방법 논문

포유류 세포에서 정량적 영상을 이용한 세포내 니코틴 아세틸콜린 수용체의 원형 및 세포내 원형질막 위치

DOI:

10.3791/69371

⸱

2025년 12월 19일

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 포유류 Neuro-2a 세포주를 이용한 뉴런 니코틴계 아세틸콜린 수용체 소단위의 발현 및 정량을 설명합니다. pH 민감성 형광 태그와 공초점 현미경은 수용체의 위치가 형질막과 pH 중립 세포 내 구획에서 발현된 수용체를 정밀하게 평가할 수 있게 하여 nAChR 수송과 약리학적 조절 연구를 용이하게 합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 세포 원형질막에 발현되는 뉴런 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR)의 정량화는 새로운 표적 선택적 치료제 개발과 수용체 수송을 조절하는 샤페론 단백질 연구에 중요합니다. 본 연구는 포유류 Neuro2a(N2a) 세포에서 동질체 및 이종 nAChR을 발현하고, pH 민감성 형광 태그를 사용하여 표면과 세포 내 위치를 정량화하는 견고한 방법론을 제시합니다. pHuji와 황당 pHluorin(SEP)은 pH에 민감한 단백질로, 재조합 단백질을 태그하도록 설계되어 nAChR 소단위체의 공간적 분포를 시각화할 수 있습니다. 이 형광 태그는 중성 pH에서 방출되지만 산성 환경에서는 소결됩니다. α7, α4, β2 nAChR 소단위체의 내부 및 원형질막 위치 비교를 추적하기 위해, pHuji 또는 SEP가 각 DNA 구성체의 C-말단에 부착됩니다. α7-pHuji와 그 샤페론 NACHO, 즉 (α4-SEP; β2-pHuji)를 N2a 세포에서 발현시키기 위해 지질 기반 DNA 형질전환 시약이 사용됩니다. 트랜스펙션 시약과 플라스미드 DNA는 상온에서 환원 혈청 배지에서 별도로 배양한 후, 플라스미드를 세포로 전달하는 지질-DNA 복합체를 형성합니다. 배양 후, 세포는 고pH 및 저pH 조건 또는 아형 선택적 형광 리간드가 존재하는 상태에서 생세포 공초점 현미경으로 영상화됩니다. 관련 형광체 채널의 보정된 총 세포 형광을 사용하여 이미지를 분석하여, 형질막과 세포 내 구획 간 형광 표지 nAChR 소유닛의 분포에 대한 정량적 정보를 제공합니다. 라이브 셀 공초점 영상은 nAChR 소단위체의 위치를 실시간으로 추적하여 내부 수용체 집단과 표면 수용체 집단 간의 차이를 구분할 수 있게 합니다. α7-pHuji 또는 (α4-SEP; β2-pHuji)의 견고한 원형질막 발현은 37°C에서 24시간 이내에 달성됩니다. 이 방법은 nAChR 수송, 약리학적 조절, 질병 관련 nAChR 발현 변화 연구를 위해 추가 샤페론, 보조 소단위 또는 형광 리간드를 포함하도록 조정할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뉴런 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR)는 뉴런, 교세포, 면역세포 등 다양한 세포 유형의 원형질막에 발현되는 리간드 게이트 관통막 이온 채널입니다. 이 수용체들은 α(α2-α10) 또는 β(β2-β4) 소단위로 구성되어 동등분체 또는 이형질체 아형을 형성하며, 뇌 내에서 α7과 α4β2 nAChR이 가장 풍부합니다1,2. 이러한 하위 유형의 조절 장애는 알츠하이머병, 니코틴 사용 장애, 수면 관련 과운동 간질, 파킨슨병, 주요 우울장애 등 신경학적 및 정신과적 질환과 관련이 있습니다. 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . nAChRs를 빠르고 신뢰할 수 있게 발현하고 정량화하는 방법은 질병 기전을 이해하고 표적 선택적 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 하지만 이러한 수용체의 견고한 원형질막 발현을 달성하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 소요됩니다. 여기서 설명하는 방법은 DNA 트랜스펙션 후 약 24시간 이내에 nAChRs의 강한 표면 발현을 가능하게 하며, 수용체 수송을 조절하는 리간드 또는 샤페론 단백질과 결합할 수 있습니다.

