방법 논문

항바이러스 스크리닝을 위한 알파바이러스 감염의 정량적 형광 이미징

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DOI:

10.3791/69384

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2026년 8월 14일

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 논문에서는 알파바이러스(alphavirus) 감염을 지속적으로 시각화할 수 있는 강력하고 적응력 높은 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 이미징을 기반으로 세포 수준에서 알파바이러스의 복제를 조사하고 항바이러스 화합물의 효능을 평가하는 접근 방식을 제공합니다.

초록

형광 현미경 검사는 세포 수준에서 알파바이러스 감염을 조사하기 위한 매우 민감하고 다각적인 접근 방식을 제공합니다. 형광 표지된 바이러스를 정량적 이미지 분석과 결합함으로써, 이 방법은 복제 역학의 미세한 차이와 세포 간 전파를 포함한 감염 역학의 상세한 공간적 및 시간적 특성 분석을 가능하게 합니다. 본 프로토콜의 핵심 목적은 항바이러스 스크리닝 분석에 이를 적용하는 것입니다. 형광 강도의 이미지 기반 정량화는 항바이러스 화합물의 효능을 평가하는 강력하고 재현 가능한 수단을 제공하여, 감염된 세포에서 억제 효과를 조기에 민감하게 감지할 수 있게 합니다. 이는 유망한 항바이러스 후보 물질의 식별을 용이하게 하며 용량 의존적 반응의 평가를 지원합니다. 또한, 복제 행동 및 확산 패턴의 변이가 쉽게 드러나기 때문에 서로 다른 알파바이러스 균주나 돌연변이체의 비교 연구에도 매우 적합합니다. 유연성, 다양한 세포주와의 호환성, 자동화된 이미징 플랫폼으로의 간단한 통합 덕분에 이 방법은 확장 가능하며 고처리량 스크리닝 캠페인에 적합합니다. 종합적으로, 본 프로토콜은 항바이러스 전략의 발견과 평가를 발전시킵니다. 여러 알파바이러스가 심각한 인체 및 수의학적 질병을 일으키고, 승인된 항바이러스 치료제가 없으며, 신종 발생과 함께 지리적으로 계속 확장되고 있다는 점을 고려할 때, 새로운 항바이러스제 식별은 여전히 시급한 우선순위입니다. 따라서 이 형광 기반 워크플로우는 현대 알파바이러스 연구에 가치 있고 시의적절한 기여를 합니다.

서론

알파바이러스(Alphaviruses)는 Togaviridae과에 속하는 외막이 있는 양성 가닥 단일 가닥 리보핵산(RNA) 바이러스입니다1,2,3. 이들은 주로 모기를 통해 전파되며 인간과 동물에게 다양한 질병을 유발합니다. 알파바이러스 속에는 치쿤구니야 바이러스(CHIKV), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스와 같이 의학적으로 중요한 여러 바이러스가 포함됩니다4,5. 이러한 병원체는 발열성 질환 및 발진부터 심각한 신경계 합병증에 이르는 증상을 일으킵니다6. 우려스럽게도, CHIKV는 주요 공중 보건 문제로 다시 부상했습니다. 2025년 초부터만 14개국에서 220,000건 이상의 사례가 보고되었으며, 최소 80명의 사망자가 발생했습니다7. 치사율은 낮지만, 감염자의 상당수가 만성 관절통을 겪으며 이는 장기적인 장애와 이동성 저하로 이어질 수 있습니다8. 표적 항바이러스 전략을 개발하기 위해서는 알파바이러스의 복제와 숙주-병원체 상호작용에 대한 보다 포괄적인 이해가 필수적입니다. 한편, 세믈리키 포레스트 바이러스(SFV)와 같은 일부 알파바이러스는 더 독성이 강한 알파바이러스와 유전적 및 구조적 유사성이 높음에도 불구하고 인간에게는 낮은 병원성을 보입니다. 이로 인해 SFV는 인간의 건강에 높은 위험을 초래하지 않으면서 알파바이러스를 연구하기 위한 이상적인 모델이 됩니다9,10,11.

플라크 분석(plaque assay), 50% 조직 배양 감염량(TCID50) 분석, 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR) 분석과 같은 전통적인 분석법은 바이러스 역량과 유전자 발현을 정량화하는 데 유용하지만, 종말점 측정(endpoint measurement)에 국한되며 세포 용해 또는 고정이 필요하다는 한계가 있습니다. 그 결과, 동일한 세포 내에서 시간에 따른 감염 역학을 직접적으로 포착할 수 없습니다12,13. 이러한 한계를 극복하기 위해, 실시간 형광 이미징은 여러 시점에 걸쳐 감염 키네틱스를 모니터링할 수 있는 강력한 비파괴적 접근 방식을 제공합니다. mCherry가 표지된 SFV와 같이 형광 표지된 바이러스를 사용하면 살아있는 세포 내에서 리포터 바이러스 신호와 확산 양상을 직접 시각화하고 정량화할 수 있습니다14,15. 본 실험에서는 아르보바이러스 연구에서 흔히 사용되는 세포주를 이용하였습니다. Aedes albopictus 유충에서 유래한 U4.4 세포는 많은 아르보바이러스의 효율적인 복제를 지원하는 모기 세포로, 매개체-바이러스 상호작용 연구를 용이하게 합니다16,17. 이와 병행하여, 새끼 햄스터 신장 조직에서 유래한 섬유아세포 유사 포유류 세포주인 BHK-21 세포는 바이러스 증식 및 분자 바이러스학 분석에 빈번하게 사용되는 허용성 척추동물 숙주 시스템을 제공합니다18.

