행 확장을 수행함으로써 효과적으로 관리할 수 있으며, 실험 전반에 걸쳐 견고하고 재현 가능한 결과를 보장합니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 PBMC에서 직접 기능성 효과 림프구를 빠르고 확장 가능하며 신뢰성 있게 확장할 수 있게 하여 초기 연구와 대규모 임상 번역 모두에 유연성을 제공합니다. 이 시스템은 다양한 세포 유형과 유전적 변형에 쉽게 적응할 수 있어 면역치료 개발을 위한 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

감사의 글

CAR 건설물은 MTA의 산하에서 세인트 주드 어린이 연구병원에서 제공했습니다. 이 연구는 ScaleReady G-Rex 2025 지원금의 지원을 받았습니다; 파도바 대학교 - SOMMAGGIO_BIRD24_01; AIRC 재단 5x1000 2019 - ID. 22759 프로그램; 알레안자 콘트로 일 칸크로, 프로제토 CAR-T_2 RCR-2023-23684268. 이 연구는 이탈리아 보건부로부터 출판 비용을 충당하기 위해 'Ricerca Corrente' 자금을 지원받았습니다. 피규어는 GraphPad Prism 9 소프트웨어와 BioRender.com 로 제작되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
브릴리언트 스테인 버퍼BD 생명과학566349
CD28 항체, 항인간밀텐이 바이오텍130-093-375클론 15E8
CD3 항체, 항인간밀텐이 바이오텍130-093-387복제 OKT3
CD3 BV510BD 생명과학740147클론 UCHT1
CD314 장갑 장갑차량 (NKG2D)바이오레전드320808클론 1D11
CD4 BV650BD 생명과학563875복제 SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD 생명과학563429클론 HI100
CD56 PE바이오레전드318306클론 HCD56
CD62L FITCBD 생명과학555543클론 FREG-56
CD8 BV450BD 생명과학562428복제 RPA-T8
CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트서모피셔 과학C34557
디메틸 설폭사이드 (DMSO)서모피셔 과학D2650
Dulbecco′ s 인산염 완충 식염수 (D-PBS)시그마 올드리치D5652
E-플레이트 16애질런트5469813001
태아 소 혈청(FBS), 가치서모피셔 사이언티픽A5256701
수리 가능한 생존 가능성 스테인 780 (FVS780)BD 생명과학565388
G-렉스 24 웰 플레이트  윌슨 울프80192M
G-Rex 6M 웰 플레이트  윌슨 울프80660M
HEPES 완충액론자ECM0180D
그의 항체밀텐이 바이오텍130-120-718
인간 알부민 20%CSL 베링
인간 IL-15 재조합 단백질페프로텍200-15
인간 IL-7 재조합 단백질페프로텍200-07
LSRFortessa X-20BD 생명과학
림프홉렙스템셀 테크놀로지18060
MCF-7ATCCHTB-22유방암 세포주  
페니실린과 스트렙토마이신론자ECB3001D
생리학적 용액 (0.9% 염화나트륨)모니코
프로타민 황산염시그마 올드리치P3369
라지ATCCCCL-86버킷 림프종 세포주 
재조합 인간 IFN-감마R& D 시스템즈285-IF-100/CF
재조합 IL-2 (프로류킨)노바티스
rhCD19-그의인비트로젠A42607
로즈웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI-1640)유로클론ECB9006L
안정된 L-글루타민론자ECB3004D
트라이판-블루 솔루션시그마 올드리치T8154
xCELLigence 실시간 셀 분석애질런트
X-VIVO 15 무혈청 조혈 배지론자02-053Q

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