nAChR을 발현하는 여러 방법이 존재하는데, 여기에는 일시적 DNA 트랜스펙션이나 원하는 아형을 발현하는 안정적인 세포주 생성 등이 포함됩니다. 안정적인 세포주 생성은 동일한 수용체 아형을 포함하는 장기 연구에 유용하지만, 이 과정은 노동 집약적이며 수개월이 소요될 수 있습니다. 일단 확립된 세포주는, 수용체 발현이 경로별로 변동적이거나 시간이 지남에 따라 발현이 감소하거나, 수용체 기능이나 밀도가 낮은 클론에서 선택 편향을 보일 수 있습니다13. 잠복 온도를 37°C에서 30°C로 낮추거나, 니코틴과 같은 분자 보호자를 추가하거나, 잠복 시간을 연장하면 표면 발현을 촉진할 수 있습니다. 13,14,15. 이러한 한계는 적절한 소단위체 조립과 수송이 필요한 이종형 nAChR과 샤페론 보조 수용체 조절에 초점을 맞춘 연구에서 특히 두드러집니다. 따라서 안정적인 nAChR 발현 세포주를 다룰 때는 통로 간 수용체 아형 발현의 일상적인 검증이 필요합니다.

연구자들은 종종 nAChR 소단위체 변이와 샤페론 또는 보조 단백질 소단위에 관심을 가지므로, 빠른 유연성을 위해 다양한 DNA를 빠르게 연속적으로 발현해야 합니다. nAChRs의 일시적 발현은 이 과정이 빠르게 완료될 수 있어 연구자가 안정적인 세포주를 생성하는 데 수개월을 기다리지 않고도 여러 수용체 아형이나 실험 조건을 연구할 수 있다는 점에서 유리합니다. 일시적인 발현이 있더라도 많은 nAChR이 유도 후 24시간이 지나도 세포 내에 남아 37 °C에서 흔히 발생하며, 이는 > 48시간16,17 추가 배양 기간이 필요하다는 점입니다. 예를 들어, 콜린에스터라제 억제제에 저항성 샤페론 단백질(RIC)-3이 없을 때, 포유류 SHE-P 세포의 원형질막에서 α7 nAChRs 중 ~~1%만이 발현됩니다18. RIC-3의 공동 발현을 통해 지표면에서 약 20%의 α7 nAChR이 검출됩니다. 이는 개선을 의미하지만, 총 수용체 풍부도는 여전히 낮습니다. α7 nAChRs와 NACHO의 공동 발현은 표면 발현을 더욱 증강시킬 수 있으나, 전체 수용체 집단의 40% 미만이 원형질막으로 이동한다19. 또 다른 방법은 형질전환 세포를 30°C에서 배양하여 원형질막 발현을 개선하는 것입니다20,21. α4β2 nAChR의 경우, 이 온도 감소는 표면 수용체 밀도가 5배 상향 조절되지만, 전체 소단위 단백질21은 증가하지 않는다. 하지만 이 개선에는 최소 하루의 추가 시간과 소모품, 시약, 기기의 더 많은 사용이 필요합니다.

