ML385는 ROS/NRF2-자가포식 축 경로를 통해 실리카 유도 폐 선암종 세포의 악성 진행을 약화시킵니다.

폐 선암종은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로, 매년 약 200만 건의 새로운 사례와 176만 건의 사망이 발생합니다¹. 최근 몇 년 동안 담배를 피운 적이 없는 사람들의 폐 선암 발병률이 증가하고 있으며, 이는 대기 오염과 같은 환경 요인과 관련이 있을 수 있습니다². 실리카는 일반적인 환경 오염 물질이며 인간 폐 선암종의 잠재적인 병원성 인자로 확인되었습니다³. 실리카는 지속적인 만성 염증을 일으켜 대식세포, 림프구, 호중구의 침윤, 활성산소종 및 염증 인자의 방출을 유발할 수 있습니다⁴. 이 장기간의 염증성 미세환경은 폐 선암종의 발생을 촉진합니다 ^5,6. 실리카 노출과 폐 선암의 연관성은 확인되었지만, 그 구체적인 분자 기전은 완전히 밝혀지지 않았다.

NFE2L2 유전자에 의해 암호화되는 전사 인자 NRF2는 산화 스트레스에 반응하여 세포 산화환원 항상성을 유지하는 데 주된 조절자로서 중요한 역할을 합니다 ^7,8. 정상적인 상황에서 NRF2는 KEAP1-CUL3 유비퀴틴 리가아제 복합체에 의해 표지되고 분해됩니다. 산화 스트레스 또는 친전자성 물질의 자극으로 KEAP1의 활성이 억제되어 NRF2가 안정적으로 축적되어 핵에 들어가 코어⁹의 방어 및 조절 역할을 발휘합니다. 그럼에도 불구하고, 종양 미세 환경에서 과도한 NRF2 활성화는 ROS 축적을 멈추고 세포사멸 저항성을 강화함으로써 해당작용과 종양 세포의 생존을 향상시킬 수 있습니다^10,11. 연구에 따르면 실리카 노출은 NRF2 신호 전달 경로의 비정상적인 활성화를 초래할 수 있습니다^12,13. 따라서 NRF2를 표적으로 삼는 것은 실리카에 의해 유도된 폐 선암종의 악성 진행에 개입하는 효과적인 전략이 될 수 있습니다¹⁴.

본 연구는 NRF2 억제제 ML385가 ROS/NRF2-자가포식 축 경로를 조절하여 실리카 유발 폐 선암종의 악성 진행을 억제하는지 여부를 밝히는 것을 목표로 합니다. 우리는 질병의 주요 특징을 재현하기 위해 실리카 유도 마우스 모델을 확립하고 대식세포와 종양 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 시험관 내 실험 방법을 사용했습니다. 우리는 실리카가 염증 및 면역 분자의 발현을 유도하고 ROS/NRF2-자가포식 축 경로를 통해 종양 형성을 더욱 촉진한다는 것을 발견했습니다. NRF2 억제제(ML385)를 사용했을 때 종양 형성에 대한 실리카의 촉진 효과가 둔화되어 NRF2 억제제가 실리카 유발 폐 종양 치료에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

모든 기증자 블록은 2016년에서 2018년 사이에 난징 의과대학 부속 화이안 NO.1 인민병원에서 수집된 보관 병리학적 표본에서 얻었습니다. 샘플은 사용하기 전에 비식별화되었으며 승인된 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 난징 의과대학 부속 화이안 제1인민병원 윤리위원회, KY-2024-250-01. 실험용 마우스의 번식, 폐기 및 적용은 실험 동물 관리 규정 및 국제 지침을 엄격히 따릅니다.

실리카 유도 마우스 모델 구축
마우스 및 실리카 현탁액의 준비: 6-8주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 실온이 20-25°C이고 12시간의 밝은 주기/12시간의 암흑 주기가 있는 동물실에서 사육합니다. 실리콘 먼지 현탁액을 제조하기 위해 300mg의 실리콘 먼지 분말을 정확하게 계량하고 멸균 1x 인산염 완충 식염수 10mL에 현탁시켰습니다. 그 후, 혼합물을 5분 동안 격렬하게 소용돌이치고 진동시킨 후 수조 초음파 기계에서 30분 동안 초음파 처리하여 입자의 균일한 분산을 보장하고 응집을 방지했습니다. 이 예비 현탁액의 최종 농도는 30mg/mL입니다. 121°C에서 30분 동안 고압멸균하여 멸균합니다. 매번 사용하기 전에 침전된 입자를 재현탁시키기 위해 2-3분 동안 소용돌이치고 다시 흔들어야 합니다.

