숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 마우스 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

Summary

이 프로토콜은 2D에서 성장된 쥐 전립선 오가노이드 기반 모델 생성을 설명합니다. 이 과정에는 오가노이드 해리, 세포 시딩, 분화, 상피 완전성 평가, 그리고 요로병원성 대장균에 의한 시험관 내 감염이 포함됩니다. 이 모델은 끝부분 접근성을 제공하며 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합하여 전통적인 3D 오르가노이드 시스템의 한계를 극복합니다.

Abstract

노인 남성은 양성 전립선 비대증, 전립선염, 전립선암과 같은 전립선 질환에 크게 영향을 받습니다. 이 두 질환들은 전 세계 건강 부담에 크게 기여하며 남성 질병의 주요 원인입니다. 오르가노이드 모델은 상피 구조와 기능의 핵심 특징을 시험관 내에서 복제할 수 있게 하여 질병 모델링을 혁신했습니다. 그러나 오가노이드의 폐쇄 내면 구조는 첨단 표면에 대한 실험적 접근을 제한하여 숙주-병원체 상호작용 연구를 방해합니다. 이러한 도전을 극복하기 위해, 우리는 생쥐 전립선 오르가노이드에서 유래한 세포를 2차원(2D) 모델로 시딩하는 생리학적으로 중요한 배양 시스템을 생성했습니다. 이 방법은 필수적인 상피 특성을 유지하면서도 꼭대기 표면에 직접 접근할 수 있게 합니다. 이 단계별 프로토콜은 성숙한 마우스 전립선 오가노이드의 해리와 세포 부착, 증식 및 분화를 지원하는 최적의 씨앗 조건을 설명합니다. 면역형광 현미경 검사는 오가노이드 기반 모델에서 전립선 특이적 마커의 발현을 확인했으며, 전립선 조직의 세포 조직을 정확하게 나타내는 것을 입증했습니다. TEER 측정과 F-액틴, 타이트 조결 염색은 세포 분화 및 장벽 형성을 더욱 확인했습니다. 이 모델을 요로병원성 대 장균 (UPEC)에 감염시킨 결과, 숙주-병원체 상호작용 조사에 유용성이 입증되었습니다. 이 모델은 전립선 상피 생물학과 질병 기전을 조사하는 데 유용한 플랫폼을 제공하며, 숙주-병원체 상호작용 연구와 잠재적 치료 전략 평가에 특히 적합합니다.

Introduction

전립선은 방광 아래에 위치하며 요도를 둘러싸는 작은 기관입니다. 이 기관은 남성 생식기관의 필수 기관이며, 주요 기능은 전립선액을 생성하는 것입니다. 이 액체는 정액 혈장의 최대 30%를 차지하며, 정자가 여성 생식기를 통과하는 동안 영양을 공급하고 보호하는 데 핵심적인 역할을^합니다. 전립선염, 양성 전립선 비대증식, 전립선암과 같은 전립선 질환은 매우 흔하며 전 세계 의료 서비스에 상당한 부담을 줍니다 2,3,4,5. 양성 전립선 비대증과 전립선암 연구가 광범위하게 이루어지고 있지만, 전립선염, 특히 세균성 전립선염은 비교적 연구가 부족한 상태입니다. 전립선염은 전 세계 남성의 최대 16%에 영향을 ^미치며, 세균 감염이 전체 약 10%를 차지합니다. 세균성 전립선염은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. 대장균(E. coli) 균주, 특히 요로병원성 대장균(UPEC)은 세균성 전립선염의 주요 원인입니다 ^8,9.

전립선 감염의 분자 기전에 대한 연구는 생리학적으로 중요한 시험관 내 모델이 부족해 여전히 제한적입니다. 전립선 질환에 관한 대부분의 연구는 전통적으로 세포주나 동물 모델에 의존해 왔습니다. 특히, LNCaP 또는 RWPE-1과 같은 암성 또는 형질전환 세포주는 전립선 질환과 치료 반응을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔습니다 10,11,12,13. 하지만 이 모델들은 세포 구성과 건강하거나 암성 전립선 상피의 복잡성이 부족합니다. 더욱이, 많은 연구들이 주로 마우스 모델로 동물 모델을 활용해 전립선 감염, 면역 반응, 전립선 종양 성장, 전이에 관한 다양한 가설을 연구했습니다.^{14, 15, 16, 17}. 이 모델들은 지금까지 가장 발전되고 유익했지만, 대체로 윤리적 문제를 제기하고 상당한 시간과 자원이 필요하며 비용이 많이 들 수 있습니다. 또는 체외 조직 이식과 1차 세포 배양도 약물 또는 암 발생에 대한 조직 반응에 대한 단기 연구에 사용된 사례가 있습니다 18,19,20. 하지만 이러한 모델들은 수명이 제한적이며, 신선한 인간 조직의 가용성은 종종 제한적입니다.