본 연구는 포유류 N2a 세포에서 형질전환 후 24시간 이내에 특정 nAChR 아형을 발현하고 정량화하는 최적화된 방법 세트를 제공하며, α7은 약 83%, α4는 77%, 원형질막에 국소한 β2 소단위체는 56%를 달성합니다. α7 nAChR의 경우, 원형질막 발현은 α7 선택적 형광 표지 α-분가로톡신(αBTX)이나 재조합 형광 태깅을 통해 정량화할 수 있습니다. 각 소단위체를 표지하기 위해, pH 민감성 형광 단백질인 pHuji와 상황 pHluorin (SEP)22, 23, 24가 개별 nAChR 소단위체25,26의 C 말단에 설계됩니다. pHuji와 SEP는 각각 pH 민감성 변이체인 적색과 녹색 형광 단백질로, pH 7.4에서 형광을 발하지만 더 산성 조건에서 소환됩니다27,28. SEP와 pHuji 형광은 pH < 6에서 억제되므로, 관찰되는 세포 내 신호는 형질막이 아닌 중성 구획에 위치한 형광체를 반사합니다. 골지체 기관과 같은 일부 소기관은 산성 루멘을 가지고 있다는 점에 주목해야 합니다; 따라서 nAChR 소단위체의 C 말단 영역에 부착된 형광체는 분비 경로29를 통과하는 동안 검출되지 않습니다. pH 7.5에서의 총 형광과 pH < 6에서의 총 형광 차이는 원형질막에 위치한 nAChRs가 생성하는 신호를 나타냅니다. 라이브 세포 공초점 현미경을 이용한 이미지 캡처는 높은 공간 해상도를 제공하여 소단위 위치를 정밀하게 정량화할 수 있습니다. 또한, 모든 실험을 생세포에서 수행함으로써 각 세포가 자체 대조군 역할을 하여 각처리그룹 내 세포 간 단백질 발현 변동성을 고려할 수 있습니다. 이 방법은 NACHO 등 추가 샤페론 단백질을 포함하도록 추가하여 nAChR 운송을 조사할 수 있습니다. 추가적인 응용 분야로는 약리학적 조절, 보조 소단위의 도입, 그리고 질병 관련 nAChR 발현 변화 분석이 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 다음 절차는 N2a 세포주에 nAChR 소단위체를 일시적으로 형질전환하는 데 성공적으로 사용된 방법을 설명합니다(그림 1). 견고한 원형질막 발현은 생세포 공초점 현미경으로 포착된 후 24시간 이내에 달성됩니다.

figure-protocol-1
그림 1: 프로토콜에 제시된 개별 방법들의 개식적 제시. 세포는 영상 접시에서 70%-80% 정도 융합될 때까지 성장합니다. 그 후 세포는 형질전환 시약과 DNA 복합체로 처리됩니다. (상단) 24시간 후, 세포는 형광 표지 리간드로 처리하여 원형질막에 발현된 소단위체를 표지한 후 공초점 현미경으로 영상화할 수 있습니다. (아래) 또는 형질전환 후 24시간 후에 pH 민감성 단백질로 표지되도록 변형된 nAChR 소단위체 유전자의 경우, 공초점 현미경을 사용해 세포의 전체 형광을 포착하기 위해 살아있는 세포를 이미징할 수 있습니다. 그 후 pH 7.4 영상 버퍼를 pH 5.5 소환 버퍼로 변경합니다. 이로 인해 세포 원형질막에 위치한 nAChR 소단위체에 태그된 pH 민감성 단백질의 형광이 멈추고, 내부 소단위체만 형광을 유지하게 됩니다. 같은 세포들을 다시 영상으로 촬영합니다. 이미지 분석은 ImageJ를 사용하여 내부 및 외부 소단위의 표현을 정량화합니다. 이 절차들은 샤페론 및 보조 단백질을 포함하도록 수정할 수 있습니다. BioRender로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. N2a nAChR 일시적 형질전환

참고: N2a 세포주는 신경 표현형과 nAChR의 내인성 발현이 낮기 때문에 선택되었습니다. α7-pHuji, α4-SEP, β2-pHuji 소단위 유전자는 각각 포유류 pcDNA3.1(+) 발현 벡터에 개별적으로 보관되어 있습니다. 샤페론 단백질인 NACHO는 pREP9에서 발현됩니다(노스이스턴 대학교의 R. Loring 박사가 후하게 기증한 것입니다). 모든 단계에서 멸균 기술을 사용하고 생물안전 캐비닛 안에서 작업하세요. 깨끗한 실험실 코트, 안전안경, 장갑을 착용하세요. 생물안전 캐비닛에 들어오거나 나가는 모든 물질을 70% 에탄올로 세척하세요. 다음 단계들은 영상 촬영에 적합한 35mm 폴리-D-라이신 코팅 유리 바닥 접시에서의 트랜스펙션을 설명합니다. 양은 배양 용기에 따라 필요에 따라 조정할 수 있습니다.