본 프로토콜에서는 푸린(furin) 억제제를 예시로 하여, 바이러스 리포터 발현 모니터링 및 항바이러스 화합물의 특성 분석 방법을 상세히 설명합니다. 푸린은 많은 진핵생물에서 발견되는 프로단백질 전환효소(proprotein convertase)로, 성장 인자, 호르몬, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases), 혈장 단백질 및 수용체의 전구체를 활성화하는 데 핵심적인 역할을 합니다.19,20많은 알파바이러스는 표면 단백질을 절단하고 활성화하기 위해 푸린(furin)을 이용하며, 이는 성공적인 복제를 위한 핵심 단계입니다.20Furin 억제제는 furin 활성을 차단하도록 합성 설계된 화합물이며, 이를 통해 바이러스 복제 억제21,22,23셀 이미징 멀티모드 리더를 이용한 알파바이러스 감염의 자동 형광 현미경 분석 표준 프로토콜의 가용성이 제한적임을 고려하여, aedine 세포에서 항바이러스 화합물의 특성을 분석하기 위한 상세한 워크플로우를 제공한다. 본 프로토콜은 세포 배양, 바이러스 생성, 감염, 항바이러스 화합물(푸린 억제제) 처리, 형광 이미징 및 이미지 분석 단계를 개략적으로 설명한다. 다만, 여기에 기술된 방법들은 다른 바이러스나 대체 형광 표지에 맞게 쉽게 조정하여 적용할 수 있다.

프로토콜

1. 생물 안전성

참고: 본 프로토콜에서 사용된 재조합 mCherry 태그 Semliki Forest 바이러스(SFV-mCherry)는 유전자 변형된 것입니다24,25,26. 형광 리포터 유전자의 도입으로 인해 이는 유전자 변형 생물체(GMO)로 분류되며, 이에 따라 추가적인 격리 및 규제 요건이 적용됩니다. 다른 알파바이러스, 특히 CHIKV와 같이 병원성이 더 강한 바이러스를 다루는 작업에는 추가적인 격리 시설과 허가가 필요할 수 있습니다.

  1. 바이러스 분석 전후에 적절한 소독제로 생물안전작업대(biosafety cabinet)를 세척하고 최소 30분 동안 UV를 조사하십시오.
  2. 모든 오염 물질은 지역 생물안전 규정에 따라 폐기하십시오. 고체 및 액체 폐기물은 오토클레이브 가능한 용기에 각각 분리하여 수집하고, 폐기 전 오토클레이브 멸균 처리를 하십시오.

2. 항바이러스 화합물 준비

참고: 본 연구에 사용된 Furin 억제제인 MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) 및 MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide)는 테스트를 위해 선정된 항바이러스 화합물의 예시입니다. Furin 억제제 MI-1148은 세포독성 분석에서는 음성 대조군으로, 항바이러스 분석에서는 양성 대조군으로 사용되었습니다.

  1. 항바이러스 화합물을 적절한 용매에 용해합니다. 세포 독성 효과를 방지하기 위해 가능한 경우 멸균수를 사용하십시오. 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) 또는 메탄올은 최대 2% (v/v)까지 사용할 수 있습니다. 멸균수 내 10 mM 농도의 스톡 용액을 사용하는 것이 권장됩니다.
  2. 제조업체에서 별도로 지정하지 않은 한, 안정성과 용해도를 고려하여 스톡 용액을 -20 °C에서 보관하십시오.

3. 세포 배양

  1. 10% fetal bovine serum (FBS), 1% MEM non-essential amino acids, 1% tryptose phosphate broth, 1% glutamine, 및 1% penicillin/streptomycin (Pen/Strep)이 첨가된 Leibovitz's L-15 Medium에서 U4.4 세포를 배양한다 (접종 밀도: T25 플라스크당 약 1 × 106 cells, 배양 부피: 5 mL). 세포를 28 °C에서 유지한다. U4.4 세포를 일주일에 한 번 1:6 비율로 계대 배양하되, 실험적 필요에 따라 접종 밀도를 조정한다.
    참고: C6/36 세포와 같은 추가 세포주 또한 이 프로토콜과 호환 가능하다. 적절한 대체 배지 및 보충제를 사용할 수 있다. 항생제 포함 여부는 선택 사항이며 생략 가능하다.
  2. 10% FBS, 1% glutamine  또는 figure-protocol-1‑alanyl‑figure-protocol-2‑glutamine, 및 1% Pen/Strep이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium에서 Baby hamster kidney (BHK-21) 세포를 배양한다 (접종 밀도: T75 플라스크당 약 1 × 106 cells, 배양 부피: 10 mL). 5% CO2가 포함된 습윤 인큐베이터에서 세포를 37 °C로 유지한다. 4-5일마다 세포를 1:12 비율로 계대 배양하며, 필요에 따라 접종 밀도를 유연하게 수정한다.
  3. 세포가 건강한 상태를 유지하고 활발하게 증식하는지 확인한다.