쥐는 코를 통해 실리카 현탁액을 흡입했습니다. 마이크로피펫을 사용하여 용액을 마우스의 비강에 천천히 적가적으로 도입했습니다. 마우스를 각 그룹에 20마리의 마우스로 구성된 6개 그룹으로 나누었습니다. 각 그룹의 흡입량은 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL 및 200 μL, 농도는 30 mg/mL, 연속 40일 동안 1일 1회였습니다. 관용할 때는 왼손의 엄지와 검지로 쥐의 귀 뒤의 피부를 잡고, 다른 손가락으로 쥐의 몸통과 꼬리를 고정합니다. 현탁액이 호흡기로 자연스럽게 흡입될 수 있도록 마우스가 머리를 약간 뒤로 기울인 누운 자세에 있는지 확인하십시오. 생쥐에서는 10μL, 30μL, 50μL, 70μL 실리카 현탁액 흡입 2일째 사망 사건이 없었고, 생쥐에서는 90μL, 200μL 실리카 현탁액 흡입 2일째 후 사망 사건이 있었다. 따라서 마우스의 실리카 흡입의 최대 양은 하루 70μL였습니다.

결정질 실리카를 취급할 때는 생물안전 캐비닛이나 흄 후드에서 수행해야 하며, 공정 내내 N95 마스크, 방진 고글, 니트릴 장갑 및 보호복을 착용해야 합니다. 서스펜션을 준비할 때 움직임은 부드러워야 하며 에어로졸 생성을 방지하기 위해 계량 챔버를 사용해야 합니다. 모든 실리카 접촉 폐기물은 천공 방지 기능이 있는 밀봉된 용기에 수집하여 유해 화학 폐기물에 대한 규정에 따라 폐기해야 합니다. 일반 쓰레기와 섞거나 하수구에 버리는 것은 엄격히 금지되어 있습니다. 세포 배양 배지와 같은 생물학적 폐기물은 소독제가 들어 있는 특수 쓰레기통에 수거하고 고압에서 멸균해야 합니다. 동물의 사체와 조직은 생물학적 폐기물 봉투에 넣고 무해한 처리를 위해 고압에서 멸균해야 합니다.

실리카 유도 마우스 모델의 성공을 평가합니다. 실리카 흡입 후 다른 시점, 즉 3일, 14일, 40일에 동물을 평가합니다. 마우스를 전문 동물 안락사 장치에 넣고 이산화탄소를 분당 30%-50% 부피의 충전 속도로 도입했습니다. 그들은 호흡을 멈출 때까지 계속 노출되었습니다. 사망 확인 후 후속 수술이 진행됐다. 폐 조직을 제거했습니다. 폐 조직을 실온에서 48시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 고정했습니다. 고정 후 조직을 그라데이션 알코올로 탈수하고 자일렌으로 투명하게 만든 다음 파라핀에 포획했습니다. 후속 조직학적 염색 및 면역조직화학적 분석을 위해 두께 4-5μm의 파라핀 절편기를 사용하여 연속 절편을 만들었습니다. 폐 조직은 석회질 제거 치료가 필요하지 않습니다. 성공적인 모델 생성을 평가하기 위해 폐 조직의 병리학적 검사를 수행했습니다. 규폐증 모델 구축의 성공 기준은 현저한 폐 염증, 섬유증, 규폐증 결절 발생 등이었다.