  1. T25(또는 유사) 조직 배양 플라스크에 이글스 최소 필수 배지(EMEM)를 넣고 10% 태아 소 혈청(FBS)과 필요 시 100 U/mL 페니실린과 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충합니다. 세포가 ~90% 합율에 도달할 때까지 37°C, 5% CO₂에서 배양합니다. 4배 광학 현미경 대물렌즈를 사용해 시각화하세요.
  2. 매일 광학 현미경으로 합류도를 모니터링하고, 최적의 상태를 유지하기 위해 1-2일마다 배지를 교체하세요. 세포가 ~90% 합리에 도달하면 영상 접시로 통과할 준비가 됩니다.
  3. 모든 시약을 수욕에서 37°C로 예열하세요. 시술 시작 전에 바이오세이프티 캐비닛과 모든 재료를 70% 에탄올로 깨끗이 청소하세요.
    주의: 70% 에탄올은 매우 가연성이 강한 액체이자 증기로, 심각한 눈 자극을 일으킬 수 있습니다. 열, 불꽃, 열린 불꽃 및 기타 점화원을 피하세요. 통기가 잘 되는 곳에 보관하고 용기는 꼭 닫아두세요. 다룰 때는 보호용 장갑과 눈/얼굴 보호구를 착용하세요. 피부나 눈에 닿으면 즉시 물로 헹구고 자극이 계속되면 의료진의 진료를 받으세요. 대신 5%-10% 표백제 용액과 같은 대체 소독제를 사용할 수 있습니다.
  4. 플라스크에서 오래된 배지를 흡인하고 5mL PBS로 세포를 세척하세요. 플라스크에 트립신 1mL를 넣고 부드럽게 휘저으세요. 세포가 떠올릴 때까지 배양하세요(<5분). 과소화를 방지하기 위해 즉시 4mL의 EMEM 성장 배지를 추가하고 부드럽게 피펫을 사용해 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
  5. 헤모사이토미터를 사용해 세포 농도를 측정하고, 현탁액을 조절하기 위해 필요한 EMEM 성장 배양지를 계산하여 1mL에 0.5-2 x 10⁵ 세포가 들어있도록 합니다.
  6. 35mm 접시당 1mL의 세포 현탁액을 배지하고, EMEM 성장 배지를 충분히 추가하여 전체 부피를 2mL로 만듭니다. 37°C, 5% CO₂에서 하룻밤 배양하세요. 세포는 70%-80% 합율 상태에서 형질전환 준비가 되어 있습니다.
  7. 형질전환 당일에는 시약을 37°C로 예열하고, nAChR 소단위체를 완전히 해동한 후 형질전환 시약을 실온으로 옮깁니다. 모든 시약을 생물안전 캐비닛에 넣기 전에 70% 에탄올로 세척하세요.
  8. α7 nAChR를 발현하려면: 마이크로 원심분리관 내에서 4 μg α7(1 μg/μL)과 1 μg NACHO(1 μg/μL) 플라스미드 DNA를 환원 혈청 배지(항생제 없음)에 희석하여 최종 250 μL로 희석합니다. DNA 첨가 후 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
    1. α4β2 nAChR을 발현시키기 위해: 각 소단위체 DNA를 총 250 μL 환원 혈청 배지에 희석합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요. 각 소단위의 비율을 조정하여 특정 수용체 아이소폼의 발현을 최적화합니다.
    2. 추가 플라스미드와 함께 α4β2 nAChR을 발현하려면 각 플라스미드 DNA를 같은 양의 DNA를 추가합니다. pcDNA3.1(+)의 청색 형광 단백질 mTagBFP2³¹은 대조 플라스미드 역할을 하며, 임의의 α4β2 샤페론으로 대체할 수 있습니다.
  9. 사용 전에 DNA 형질전환 시약을 부드럽게 섞으세요. 별도의 마이크로 원심분리관에서 8 μL 형질전환 시약을 250 μL 환원 혈청 배지에 드롭 희석합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 25분 이내에 다음 단계로 진행하세요.
  10. 5분 후, 희석된 DNA와 희석된 형질전환 시약(총 = 500 μL)을 점하위로 결합합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞은 후 실온에서 20분간 배양하세요. DNA-지질 복합체는 최대 6시간 동안 안정적으로 유지됩니다.
  11. 복합체가 형성되는 동안, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼내고 1mL의 혈청 무 EMEM(항생제 없음)으로 배양지를 교체하세요.
  12. 각 접시에 500 μL의 DNA 형질전환 시약 복합체를 드롭 방향으로 첨가합니다(최종 부피 = 1.5 mL). 접시를 흔들어 부드럽게 섞어 접시 전체, 특히 유리 바닥 표면에 고르게 분포되도록 하세요. 37°C에서 24시간 배양한 후 4-6시간 후에 배양지를 교체하여 세포 건강을 증진하세요.