4. 바이러스 생산

  1. BHK-21 세포 내 SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) 스톡 준비.
    1. BHK-21 세포를 배양합니다 (파종 밀도: 약 1 × 105 웰당 세포 수, 배양 부피: 500 µL)를 위에서 설명한 조건 하에 투명 세포 배양 24-웰 플레이트에서 배양합니다.
    2. 약 90%의 합류도(목표 합류도: 약 2 × 105 세포), 감염 배지(1% Pen/Strep 및 0.2% bovine serum albumin이 첨가된 DMEM)에서 transfection 시약을 사용하여 BHK-21 세포에 SFV6-2SG-mCherry 플라스미드를 transfection합니다. 따라서, 희석하여 1 µL 내의 형질전환 시약의 25 µL 저혈청 배지의.
    3. 별도의 튜브에서 희석하십시오. 0.5 µg 플라스미드 DNA 및 1 µL ~에 포함된 독자적인 첨가제의 25 µL 저농도 혈청 배지의. 희석된 DNA 용액을 다음의 곳에 추가하십시오. 희석된 transfection 시약이 포함된 용액 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 다음을 첨가합니다. 50 µL 결과적으로 형성된 복합체를 세포에 처리합니다.
      참고: 특정 세포주와 호환된다면 다른 트랜스펙션 시약을 사용할 수 있으며, 사용하는 시약에 따라 지침이 달라질 수 있습니다.
    4. 형질전환 48시간 후에 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 상층액을 수집하고, 이를 분주합니다. 250 µL DNA/RNA free 튜브당, -에서 보관하십시오.80 °C.
  2. TCID를 이용한 적정50 분석법
    1. BHK-21 세포를 배양합니다(파종 밀도: 약 2 × 104 웰당 세포 수, 배양 부피: 100 µL) 위에서 설명한 조건하에 검은색 이미징용 96-웰 플레이트에 넣습니다.
    2. 바이러스 분주액을 해동하고, 감염 배지에서 바이러스 샘플의 10배 연속 희석액을 준비합니다.15 µL 바이러스 샘플 + 135 µL 감염 배지), 기존 배지를 폐기하고, 및 추가하십시오 100 µL 희석액을 세포에 처리합니다.
    3. 세포를 다음 조건에서 1시간 동안 배양하십시오. 37 °C 5% CO2가 포함된 습윤 배양기 내에서₂ 그리고 접종균을 다음으로 교체하십시오. 100 µL 그 후 신선한 감염 배지로 교체합니다.
    4. 감염 후 48시간(hpi)에 멀티모드 이미징 웰 플레이트 리더(섹션 7에 상세 설명)를 사용하여 형광 측정으로 바이러스 복제 정도를 평가하고, 바이러스 감염으로 인한 세포병성 효과를 판정하십시오. TCID를 계산하십시오.50 Reed-Muench 방법에 기반한 값28 그리고 1 TCID₅₀가 특정 수치의 PFU/mL에 해당한다는 표준 포아송 근사법(Poisson-based approximation)을 사용하여 추정 바이러스 역가(PFU/mL)로 변환합니다.50 0.7 PFU에 해당합니다.

5. 세포독성 결정

  1. 위에 설명한 조건에서 투명한 세포 배양용 96-well plate에 U4.4 세포를 배양한다(파종 밀도: 약 3 × 104 cells/well, 배양 부피: 100 µL).
    참고: 증발 증가를 포함한 가장자리 효과를 방지하기 위해 외곽 웰(A행 및 H행, 1열 및 12열)에도 세포를 파종하였으나 실험 분석에서는 제외하였다.
  2. 세포 밀도가 90%에 도달했을 때(목표 밀도: 약 6 × 104 cells), 총 부피 100 µL 내에서 100, 50, 25, 12.5 µM 농도의 furin 억제제 MI-1130 및 MI-1131로 세포를 처리한다. 음성 대조군으로 MI-1148(MI-1130 및 MI-1131과 동일한 농도), 무처리 세포, 물 처리 세포를 추가하고, 세포 독성에 대한 양성 대조군으로 ionomycin(어세이 내 100 µM)을 추가한다.
  3. 처리 48시간 후(hpt), ATP 정량 기반의 발광 어세이를 사용하여 세포 생존율을 평가한다. 각 웰에 발광 어세이 시약을 배양액과 동일한 부피로 추가하고(배양액 대비 1:1), 플레이트를 2분간 흔들어 세포 용해를 유도한 후, 암소에서 10분간 배양하고 발광도를 측정한다.
    참고: 다른 검출 원리에 기반한 기타 세포 생존율 어세이도 사용할 수 있다.
  4. 멀티모드 리더를 사용하여 검은색 또는 흰색 96-well plate에서 발광도를 기록한다.

6. 바이러스 감염 및 항바이러스 화합물을 이용한 처리

  1. 위에서 설명한 조건에 따라 검은색 이미징 등급 96-well 플레이트에 U4.4 세포(파종 밀도: 약 3 × 104 cells/well, 배양 부피: 100 µL)를 배양합니다.
    참고: 증발 증가를 포함한 가장자리 효과를 방지하기 위해 외곽 웰(A 및 H행, 1 및 12열)에도 세포를 파종하였으나 실험 분석에서는 제외하였습니다.
  2. 보충제가 첨가되지 않은 L-15 배지에서 접종 부피 100 µL를 사용하여 SFV-mCherry를 감염 다중도(MOI) 0.01로 세포(목표 합류도: 약 6 × 104 cells)에 감염시키고, 28 °C에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 특히 매우 낮은 MOI 및 며칠에 걸친 감염 실험을 수행할 때는 저계대 리포터 바이러스 스톡만을 사용해야 합니다.
  3. 보충제가 첨가된 L-15 배지를 사용하여 별도의 96-well V-bottom 플레이트에 furin 억제제인 MI-1130, MI-1131 및 MI-1148을 최종 농도  100, 50, 25 및 12.5 µM로 희석합니다. 10%의 여유분을 고려하여 웰당 110 µL를 준비하고, 세포에 100 µL(최종 부피)를 옮깁니다. 대조군의 경우, 항바이러스 화합물의 용매로 처리한 감염 세포와 바이러스만 포함된 감염 세포를 음성 대조군으로 사용합니다. 배경 형광을 측정하기 위해 감염되지 않고 처리되지 않은 세포도 추가해야 합니다.
  4. 1시간의 감염 기간 후, 접종액을 제거하고 V-bottom 플레이트에서 희석된 furin 억제제 100 µL를 검은색 이미징 등급 플레이트로 옮깁니다.
  5. 세포를 28 °C에서 배양합니다.