실리카 유도 마우스 모델에서 면역 세포 침윤 분석
실리카 흡입 후 14일째 마우스의 폐 조직을 CD3e(1:200 희석비), CD8a(1:200 희석비), CD86(1:200 희석비), F4/80(1:200 희석비) 및 Nk1.1(1:200 희석비)을 포함하는 형광 마커로 염색하여 면역 세포를 시각화했습니다. 세포 또는 조직 절편을 고정하고 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 줄입니다. 차단 항체와 동일한 종 기원의 정상 혈청을 사용하고 PBS로 혈청을 1:10 비율로 희석한 다음 희석된 혈청 100μL를 샘플에 첨가합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 차단하여 혈청이 내인성 항체를 차단할 수 있도록 합니다. 밀봉 후 PBS로 2회 부드럽게 헹굽니다. CD3e (1:200 희석비), CD8a (1:200 희석비), CD86 (1:200 희석비), F4/80 (1:200 희석비) 및 Nk1.1 (1:200 희석비)을 포함하는 1차 항체를 4°C 또는 실온에서 1-2시간 동안 하룻밤 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 형광 2차 항체를 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 배양하였다.

Masson 염색 및 면역조직화학적 분석
파라핀 절편을 자일렌으로 탈랍하고 구배 알코올로 수화시킨 후 pH 6.0의 구연산나트륨 완충액에서 고압 열 정화에 의해 항원 회수를 수행하였다. 고압 열 정화의 경우, 복구 완충액에 담근 조직 조각을 전자레인지에 중불에서 8-12분 동안 넣습니다. 내인성 과산화효소 활성을 3% 과산화수소 용액으로 20분 동안 차단한 후 비특이적 결합 부위를 실온에서 5% BSA로 30분 동안 차단하였다. 1차 항체 NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) 및 VDAC1 (1:500)을 첨가하고 4°C에서 하룻밤 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후, HRP 표지 염소 항토끼 2차 항체(1:500)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 파라핀 절편을 DAB 염색, 헤마톡실린 대계염색, 탈수 투명성 및 중성 겔 밀봉을 실시하여 해당 분자 면역조직화학 결과를 얻었습니다. DAB를 발색에 사용할 때 적당한 발색은 갈색을 띤 노란색에서 갈색을 띤 갈색이어야 하며 배경은 선명해야 합니다. 과도한(짙은 갈색) 및 불충분한(연한 노란색) 발색은 모두 발색 시간을 최적화해야 합니다.

폐섬유증의 정도는 Ashcroft 채점법을 이용하여 반정량적으로 분석하였다.¹⁵: Masson으로 염색된 절편을 100배 확대 현미경으로 관찰하였고, 폐조직을 무작위로 8개 영역으로 나누었다. 각 부위는 섬유증 정도(0-8점)에 따라 점수를 매겼으며, 최종 점수는 모든 부위의 평균입니다: 0점(정상 폐 조직), 1-2점(경증 섬유증), 3-4점(중등도 섬유증), 5-8점(중증 섬유증).

면역조직화학적 결과는 Image 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석되었습니다. 5개의 고배율 필드를 무작위로 선택하고, 단백질 발현 수준의 지표로 각 필드의 평균 광학 밀도 값(MOD)을 측정했습니다.

실리카와 ML385가 RAW264.7 세포의 자가포식 및 ROS에 미치는 영향 조사
RAW264.7 및 A549 세포(Anhui University of Science and Technology에서 제공)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 이중특이성 항체 용액이 보충된 DMEM 고포도당 배지를 사용하여 배양되었습니다. 1 x 10⁷ 세포를 37°C 및 5% CO₂의 항온 인큐베이터에서 균일하게 배양했습니다. 5 μL의 30 mg/mL 실리카 현탁액을 1 x 10⁵ 세포/mL의 RAW264.7 세포에 첨가했습니다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS 3x로 헹구고, 자가포식 및 산화 스트레스를 ROS, LC3 및 리소좀 프로브에 의해 검출하였다. 동시에, NRF2의 억제제인 ML385¹⁶을 사용하여 NRF2의 발현을 억제하였다(ML385의 최종 농도: 5mM/L). 상기 실험 단계에 따라 자가포식과 산화 스트레스를 검출하였다. 두 그룹의 산화 스트레스와 자가포식 흐름을 통계적으로 분석했습니다.