2. αBTX Alexa Fluor 647을 이용한 원형질막 발현 α7 nAChR의 생세포 표지

참고: 다음 절차는 일반적으로 형질전환 후 24시간 후에 시행됩니다. αBTX Alexa Fluor 647(αBTX-AF647)을 빛으로부터 보호하여 형광소체의 광파괴를 방지합니다.

  1. 모든 시약을 37°C로 예열한 후 αBTX-AF647 스톡(2.3 μM) 용액을 해동합니다. 70% 에탄올로 청소한 후 생물안전 캐비닛에 넣으세요.
  2. 인큐베이터에서 α7과 NACHO DNA로 형질전환된 세포가 들어 있는 접시를 꺼내 70% 에탄올로 외부 세척을 한 뒤 생체 안전 캐비닛에 넣으세요.
  3. 기존 매체는 진공 흡입으로 버리세요. 세포를 세척할 때는 신선한 EMEM 배양지 2mL를 추가하세요.
  4. 진공 흡입으로 세척 미디엄을 제거하세요. 접시에 EMEM 성장 배지 2mL를 추가하세요.
  5. 적절한 양의 배지를 αBTX-AF647로 대체하여 최종 농도는 80 nM에 도달합니다. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
  6. 아침에는 PBS나 선호하는 영상 매체를 예열하고 70% 에탄올로 청소하세요. 생물안전 캐비닛으로 옮겨.
  7. 인큐베이터에서 형질전환된 세포를 꺼내 청소한 후 생물안전 캐비닛에 보관하세요.
  8. αBTX-AF647이 포함된 기존 배지를 제거하여 적절한 폐기물에 넣으세요.
  9. 세포를 2mL로 3회로, 각 10분씩 실온에서 세척합니다. 세척은 결합되지 않은 리간드와 이물질을 제거하며, 연구자의 필요에 맞게 시간을 조정할 수 있습니다. 세척 후에는 PBS를 제거하세요.
  10. PBS 또는 선호하는 영상 배지를 2mL 추가한 후 공초점 현미경으로 세포를 영상화합니다.

3. 전체 및 내부 α7-pHuji nAChRs의 생세포 영상

참고: 다음 절차는 자체 제작된 α7-pHuji pcDNA3.1 플라스미드를 NACHO 샤페론과 공동 트랜스펙션하여 사용합니다. 유사한 프로토콜이 대조군 플라스미드 mTagBFP2 pcDNA3.1과 함께 pcDNA3.1에서 α4-SEP와 β2-pHuji를 발현하는 데 사용되었으며, 이는 결과 섹션에 설명되어 있습니다. 시술 전 과정에서 샘플을 빛으로부터 보호하여 형광포체의 광파괴를 방지하세요.