7. 살아있는 세포 형광 이미징, 정량적 이미지 분석 및 데이터 제시

  1. 형광 현미경을 이용한 바이러스 리포터 발현 측정(프로그램 설정은 Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 및 Supplementary Figure 7 참조).
    1. 감염 후 24시간 및 48시간(hpi)에, 웰당 8 µL의 세포 투과성 핵 대조 염색 용액을 첨가하여 세포 핵을 염색한다. 28 °C에서 30분 동안 배양한다.
      참고: 감염 상태는 여러 시점에서 모니터링할 수 있다. 하지만 감염 후 48시간에서의 측정값이 가장 강한 신호를 제공하며(Supplementary Figure 8 참조), 항바이러스 효과를 가장 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 24시간 또는 그 중간 시점에서의 판독도 가능하지만, 48시간 이상 배양을 연장하면 세포 과성장 위험이 증가한다. 판독을 위해 선택한 시점까지 세포가 과성장하지 않도록 실험 시작 시 적절한 세포 합류도(confluency)를 선택한다. 이를 통해 정확한 세포 수 계산이 방해받는 것을 방지할 수 있다.
    2. 배양 후(투명 커버 리드 외에), 안전을 위해 플레이트 상단을 덮는 투명 뷰 씰 포일을 추가한다.
      참고: 이미징 장치를 사용할 때는 올바른 플레이트 유형을 선택하는 것이 필수적이다. 조명, 적분 시간 및 게인(gain) 설정은 리포터 유전자에 따라 달라진다. 최적의 파라미터를 결정하기 위해 예비 측정을 수행하는 것을 강력히 권장한다. 주어진 조건에서 프로토콜을 수립하기 위해 사용된 초기 조명, 적분 및 게인 설정은 프로그램 설정이 상세히 설명된 Supplementary Figure 2에 제공되어 있다.
    3. 멀티모드 리더를 사용하여 이미지 스티칭(웰당 4개 필드, 4배 배율)을 통해 웰 전체 이미지를 획득한다.
    4. Texas Red 필터 큐브( excitation: 586/15 nm; emission: 647/57 nm)를 사용하여 적색 형광 강도를 측정한다.
    5. 다음 설정(excitation: 377/50 nm; emission: 447/60 nm)의 DAPI 채널을 사용하여 총 세포 수를 결정한다.
  2. 정량적 이미지 분석(원천 데이터는 Supplementary Table 1 참조).
    참고: 형광 측정에는 마이크로플레이트 이미징 리더가 사용되었다. 본 분석에 사용된 상세 파라미터는 Supplementary Figure 2에서 확인할 수 있다.
    1. 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리한다.
    2. 데이터 리덕션 패널에서 'Image Stitching to DAPI and Texas Red channels'를 선택하여 웰로부터 단일 이미지를 생성한다.
    3. 'Image Statistics'를 추가하고 Texas Red Stitched 채널의 'Total intensity'를 선택한다. 'Image Preprocessing'을 적용하여 DAPI Stitched 채널의 배경 노이즈를 제거한다.
    4. 전처리된 DAPI Stitched 채널에 대해 'Cellular Analysis'를 실행한다.
    5. 각 처리 웰의 평균 형광에서 감염되지 않은 무처리 대조군 웰의 평균 형광을 뺀 후, 그 결과를 해당 웰의 총 세포 수로 나누어 세포당 평균 적색 형광 강도를 계산한다.
  3. 트러블슈팅
    1. 측정 중, 특히 장시간 이미징 측정 시나 온도 민감성 플레이트를 사용할 때 초점 안정성을 모니터링한다.
    2. 초점 드리프트가 관찰되면 오토포커스(autofocus)를 활성화하고 오토포커스 빈도를 높인다. 드리프트가 지속되면 획득 속도를 줄이거나 이미징 전에 플레이트를 기기 온도에 평형화시킨다.
    3. 이미징 전용 플레이트를 사용하여 획득하는 동안 일관된 신호 품질을 보장한다. 과도한 조명과 긴 적분 시간을 피하여 블리드스루(bleed-through)와 과노출을 방지한다.
    4. 신호 포화가 방지될 때까지 들뜸(excitation) 강도를 낮추거나, 적분 시간을 단축하거나, 게인을 줄인다. 형광체 채널이 잘 분리되었는지 확인하고 필요에 따라 필터 설정을 조정한다.
      참고: DAPI와 mCherry 사이의 블리드스루는 일반적으로 낮으나, 사용된 리포터 구조체(예: GFP)에 따라 달라질 수 있다.
    5. 적절한 감염 역학 및 분석 민감도를 유지하기 위해 세포의 과합류(over-confluency)를 피한다. 과합류가 발생하면 측정 전 배양 시간을 줄인다.
    6. 특히 고농도에서 세포 생존율 및 신호 품질에 미치는 염료 관련 영향을 모니터링한다. 염료 관련 독성이나 과포화된 배경이 관찰되면 염료 농도를 낮추거나 배양 시간을 단축한다.
    7. 신호 안정성을 유지하기 위해 제조사 권장 사항에 따라 염료를 조제하고 보관한다.