폐 선암종 조직에서 VDAC1, CDK1, p62 및 NRF2 발현의 면역조직화학적 분석
VDAC1, CDK1, p62 및 NRF2의 발현은 30명의 환자에서 확인되었습니다. 폐 선암종이 있는 조직과 인접한 건강한 조직은 난징 의과대학 부속 화이안 NO.1 인민병원에서 채취하여 면역조직화학(IHC)으로 분석하였다. IHC와 폐섬유증의 결과를 통계적으로 분석하였다. 병원 시스템의 환자 정보에 따라 환자 데이터를 수집합니다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같습니다. 파라핀 절편을 자일렌으로 탈랍하고 그래디언트 알코올로 수화시킨 후 고압 열 정화에 의해 pH 6.0의 구연산나트륨 완충액에서 항원 정화를 수행했습니다. 내인성 과산화효소 활성을 3% 과산화수소 용액으로 20분 동안 차단한 후 비특이적 결합 부위를 실온에서 5% BSA로 30분 동안 차단하였다. 1차 항체 NRF2(1:200), CDK1(1:400), p62(1:500) 및 VDAC1(1:500)을 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후 HRP 표지 염소 항토끼 2차 항체(1:500)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. DAB 발색, 헤마톡실린 대계염색, 탈수 투명, 중성 잇몸 밀봉. DAB를 발색에 사용할 때 적당한 발색은 갈색을 띤 노란색에서 갈색을 띤 갈색이어야 하며 배경은 선명해야 합니다. 과도한(짙은 갈색) 및 불충분한(연한 노란색) 발색은 모두 발색 시간을 최적화해야 합니다.

세포 이동 및 침습 분석
실리카와 RAW264.7 세포의 공동 배양에서 나온 ML385 및 상청액이 폐 선암종 세포주 A549와 함께 배양된 후 세포 이동 및 침윤에 미치는 영향을 연구했습니다. 실리카와 24시간 동안 공동 배양된 RAW264.7 세포의 상청액을 A549 세포에 첨가하였다. 세포를 실리카군, 실리카+ML385군, PBS군으로 나누었다. 실리카 그룹: 5μL의 30 mg/mL 실리카 현탁액을 RAW264.7 세포의 1 x 10⁵ 세포/mL에 첨가했습니다. 24시간 동안 배양한 후, 나중에 사용하기 위해 세포 상청액을 제거합니다. 실리카+ML385 그룹: 5μL의 30mg/mL 실리카 현탁액과 5mM/L ML385의 최종 농도를 RAW264.7 세포의 1 x 10⁵ 세포/mL에 첨가했습니다. 24시간 동안 배양한 후, 나중에 사용하기 위해 세포 상청액을 제거합니다. PBS 그룹: 5 μL의 PBS를 RAW264.7 세포의 1 x 10⁵ 세포/mL에 첨가했습니다. 24시간 동안 배양한 후, 나중에 사용하기 위해 세포 상청액을 제거합니다. 스크래치 분석 동안 A549 세포는 먼저 웰당 5 x 10⁵ 의 밀도로 12웰 플레이트에 파종되었습니다. 세포가 95%-100% 융합으로 성장한 후, 200μL 멸균 피펫의 팁을 사용하여 단층 세포에 스크래치를 만들었습니다. 박리된 세포를 PBS로 부드럽게 씻어냈습니다. 이어서, 7일간의 실험 기간 동안 세포 생존력을 유지하기 위해 1% FBS 염기성 배지와 각 처리군의 상청액을 포함하도록 배양 조건을 변경하였다. 스크래치 후 각각 0시간(0일)과 7일째(7일)에 도립현미경으로 동일한 위치의 이미지를 수집하였다. 마지막으로 스크래치 부위를 정량적으로 분석하고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 스크래치 봉합률을 계산하여 서로 다른 치료군의 상청액이 A549 세포의 이동 능력에 미치는 영향을 평가했습니다.