  1. 23에 설명한 대로 pH 7.4 영상 버퍼(표 1)와 pH 5.5 담냉 버퍼(표 2)를 준비합니다.
  2. 시약을 37°C로 예열한 후 70% 에탄올로 세척한 후 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다. 인큐베이터에서 형질전환된 세포를 꺼내 70% 에탄올로 세척한 후 생물안전 캐비닛에 넣으세요.
  3. 흡입으로 기존 매체를 제거하세요. 2mL PBS로 3회, 각 10분씩 실온에서 세척하세요. pH 7.4 이미징 버퍼 2mL를 추가합니다.
  4. 접시를 공초점 현미경에 가져가세요. pH 7.4 이미징 버퍼가 있는 영상 접시를 슬라이드 홀더에 삽입하고, 홀더를 공초점 현미경의 예열된 환경 챔버에 넣습니다.
  5. 연동 펌프 튜브를 영상 접시 홀더에 연결하고 챔버를 닫으세요.
  6. 영상 소프트웨어를 열고 관심 있는 형광체(pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm, mTagBFP2 359/461 nm)를 선택하세요.
  7. 접시를 스캔하여 10x-60x 대물렌즈를 사용해 세포를 찾아 영상을 촬영하세요. 원한다면 확대를 높이고 필요에 따라 초점 깊이를 조절하세요.
  8. 레이저 세기와 검출기 감도를 조절하여 배경 신호 없이 형광을 시각화할 수 있습니다. 필요하다면 형광 신호를 높이기 위해 조리개를 조절하세요.
  9. 선호하는 해상도를 선택하고 원하는 대물렌즈(예: 60배)를 사용해 단일 이미지를 캡처합니다.
  10. pH 5.5 소결 버퍼로 버퍼 변경을 한 후 같은 셀을 재배치하기 위해 접시 지도에 위치를 기록하세요.
  11. 접시의 여러 영역에 대해 이미징 과정을 반복하며, 각 새로운 위치를 기록하세요. 모든 이미지(실험군 및 대조군)에 동일한 촬영 설정을 사용하여 유효한 비교를 가능하게 하세요.
  12. 유출 라인만 연동 펌프에 연결한 채, pH 7.4 완충제를 접시에서 폐기통으로 천천히 빨아들여 넣으세요.
  13. 대부분의 버퍼가 제거되면(건조 셀 제외), 유입 라인을 pH 5.5 소환 버퍼로 옮깁니다.
  14. 연동 펌프를 켜서 pH 5.5 완충제를 천천히(분당 1.5mL) 접시에 추가하여 세포가 계속 붙어 있도록 하세요.
  15. 펌프를 20분간 돌리면서 버퍼가 안테나 안팎으로 올바르게 흐르는지 관찰하세요.
  16. 펌프를 끄고 pH 5.5 소환 완충제로 세포를 추가로 20분간 배양하여 평형을 맞추세요.
  17. 이미징을 반복하려면 이전 세션에서 저장된 위치를 불러와 같은 영역으로 돌아가세요.
  18. 초점 깊이와 위치가 정확한지 확인하세요. 버퍼 교환 후 초점이 이동할 수 있습니다.
  19. pH 소독 조건을 사용하여 저장된 모든 위치에서 다시 영상을 수행하세요.
시약농도 (mM)
나클135
KCl5
MgCl21.8
젠장20
D-포도당1
pH 7.4로 용액을 조정하세요

표 1: 이미징 버퍼 레시피. 다음 시약들이 함께 추가되었고, 용액은 pH 7.4로 조정되었습니다.

시약농도 (mM)
나클135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
D-포도당1
pH 5.5로 용액을 조정하세요

표 2: 소환 버퍼 레시피. 다음 시약들을 혼합하여 결과 용액을 pH 5.5로 조절했습니다.

4. 이미지 정량화

참고: 이 절차는 ImageJ(국립보건원, 메릴랜드주 베데스다)와 교정 전세포 형광(CTCF) 방법32를 사용하여 세포 영상을 분석하는 방법을 설명합니다.