결과

본 연구에서는 멀티웰 플레이트 형식의 형광 현미경을 사용하여 알파바이러스(alphavirus)의 확산을 모니터링하고 항바이러스 화합물(예: 푸린 억제제)을 평가하는 상세 프로토콜을 제시합니다. 바이러스 리포터 발현에 대한 억제 효과의 시각화를 입증하기 위해, 이전에 합성된 세 가지 푸린 억제제인 MI-1148, MI-1130, MI-1131을 선정하여 aedine 세포주인 U4.4에서 테스트하였습니다. 실험 워크플로우의 개요는 그림 1에 설명되어 있습니다.

항바이러스 효능을 평가하기 전에, 바이러스 복제의 감소가 화합물에 의한 세포 사멸 때문이 아님을 보장하기 위해 세포 독성을 평가하는 것이 필수적입니다. 따라서 U4.4 세포가 90% 합류도(confluency)에 도달했을 때 100, 50, 25 또는 12.5 µM 농도의 억제제를 처리하였습니다. 처리하지 않은 세포와 물(용매 대조군)을 처리한 세포를 음성 대조군으로 사용하였으며, ionomycin을 양성 대조군으로 사용하였습니다. 세포 생존율은 처리 48시간 후 ATP 정량 기반의 발광 분석법을 사용하여 평가하였습니다. 테스트한 furin 억제제들의 경우, 세포 생존율의 유의미한 감소는 관찰되지 않았습니다(그림 2).

세포 독성이 나타나지 않음에 따라, 해당 화합물들의 항바이러스 활성을 후속 평가하였다. 이를 위해 U4.4 세포를 SFV-mCherry로 1시간 동안 감염시킨 후, 동일한 농도의 furin 억제제를 처리하였다. 감염 후 처리하지 않은 세포와 감염 후 물을 처리한 세포는 항바이러스 활성의 음성 대조군으로 사용하였으며, 감염되지 않고 처리하지 않은 세포는 배경 형광을 평가하는 데 사용하였다. 처리 48시간 후, 형광 현미경을 통해 바이러스 리포터 발현량을 정량화하였다. 이미징 전에 각 웰에 세포 투과성 핵 대조 염색액 8 µL를 첨가하고 30분 동안 배양하여 세포핵을 염색하였다. 처리된 형광 이미지로부터 바이러스 리포터 발현에 해당하는 적색 형광 신호와 전체 핵 수를 정량화하였다. 테스트한 억제제 중 MI-1148은 강력한 항바이러스 활성을 보였으며, 농도 의존적으로 바이러스 리포터 발현을 유의미하게 감소시켰다(그림 3). 반면, MI-1130과 MI-1131은 테스트한 모든 농도에서 바이러스 리포터 발현에 대해 관찰 가능한 억제 효과를 보이지 않았다. 항바이러스 분석의 원시 데이터와 분석 결과는 부록 표 1에 제공되어 있다.

대표적인 결과는 MI-1148에서 관찰된 리포터 신호의 강력한 감소를 통해, 본 프로토콜이 항바이러스 활성을 가진 화합물을 신뢰성 있게 식별함을 보여줍니다. 이와 대조적으로, 억제제 MI-1130 및 MI-1131은 리포터 발현을 감소시키지 않았으며, 이는 피코몰(picomolar) 수준의 억제 상수로 나타나는 강력한 furin 억제 능력이 해당 조건에서는 항바이러스 활성으로 이어지지 않았음을 나타냅니다(그림 4). 이러한 결과는 활성 화합물을 비활성 화합물과 구별하고, 강력하고 유의미한 리드 구조의 식별을 지원하는 본 분석법의 능력을 강조합니다.

항바이러스 스크리닝 과정; 세포 배양, 바이러스 감염, 화합물 처리; 데이터 분석 차트.
그림 1: 실험 워크플로. aedine 세포주 U4.4에서 furin 억제제의 항바이러스 활성을 평가하는 데 사용된 실험 절차의 개략도. 워크플로는 화합물 준비, 세포 파종, mCherry 태그가 붙은 Semliki Forest virus 감염, 화합물 처리, 실시간 시각화를 위한 형광 현미경 관찰, 그리고 바이러스 리포터 발현의 정량화를 포함한다. 이 삽화는 BioRender로 제작되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 생존율 막대 그래프, 약물 농도 비교; MI-1148, MI-1130, MI-1131 처리.
그림 2: U4.4 세포에서 furin 억제제의 세포 독성 효과. 세포 밀도가 약 90%에 도달했을 때, U4.4 세포에 100, 50, 25, 12.5 µM 농도의 MI-1148, MI-1130 및 MI-1131을 처리하였다. 처리하지 않은 세포와 물을 처리한 세포를 음성 대조군으로 사용하였으며, ionomycin (100 µM)을 양성 대조군으로 사용하였다. 처리 48시간 후, ATP 정량을 통해 세포 생존율을 평가하였다. 데이터는 처리하지 않은 대조군을 기준으로 정규화하여 백분율(%)로 표시하였다. 평균 세포 생존율(n=3)을 나타내며, 오차 막대는 변동 계수를 나타낸다. 점선은 80%로 설정된 세포 독성 컷오프(cut-off)를 나타낸다. n.d. = 검출되지 않음. 데이터 표현은 GraphPad Prism v9.5.1을 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