특정 크기의 기공을 통과하는 세포에서 침범 분석에서는 8μm 폴리카보네이트 멤브레인 챔버를 사용했으며, 상부 챔버 멤브레인은 기저막 장벽을 구축하기 위해 1:8의 비율로 희석된 세포외 환경을 시뮬레이션하는 젤로 사전 코팅되었습니다. A549 세포를 무혈청 배지와 각 처리군의 상청액을 1:1 비율로 혼합하여 만든 현탁액에 재현탁한 후 상부 챔버(챔버당 2 x 10⁴ 개 세포)에 접종하였다. 하부 챔버에는 FBS가 20% 함유된 배지와 해당 처리군(실리카+ML385군, 실리카군, PBS군)의 상청액을 동일한 비율로 혼합하여 만든 용액을 화학적 유인제로 첨가하였다. 해당 치료군의 상청액은 실리카의 RAW264.7 세포 식균작용에서 피펫 건을 통한 흡입에 의해 수집되었습니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 에서 7일 동안 연속 배양한 후, 면봉으로 상부 챔버의 비침습성 세포를 제거하고, 막을 관통하여 하부 챔버에 도달한 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다. 마지막으로, 침윤성 세포의 수는 광학 현미경으로 5개의 시야에서 무작위로 선택되었습니다.

유세포 분석을 이용한 실리카와 ML385가 A549 세포의 세포사멸에 미치는 영향 분석
세포 준비 및 그룹화: 각 처리군(PBS군, 실리카군, 실리카+ML385군)의 상청액으로 처리한 A549 세포를 수집하였다. 세포를 예냉된 PBS로 2회 부드럽게 세척한 다음 1x 결합 완충액에 재현탁하고 세포 밀도를 튜브/100μL당 1 x 10⁶ 세포로 조정했습니다. 그런 다음 5μL의 Annexin V-FITC 및 5μL의 PI 염색액을 세포 현탁액에 첨가하고 부드럽게 소용돌이치게 혼합한 후 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 배양 후, 400μL의 1x 결합 완충액을 각 튜브에 첨가하고 즉시 기계에서 테스트했습니다. 유세포분석기를 사용하여 검출을 수행하였다. 488nm 레이저에 의해 여기된 Annexin V-FITC의 형광 신호는 FITC 채널을 통해 수집되었고 PI의 형광 신호는 PE 채널을 통해 수집되었습니다. 실험 전에는 스펙트럼 중첩을 제거하기 위해 형광 보상 조정을 위해 단일 염색 샘플을 사용했습니다. 데이터 분석을 수행할 때 먼저 FSC-A/SSC-A 산점도에서 표적 세포 집단을 묘사하고 단편을 제거합니다. 그 후, FSC-H/FSC-A 산점도를 사용하여 세포 부착을 배제했습니다. 마지막으로 살아있는 세포, 초기 세포사멸 세포, 후기 세포사멸/괴사 세포 및 기계적으로 손상된 세포를 구별하기 위해 게이트를 설정했습니다. 데이터는 FlowJo V10 소프트웨어를 사용하여 획득 및 분석되었습니다.

실리카 마우스 모델
그림 1에서 마우스에게 연속 40일 동안 30mg/mL 및 70μL의 용량으로 실리카를 비강내 투여한 결과, 마우스에서 사망 사건이 발생하지 않았고 실리카 마우스 모델이 성공적으로 확립될 수 있었습니다. 한편, PBS를 사용한 마우스 위관술을 음성 대조군으로 사용했습니다. 목표는 작업과 용매 자체의 영향을 제거하고 표현형이 실리카에 의해 특이적으로 유도되도록 하는 것이었습니다. 이 실리카 유발 폐 손상 모델의 성공적인 복제는 악성 진행 및 약물 개입의 메커니즘에 대한 후속 연구에 필요한 생체 내 기반을 제공합니다.

실리카 유도 마우스의 결절에서 면역 세포 침윤 분석
도 2에서는 실리카 마우스의 결절에서 면역 세포 침윤을 검출하여 결절에 다수의 면역 세포 침윤(CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ 및 Nk1.1+ 세포)이 실리카 폐 질환의 형성 및 발병에 관여하는 것으로 나타났습니다. 이는 실리카가 종양 발생 및 발달의 핵심 촉진 인자이자 ROS/NRF2 경로의 참여에 대한 병태생리학적 기초인 지속적인 염증성 종양 미세 환경을 유도한다는 것을 나타냅니다.

생쥐에서 실리카 유발 폐 섬유증과 NRF2, CDK1 및 VDAC1의 관계
결절에서의 면역 분자의 발현을 검출한 결과, NRF2 (ML385 억제 표적), CDK1 (세포 주기 관련), VDAC1 (미토콘드리아 산화 스트레스에 관여)이 결절 주변과 내부에서 고발현되어 폐 섬유증과 관련이 있는 것을 알 수 있었다(그림 3).