  1. ImageJ를 열고 분석할 이미지를 엽니다. 이미지는 각 캡처된 채널이 같은 프레임 내에서 분리된 스택 형태로 나타납니다.
  2. 페이즈 채널로 이동하세요. 이미지가 너무 밝으면(빈 영역이나 배경 영역에서 흔한 현상), '프로세스 > 명암비 향상'을 선택한 후 확인을 클릭하세요.
  3. 돋보기 도구를 사용해 한 셀을 확대(+)합니다. Freehand 선택 도구를 사용해 위상 채널에서 셀의 윤곽을 따라 그립니다.
  4. 관심 있는 형광체에 대응하는 형광 채널로 전환하세요. 분석 > 측정 설정(Set Measurements)을 선택하여 원하는 측정값을 설정하세요. 면적, 평균 회색값, 통합 밀도 를 반드시 확인하세요.
  5. 선택한 영역을 측정하려면 Analyze > Measure 를 선택하거나 Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows)를 누르세요.
  6. 셀 근처의 빈 공간을 따라 세 가지 배경 측정을 하세요. 원하는 셀 수만큼 단계를 반복합니다.
  7. 측정 데이터는 ImageJ의 별도의 결과 창에 나타납니다. 이 데이터를 복사해서 엑셀에 붙여넣어 분석하세요.
  8. 세 가지 배경 측정값에서 평균 배경 평균을 계산하세요.
  9. 다음 공식을 사용하여 각 셀의 CTCF 값을 계산합니다:
    CTCF=통합 밀도−(세포 면적 x 평균 배경 형광)
  10. 이 과정을 여러 세포와 각 실험군(그리고 해당 시 pH 조건)에 대해 이미지를 반복합니다. 모든 결과를 통계 처리를 위해 데이터 분석 소프트웨어로 내보내세요.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위의 형질전환 절차 후, α7 nAChRs와 NACHO 샤페론 단백질이 N2a 세포에서 공동 발현되었습니다. 비형질전환 세포와 형질전환 세포 모두 DNA 형질인화 후 24시간 후에 αBTX-AF647로 표지하였습니다. αBTX는 막 투과성이 없기 때문에 검출되는 모든 형광은 원형질막에 존재하는 수용체에서 기원합니다. 그림 2A, A′ 에서는 예상대로 비형질전환 N2a 세포에서 약한 αBTX-AF647 염색이 관찰되었습니다. N2a 세포는 내인성 소량의 α7 nAChR을 발현하여 이 최소한의 표지가 이루어집니다. 반면, 양성 형질전환 세포는 강력한 αBTX-AF647 표지를 보였습니다(그림 2B,B′). 형광 신호는 종종 원형질막 발현과 연관된 이산적인 지점 형태로 나타납니다

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 N2a 세포에서 nAChR 소단위체를 발현하고 정량화하는 방법론은 신약 발견, 위치 지정, 운송 연구를 위한 nAChR(> 60%) 빠르고 풍부하게 nAChR(60%) 발현을 달성하는 데 오랜 어려움을 해결합니다. 이 프로토콜 세트의 주요 강점은 동질체(α7)와 이형형(α4β2) nAChR에 대한 적응성이며, 이는 샤페론 단백질의 공동 발현과 함께 다른 nAChR 아형에도 적용 가능할 가능성이 높다. SEP와 pHuji와 같은 pH 민감 태그를 활용하여 이 접근법은 생세포 구별과 형질막과 세포 내 nAChR 집단 간의 정량화를 가능하게 합니다. 이 구분은 nAChR 아형이 14-3-3, NACHO, RIC-3, LYNX-1 단백질 등 다양한 샤페론 및 보조 단백질과 니코틴 17,18,35,36,37,38,39와 같은 리간드에 의해 운송