약물 농도 대비 세포 적색 강도의 막대 그래프; MI 시리즈 화합물의 통계 분석.
그림 3: aedine 세포주 U4.4에서 mCherry 표지 Semliki Forest 바이러스(SFV)에 대한 furin 억제제의 항바이러스 활성. 약 90%의 합류도(confluency)에서, 세포를 SFV-mCherry로 1h 동안 감염시킨 후, MI-1148, MI-1130 및 MI-1131을 100, 50, 25, 12.5 µM 농도로 처리하였다. 처리 48h 후에 형광 현미경을 통해 바이러스 리포터 발현량을 정량화하였다. 이미징 전에 각 웰에 8 µL의 세포 투과성 핵 대조 염색액을 첨가하고 30min 동안 배양하여 세포 핵을 염색하였다. 형광 이미지는 바이러스 신호를 위해 Texas Red 필터를, 핵을 위해 DAPI 필터를 사용하여 획득하였다. 이미지 분석을 수행하여 총 적색 형광 강도(바이러스 복제 표시)와 웰당 총 세포 수를 정량화하였다. 데이터(n = 4)는 세포당 총 적색 강도(총 바이러스 신호 / 총 세포 수)로 표시되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 및 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용하여 SFV 감염 대조군과 비교한 통계적 유의성: **** = P<0.0001; ns = P>0.05. 데이터 표현 및 통계 분석은 GraphPad Prism v9.5.1로 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다양한 농도에서 SFV에 감염된 세포 배양물의 현미경 이미지로, 감염 수준을 보여줌.
그림 4: aedine 세포주 U4.4에서 mCherry 표지 Semliki Forest virus (SFV)에 대한 furin 억제제의 항바이러스 활성을 보여주는 대표 형광 이미지. 약 90%의 합류도(confluency)를 보이는 세포를 SFV-mCherry로 1 h 동안 감염시킨 후, 100, 50, 25, 12.5 µM 농도의 MI-1148, MI-1130 및 MI-1131로 처리하였다. 감염 후 처리하지 않은 세포와 감염 후 물을 처리한 세포를 음성 대조군으로 사용하였으며, 감염되지 않고 처리하지 않은 세포를 배경 대조군으로 포함하였다. 리포터 신호는 처리 48 h 후에 Texas Red 필터를 사용하여 mCherry 신호를 포착하는 형광 현미경으로 평가하였다. 스케일 바 = 2000 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 바이러스 신호의 총 강도 및 세포 수의 원시 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더에서 사용된 절차 단계. 먼저, U4.4 세포의 배양 조건과 일치하는 온도 설정(빨간색)을 수행합니다. 그다음, DAPI, Texas Red 및 Brightfield 측정을 위한 세 가지 독립적인 이미지 작업 단계(주황색)를 진행합니다. 여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

보충 그림 2: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더의 절차 단계에서 사용된 이미지 설정. 가장 먼저 수정해야 할 설정은 배율(4x)과 이미지 크기(Full WFOV)입니다. 측정할 형광체를 선택해야 하며, 조명(Illumination), 적분 시간(Integration time) 및 게인(Gain) 파라미터를 그에 맞게 수정해야 합니다. 마지막으로, 이미지 몽타주(2x2)와 오버랩(30 µm x 30 µm)을 선택해야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더에서 사용된 데이터 감소 단계. 첫 번째 단계는 DAPI 및 Texas Red 채널에 대한 이미지 스티칭(파란색)입니다. 두 번째로, 이미지 통계(보라색)를 통해 총 강도 측정값을 얻습니다. 그 다음, DAPI 채널에서 배경 노이즈를 제거하기 위해 이미지 전처리 단계(초록색)가 필요합니다. 마지막으로, 전처리된 DAPI 스티칭 이미지에 대해 세포 분석(노란색)을 수행합니다. 여기에서 이 파일을 다운로드하십시오.

부록 그림 4: 대표 결과물을 위해 이미징 리더에 사용된 데이터 리덕션 단계의 이미지 스티칭. 가장 중요한 설정은 최종 이미지의 다운사이징(80%)이며, 이 값이 더 낮아질 경우 이미지 해상도에 영향을 주어 결과적으로 파라미터의 최종 측정값에 영향을 미치기 때문입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 5: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더에 적용된 데이터 감소 단계의 이미지 통계. 올바른 채널(Stitched: Fluorophore)을 선택하고, 최소 임계값(2500)을 설정한 후, 최종적으로 측정할 파라미터(Total Intensity)를 선택하는 것이 중요합니다. 더 정확한 측정을 위해 Image Plug를 제작할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 6: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더(imaging reader)에 적용된 데이터 감소 단계의 이미지 전처리 과정. 가장 중요한 설정은 롤링 볼(rolling ball) 파라미터(30 µm)이며, 이는 세밀한 결과 도출을 우선시한 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 7: 대표 결과 도출을 위해 이미징 리더에 사용된 데이터 감소 단계의 세포 분석. 이미지 전처리가 완료된 채널을 선택하는 것이 중요합니다. 접촉된 객체를 분리하고 마스크로 구멍을 채우도록 선택하십시오. 객체 선택 범위(5-50 µm)를 정확하게 설정하는 것이 매우 중요합니다. 마지막으로, 정교한 결과를 얻기 위해 이미지 플러그를 생성할 수 있습니다. 여기를 클릭하여 이 파일을 다운로드하십시오.