실리카와 ML385가 RAW264.7 세포의 자가포식 및 ROS에 미치는 영향
실리카와 RAW264.7 세포의 공동 배양을 통해 실리카가 자가포식체 생성을 유도할 수 있음을 발견했습니다. 배양 24시간 후, 자가포식체와 리소좀의 공동 국소화가 감소하고 자가포식 흐름이 억제되었으며 ROS의 생산도 감소했습니다. ML385(NRF2 억제제)를 첨가하면 자가포식체와 리소좀의 공동 국소화가 증강되고, 자가포식 흐름도 증강되었으며, 그에 따라 ROS도 증가하였다(그림 4).

IHC에 의한 폐 선암종 조직에서 VDAC1, CDK1, p62 및 NRF2 발현 분석
도 5에 나타낸 바와 같이, NRF2(ML385의 억제 표적), CDK1(세포 주기와 관련됨), VDAC1(미토콘드리아 산화 스트레스에 관여함) 및 p62(자가포식에 관여)는 폐 선암종 조직에서 고발현되어 인접 조직에 비해 유의한 차이를 나타낸다.

실리카와 RAW264.7 세포의 공동 배양에서 ML385 및 상청액이 A549 세포 이동 및 침윤에 미치는 영향
실리카 및 RAW264.7 세포 배양 상청액은 A549 세포의 이동 및 증식을 촉진할 수 있는 반면, ML385는 이러한 과정을 크게 억제할 수 있습니다( 그림 6 참조). 이 결과는 실리카에 의해 유도된 대식세포 미세 환경의 종양 촉진 효과가 NRF2 경로에 의존한다는 것을 나타냅니다. NRF2 를 억제하면 이러한 종양 촉진 효과를 효과적으로 차단하여 종양 세포의 악성 진행을 줄일 수 있습니다.

실리카와 ML385가 A549 세포의 세포사멸에 미치는 영향
그림 7 은 실리카와 RAW264.7 세포 배양 상청액이 A549 세포 세포사멸에 일정한 억제 효과가 있고 ML385가 A549 세포 세포사멸을 촉진할 수 있음을 보여줍니다.

이 연구는 실리카 노출이 생 체 내 및 시험관 내 방법을 모두 사용하여 ROS/NRF2/자가포식 축을 통해 폐 선암종의 악성 진행을 촉진하는 기계적 경로를 밝혔습니다. 동물 실험을 통해 NRF2 신호 전달 경로의 핵심 분자가 실리카에 의해 유도된 폐 섬유증의 미세 환경에서 유의하게 활성화되는 것으로 확인되었습니다. 세포 실험에서 실리카가 대식세포의 자가포식 플럭스를 직접 억제하고 ROS 수준을 감소시키는 것으로 입증되었으며, 이 효과는 NRF2 억제제 ML385에 의해 특이적으로 역전될 수 있습니다. 기전 연구에 따르면 실리카 처리된 대식세포는 분비 인자를 통해 폐 선암종 세포의 이동, 침습 및 세포사멸 억제를 촉진하며, 이러한 종양 촉진 효과는 NRF2 경로의 활성화에 전적으로 의존합니다.

데이터 가용성:
이 기사의 결론을 뒷받침하는 데이터 세트는 기사에 포함되어 있습니다.