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 기술 현미경 전문성을 제공해 준 제임스 자노소와 알래스카 페어뱅크스 대학교의 현미경 핵심을 지원해 준 국립P20GM130443보건원 국립 일반 의학 연구소 소속 대사 변혁 연구 센터에 감사를 표합니다. LW의 노력은 알래스카 주가 알래스카 대학교를 통해 제공하는 고등교육 투자기금(Higher Education Investment Fund)의 자금 지원을 부분적으로 받았습니다. SMS의 노력은 국립보건원 산하 국립일반의학과학연구소(NIH)의 기관 개발 상(IDeA)으로 지원받았으며, 보조금 번호는 P20GM103395입니다. 본 출판물에 보고된 연구는 국립보건원(NIH) 산하 국립정신건강연구소(MMW 수상 번호 R03MH135358)와 국립 일반의학 연구소(MMW 수상 번호 R16GM150455)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA (1X) 깁코25200-056셀 박리 시약
알파-분가로톡신 알렉사 플루어 647인비트로젠B35450알파-분가로톡신 켤레
BSL 1단계 생물안전 캐비닛  누아이레NU-425-400무균 세포 배양 작업 구역
염화칼슘아벤토르/VWRBDH9224버퍼 성분
D-(+)-포도당밀리포어 시그마와 nbsp;G8270버퍼 성분
L-글루타민을 이용한 EMEMATCC30-2003세포 배지
엔도톡신 없는 DNAZymo 키트를 사용해 자체 제작해당되지 않음세포 일시적 형질전환에 사용되는 nAChR DNA
엔도톡신 없는 마이크로 원심분리기 튜브, 0.5 mL  아벤토르/VWR89000-010DNA 및 형질전환 준비
엔도톡신 없는 마이크로 원심분리관 1.5 mL  아벤토르/VWR20170-038DNA 및 형질전환 준비
태아 소 혈청아벤토르/VWR97068-085혈청 보충제
플루오뷰 FV10i올림포스FV10i공초점 현미경
유리 바닥 매트텍 접시맷텍P35GC-0-10-C이미징 접시
그래프패드 프리즈 v. 10그래프패드 프리즘https://www.graphpad.com/features데이터 분석 소프트웨어
젠장밀리포어 시그마와 nbsp;H3375버퍼 성분
리포펙타민 2000인비트로젠11668019트랜스펙션 시약
육수화마그네슘 클로라이드열과학413410025버퍼 성분
MES 하이드레이트밀리포어 시그마와 nbsp;M5287버퍼 성분
mTagBFP2-pBADAddGene 54572대조 DNA는 세포 일시적 형질전환에 사용될 것;
신경 2 a(N2a) 세포미국 타체 문화 컬렉션CCL-131DNA 형질전환 및 nAChR 발현에 사용되는 세포
옵티-MEM깁코31985-070환원 혈청 배지
페니실린/스트렙토마이신아벤토르/VWRK952-100mL항생제
연극 펌프길슨미니펄스3영상 촬영 시 버퍼가 변함  
인산 완충 식염수퀄리티 바이오컬119-069-131식염수 완충제
피펫 보조드럼몬드와 nbsp;140084정밀 액체 이동
피펫 팁 (멸균 및 내독소 없음, 1000uL)레이닌30389216정밀 액체 이동
피펫 팁 (멸균 및 내독 없음, 20uL)레이닌30389229정밀 액체 이동
피펫 팁 (멸균 및 내독소 없음, 250uL)레이닌30389246정밀 액체 이동
피페테스, P10Rainin L-10XLS정밀 액체 이동
피페테스, P100Rainin L-100XLS정밀 액체 이동
피페테스, P1000Rainin L-1000XLS정밀 액체 이동
염화칼륨밀리포어 시그마와 nbsp;P3911버퍼 성분
혈청학적 피펫 (멸균 및 내독 무첨가, 10 ML)아벤토르/VWR89130-898정밀 액체 이동
혈청학적 피펫(멸균 및 내독 무첨가, 25 mL)아벤토르/VWR89130-900정밀 액체 이동
혈청학적 피펫 (멸균 및 내독소 무첨가, 5 mL)아벤토르/VWR76201-710정밀 액체 이동
혈청학적 피펫(멸균 및 내독 무첨가, 50 mL)아벤토르/VWR75816-088정밀 액체 이동
염화나트륨아벤토르/VWRBDH9286버퍼 성분
조직 배양 플라스크팔콘353109재배 요리
자이모퓨어 II 플라스미드 맥시렙 키트자이모 연구D4203-A + D4203-B엔도독소가 없는 DNA 생성
α 4-SEP ThermoFisher 사이언티픽 GeneArt 유전자 합성 서비스  그리고 nbsp;https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html맞춤형 유전자 합성 서비스
α 7-p후지트위스트 바이오사이언스https://www.twistbioscience.com/맞춤형 유전자 합성 서비스
&베타; 2-p후지ThermoFisher 사이언티픽 GeneArt 유전자 합성 서비스  그리고 nbsp;https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html맞춤형 유전자 합성 서비스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

pHNeuro2aImageJ

관련 논문