보충 그림 8: aedine 세포주 U4.4에서 mCherry 표지 Semliki Forest 바이러스(SFV)에 대한 furin 억제제의 항바이러스 활성. 세포 밀도가 약 90%에 도달했을 때, SFV-mCherry를 1시간 동안 감염시킨 후, MI-1148, MI-1130 및 MI-1131을 100, 50, 25, 12.5 µM 농도로 처리하였다. 처리 후 24시간(빨간색 막대) 및 48시간(초록색 막대) 시점에서 형광 현미경을 통해 바이러스 리포터 발현량을 정량화하였다. 오차 막대는 표준 편차(n = 4)를 나타낸다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

알파바이러스 복제를 실시간으로 관찰할 수 있는 능력은 기존의 엔드포인트 테스트에 대해 순차적이고 누적적인 관점을 제공합니다. 이 다중 시간대 살아있는 세포 이미징 프로토콜은 바이러스 확산을 관찰하기 위한 동적인 플랫폼을 제공하므로 알파바이러스 연구에 유용한 모델이 됩니다.

이 프로토콜의 성공은 여러 매개변수에 달려 있습니다. 우선, 세포 사멸로 인한 위양성 결과를 배제하기 위해 항바이러스 분석 전 화합물의 세포독성을 평가하는 것이 중요합니다. 세포독성 효과에 대한 평가가 완료되면, 이후 화합물의 항바이러스 활성을 평가할 수 있습니다. 테스트 화합물들의 경우 세포독성이 관찰되지 않았습니다. MI-1130과 MI-1131은 바이러스 리포터 발현에 유의미한 영향을 미치지 않은 반면, 양성 대조군으로 사용된 MI-1148은 이를 효과적으로 억제했습니다. 또한, 세포 파종과 관련하여 감염 시점을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 세포가 과성장하지 않으면서도 재현 가능한 감염이 이루어질 수 있도록 적절한 합일도(confluency)에 도달해야 합니다. 세포 생존력을 저하시키지 않으면서 점진적인 감염을 관찰하기 위해, 세포주에 따라 감염 다중도(multiplicity of infection)를 최적화하는 것도 중요합니다. 마지막으로, 급격한 변화 없이 바이러스 리포터의 점진적인 발현을 시각화할 수 있도록 이미지 획득 빈도를 신중하게 결정해야 합니다. 대부분의 응용 분야에서는 예를 들어 8시간마다 이미지를 획득하는 것이 시간적 세부 사항과 시료의 무결성 사이에서 효과적인 균형을 제공합니다.

본 프로토콜의 주요 장점은 적응성이 뛰어나다는 점입니다. 이 실험에서는 SFV-mCherry와 U4.4 세포를 사용하여 푸린(furin) 억제제 처리 후 바이러스 리포터 발현의 모니터링 및 억제 효과를 입증하였습니다. 하지만 본 프로토콜은 GFP와 같은 다른 리포터 마커를 가진 대체 바이러스의 형광 분석뿐만 아니라, 일차 세포 및 분화된 세포주를 포함한 다른 숙주 세포 유형에 맞게 최적화될 수 있습니다. 본 프로토콜은 감염 후 화합물 처리에 집중하고 있으나, 항바이러스 작용 기전을 추가로 탐구하기 위해 전처리, 병행 처리, 감염 직후 처리 또는 지연 처리 등 투여 시점 실험(time-of-addition experiments)에 맞게 워크플로를 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기에 C6/36 및 U4.4 세포의 RNAi 기전의 기능성을 비교하는 데 사용되었습니다14. 이후 바이러스를 직접 표적으로 하는 dsRNA가 바이러스 리포터 발현을 어떻게 억제하는지 조사하는 연구로 확장되었습니다15.

본 프로토콜을 사용하는 동안 발생할 수 있는 잠재적인 문제점들이 있습니다. 리포터 바이러스는 in vivo29 및 in vitro30의 수많은 응용 분야에서 매우 유용하지만, 병원성이 낮게 나타나거나31 리포터 유전자의 유전적 불안정성32이 나타날 수 있습니다. 세포가 과도하게 밀집되어 발생하는 세포 탈착은 명확한 시각화와 이미징을 방해하여 세포 수 측정에 영향을 줄 수 있습니다. 살아있는 세포 염색약(예: 핵 염색을 위한 Hoechst 33342)에 장시간 노출되면 세포의 거동이나 생존율이 변할 수 있습니다15. 또한, CHIKV와 같이 병원성이 높은 알파바이러스를 사용하는 실험의 경우, 더 높은 생물안전 등급의 조치와 그에 따른 프로토콜 조정이 필요할 수 있습니다. 아울러, 플레이트의 가변성이나 서로 다른 플레이트 사용으로 인해 일부 사례에서 초점 드리프트(focus drift)가 관찰될 수 있습니다. 예를 들어, 투명 세포 배양 플레이트에서는 형광 신호가 웰에서 인접한 웰로 번질 수 있으며, 흰색 플레이트는 과노출을 유발할 수 있습니다. 두 경우 모두 형광 신호 측정의 정확도에 영향을 미치게 됩니다.