그림 1: 생쥐의 실리카 모델 구성. (A) 다른 부피(10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL 및 200 μL)의 실리카(30 mg/mL)를 비강 흡입하여 마우스를 치료합니다. 흡입 용량당 20마리의 마우스. (B) 마우스 생존 곡선. 최대 흡입량은 70μL/일입니다. (C) 실리카군 및 PBS군 마우스에서 3일, 14일, 40일에 폐 조직병리학적 HE 염색 관찰 결과. (D) 저배율, t-테스트, ***p <0.001, p= 0.004, t =10.61(14일), p =0.0006, t =10.02(40일)에서 마우스에서 관찰된 폐 결절 수의 통계 결과. N =9입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 형광 염색을 통한 마우스의 결절 조직에서 면역 세포 침윤 관찰. 마우스의 실리카 유도 폐 결절에서 면역 세포(CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ 및 NK1.1+)의 높은 침윤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 면역조직화학(IHC) 및 Masson 염색을 통한 NRF2, CDK1, VDAC1 및 실리카 유도 섬유증의 발현 사이의 관계를 분석합니다. (A) NRF2, CDK1 및 VDAC1 의 발현 및 Masson 염색 결과. (B) IHC 결과. (C) 폐섬유증의 통계적 분석은 실리카군과 PBS군 생쥐 사이에서 수행하였다. t-검정, ***p <0.001, p =0.0002, t =13.42(NRF2), p=0.0008, t =9.247(CDK1), p =0.0009, t =8.944(VDAC1), p =0.0003, t =11.76(폐 섬유증). N =9입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: RAW264.7 세포의 자가포식에 대한 실리카의 효과 및 NRF2 억제제 ML385의 자가포식 조절 효과. (A) 실리카를 RAW264.7 세포와 24시간 동안 공동 배양한 후, 자가포식체(LC3)와 리소좀의 공동 국소화가 감소했습니다(녹색). 그러나 ML385를 추가하면 자가포식체와 리소좀의 공동 국소화가 증가했습니다(노란색). (B) 실리카를 RAW264.7 세포와 24시간 동안 공동 배양한 후, 실리카군에 의해 생성된 ROS는 감소하였으나 ML385를 첨가한 후 증가하였다. (C) 두 그룹의 ROS 및 자가포식 플럭스에 대한 통계 분석, t-테스트, ***p <0.001, p =0.0005, t =10.59(ROS), p <0.0001, t =17.08(자가포식소좀). N =6입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 인간 폐 선암종 조직에서 VDAC1, CDK1, p62 및 NRF2 발현의 면역조직화학적 분석. (A) 인간 폐 선암종 조직과 인접한 비암성 조직 사이의 차등 발현(VDAC1, CDK1, p62 및 NRF2). (B) 난징 의과대학 부속 화이안 NO.1 인민병원의 암 30건과 인접 비암 조직 간의 차등 발현에 대한 통계 분석, t-테스트, ***p <0.001, p <0.0001, t =8.322(CDK1), p <0.0001, t =16.4(NRF2), p <0.0001, t =15.47(p62), p <0.0001, t =17.75(VDAC1). N =30입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. (C) 폐 선암종 조직 및 인접한 비암성 조직의 섬유증에 대한 통계 분석, t-테스트, ***p <0.001, p =0.0009, t =8.854(섬유증). N =30입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 폐 선암종 세포주 A549와 함께 배양한 후 세포 이동 및 침윤에 대한 실리카와 RAW264.7 세포의 공동 배양에서 ML385 및 상청액의 효과. (A) 세포 스크래치 결과는 상청액 및 ML385를 A549 세포와 공동 배양한 후 0일 및 7일에 나타납니다. (B) 상청액 및 ML385를 A549 세포와 공동 배양한 후 7일째에 세포 침습 결과. (C) 세포 스크래치 분석 결과에 대한 통계 분석을 수행합니다. *p <0.05, **p <0.01. t-테스트, p =0.0020, t =22.43(실리카+ML385 대 실리카), p =0.0135, t =8.510(실리카+ML385 대 PBS), p =0.0143, t =8.281(실리카 대 PBS). N =6입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. (D) 세포 침습 분석 결과에 대한 통계 분석을 수행합니다. *p <0.05, **p <0.01, t-테스트, p =0.0097, t =10.06(실리카+ML385 대 실리카), p =0.0472, t =4.437(실리카+ML385 대 PBS), p =0.0125, t =8.857(실리카 대 PBS). N =6입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 유세포 분석을 통한 실리카 및 ML385가 A549 세포의 세포사멸에 미치는 영향 분석. (A) 유세포 분석을 통해 A549 세포의 세포사멸 결과를 검출합니다. (B) 세포사멸 세포의 비율에 대한 통계 분석을 수행합니다. *p <0.05, **p <0.01, t-테스트, p =0.0013, t =27.29(실리카+ML385 대 실리카), p =0.0022, t =6.973(실리카+ML385 대 PBS), p =0.0048, t =5.649(실리카 대 PBS). N =6입니다. 오차 막대는 표준 오차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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