이 프로토콜은 기존의 바이러스 분석법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 플라크 분석(plaque assay)과 TCID50 분석은 바이러스 역가에 대한 엔드포인트 데이터를 제공합니다12. 또한, qPCR은 바이러스 RNA를 민감하게 검출할 수 있지만, 복제 능력이 있는 바이러스와 비감염성 바이러스 입자 또는 잔류 핵산을 구분할 수 없습니다. 반면, 이러한 방식의 형광 라이브 이미징은 동일한 세포 집단 내에서 시간에 따른 바이러스의 진행, 확산 및 치료 효과를 비침습적으로 연속 측정할 수 있게 합니다.

본 프로토콜은 항바이러스 화합물로서의 furin 억제제 검토 외에도 다른 응용 분야에 맞게 조정될 수 있습니다. 특히 항바이러스 약물 스크리닝에 매우 적합하여, 다양한 화합물에 대한 용량 의존적 반응의 정량화를 가능하게 합니다. 또한 바이러스 침입, 복제 및 확산의 시점과 위치를 포함하여 숙주-병원체 상호작용을 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다. 리포터 바이러스, 서로 다른 균주 또는 서로 다른 alphaviruses 간의 비교 연구에도 사용할 수 있습니다. 아울러 siRNA 또는 dsRNA를 이용한 유전자 녹다운과 같은 접근 방식과 결합할 수 있습니다. 따라서 이 시스템은 바이러스 복제를 위한 핵심 표적 및 항바이러스 화합물을 식별하고 검증하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다만, 이 형광 기반 분석법은 단독 확정 방법이 아닌 초기 스크리닝 접근법이므로, 스크리닝 결과를 입증하기 위해서는 야생형 바이러스를 이용한 분석을 포함한 추가 조사가 필요할 것입니다.

공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없습니다.

감사의 글

pCMV-SFV6-2SG-mCherry를 제공해주신 에스토니아 타르투 대학교의 Andres Merits 교수님과 독일 뮌헨 공과대학교의 Andreas Pichlmair 교수님께 감사드립니다. C6/36 세포를 제공해주신 독일 하노버 수의과대학교의 Stefanie Becker 교수님께 감사드립니다. 퓨린 억제제를 제공해주신 독일 마르부르크 대학교의 Torsten Steinmetzer 교수님께 감사드립니다. 본 연구는 펀딩 코드 LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52의 LOEWE 중개 생물다양성 유전체학 센터(LOEWE-TBG)를 통한 헤센주 고등교육 연구예술부의 과학 경제적 우수성 개발을 위한 주 정부 공세(Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz) 프로그램과 BMFTR (ASCRIBE 프로젝트-그랜트 번호 01KI2024)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민 분획 V, pH 7.0SERVA 전기영동11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
BHK-21 세포CLS Cell Lines Service GmbH, 독일 에펠하임603126
세포 배양 플라스크, 50 mL, 25 cm2, PS, 적색 필터 스크류 캡, 투명, CELLSTAR, TC, 멸균Greiner Bio-One690175
세포 배양 마이크로플레이트, 24웰, PS, F-바닥, (침니 웰), 투명, CELLSTAR, TC, 응축 방지 링 포함 덮개, 멸균Greiner Bio-One662160
세포 배양 마이크로플레이트, 96-웰, PS, F-바닥, (침니 웰) µ투명, 검정, CELLSTAR, TC, 응결 방지 링이 있는 뚜껑, 멸균Greiner Bio-One655090
세포 배양 마이크로플레이트, 96웰, PS, F-바닥, (침니 웰), 투명, CELLSTAR, TC, 응축 링이 있는 뚜껑, 멸균Greiner Bio-One655180
세포 배양 마이크로플레이트, 96웰, PS, V-바닥, 투명Greiner Bio-One651101
세포 스크레이퍼VWR734-2602
CellTiter-Glo 발광 세포 생존능 분석법PromegaG7573
Cytation 5 세포 이미징 멀티모드 리더Biotek
DAPI 필터 큐브 1225100Biotekex: 377/50 nm; em 447/60 nm
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
소태아혈청Fisher Scientific11550356
퓨린 억제제 MI-1130본 연구
퓨린 억제제 MI-1131본 연구
퓨린 억제제 MI-1148Hardes 외. 2015.  제공해주신 링크는 외부 논문 주소(DOI)입니다. 번역하실 구체적인 텍스트 내용을 입력해 주시면, 요청하신 지침에 따라 전문적인 학술 한국어로 정확하게 번역해 드리겠습니다. 
Gen5 Prime 소프트웨어Biotek
이오노마이신 칼슘염, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Leibovitz L-15 배지, GlutaMAX 보충제 Thermo Fisher Scientific31415029
Lipofectamine 3000 형질전환 시약Thermo Fisher ScientificL3000001
MEM 비필수 아미노산 (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
마이크로플레이트, PS, 96웰, F-바닥, (침니 웰), 블랙, Fluotrac, 중간 결합력Greiner Bio-One655076
NucBlue Live ReadyProbes 시약 (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryAndres Merits 교수(에스토니아 타르투 대학교) 및 Andreas Pichlmair 교수(독일 뮌헨 공과대학교)
Texas Red 필터 큐브 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
트립토스 인산염 배지 Thermo Fisher Scientific18050039
U4.4 세포Friedrich-Loeffler-Institute, 연방동물보건연구소, 독일 그라이프스발트
Viewseal Sealer, ClearGreiner Bio-One676070

참고문헌

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