성체 줄기세포에서 유래한 3차원(3D) 오가노이드 배양은 시험관 내 상피 조직 모델링에 유망한 대안으로 떠올랐습니다. 기존 세포주와 달리 오가노이드는 원래 상피의 핵심 특징인 세포 이질성, 조직 특이적 구조, 기능적 특성 21,22,23을 유지합니다. 1차 세포 배양이나 체외 추출과 달리, 오가노이드 배양은 오랜 시간에 걸쳐 증식하고 통과할 수 있으며 노화되지 않습니다. 이러한 특성들은 오가노이드 시스템을 생리학적으로 중요한 맥락에서 질병 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 특히 적합합니다. 전립선 오가노이드는 건강한 인간 조직과 암 조직, 그리고 마우스 모델에서 생성되었으며, 주로 전립선암 연구에 사용되었습니다 24,25,26. 그럼에도 불구하고, 감염 연구에서는 오가노이드의 3D 구조가 큰 도전 과제를 제시하는데, 주로 하강 세포 표면에 대한 접근이 제한적이라는 점입니다. 전통적으로 온전한 3D 오가노이드는 병원체를 미세주입하거나, 먼저 오가노이드를 조각 또는 단일 세포로 분리한 후^병원체와 함께 배양하는 방식으로 감염되었다. 여기서 크기와 3D 구조의 변동성이 재현성과 처리량에 영향을 미칠 수 있습니다. 대안으로, 꼭대기 아웃 오가노이드는 루멘 접근 불가의 한계를 극복하는 방법을 제공합니다. 초저부착 조직 배양판이나 비접착성 계면활성제로 코팅된 표면에서 유탁 상태에서 오가노이드를 배양하면 오가노이드 극성이 반전됩니다. 그 결과 끝부분이 바깥쪽을 향해 병원체 감염 연구를 직접 접근할 수 있게 됩니다^27,28. 그러나 이러한 배양은 장기간 유지할 수 없으며, 오가노이드 크기와 세포 수의 변동성은 감염 다수성(MOI) 판정을 복잡하게 만듭니다. 또한, 극성 역전의 기전과 그것이 오가노이드 세포에 미치는 영향에 대한 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 시험관 감염 모델로서 오가노이드의 한계를 극복하기 위, 장, 폐 등 장기에서 유래한 오가노이드를 이용한 원단 접근 가능한 오가노이드 모델이 개발^{되었습니다.} 이러한 시스템은 주요 상피 특징을 보존하고, 조작, 영상 촬영, 병원체 및/또는 약물에 대한 통제 노출을 용이하게 합니다. 그러나 세포 분화를 가능하게 하는 배양 조건이 오가노이드 배양에서 2D 배양 모델로 항상 적용되는 것은 아닙니다^31,32.

여기서는 마우스 전립선 오가노이드를 이용해 끝부분에 접근 가능한 전립선 상피 모델을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 이전에 우리 연구실에서 개발 및 검증되었으며, 그곳에서 원주민 전립선 조직과 매우 유사하고 UPEC³²가 관련된 감염 생물학 연구에 적합함을 입증했습니다. 이 시스템은 전립선 상피의 세포 구성과 극성을 매우 잘 모방하면서도 실험적 조작을 위한 접근성을 향상시킵니다. 더 나아가, 우리는 전립선 내 숙주-병원체 상호작용 연구에 적용 가능함을 입증하여, 기존 세포주나 3D 오가노이드 모델보다 생 체 내 모델 보다 더 다루기 쉬운 대안이자 생리학적으로 더 중요한 시스템을 제공합니다.

Protocol

윤리적 진술: 모든 동물 시술은 뷔르츠부르크 대학교의 동물 관리 및 사용 지침을 준수했으며, 관련 기관 및 정부 규정에 따라 승인되었습니다. 이 연구에는 우리 연구소에서 독립적인 목적으로 다른 연구그룹에 의해 안락사된 WT 마우스만 사용되었습니다. 이 작업을 위해 특별히 희생된 동물은 없었으며, 3R 원칙(대체, 감축, 정제)에 따라 이루어졌습니다.

참고: 여기 제시된 프로토콜은 저자³²가 발표한 이전 연구를 기반으로 합니다. 여기에 설명된 모든 단계는 해당 무균 기법과 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 멸균 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다. C57BL/6 마우스에서 생쥐 전립선 오가노이드가 생성되어 3D 배양에서 유지되었으며, 앞서 설명한 대로^25,26. 3R 원칙을 따르기 위해, 동물 시설은 다른 이유로 희생된 미치료된 순진한 백화성 생쥐(최소 6개월 된 쥐)에서 생쥐 전립선을 기증했습니다. 간단히 말해, 콜라겐제와 TrypLE Express 효소를 사용해 쥐 전립선을 두 단계로 다지고 소화했습니다. 그 후 세포를 세포외기질(ECM) 방울에 시딩하여 3D 오가노이드를 생성했습니다. 배양지를 배양지에 추가하고 3일마다 보충했습니다. 3D 오가노이드 배양은 주 1회 통과되었으며, 3번 통로부터 2D 씨앗에 사용되었습니다. 현재 프로토콜에 따라 1주일 된 마우스 전립선 오가노이드를 사용해 오르가노이드 기반 모델을 2D 표면에 시딩하였습니다. 이 프로토콜에서는 조직 배양 플레이트에 ECM 단백질을 코팅할 필요가 없습니다.

1. 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

1. 3차원 오가노이드 분리
   1. 24웰 플레이트에서 원하는 수의 3D 오가노이드 웰에서 매질을 흡입합니다. 우물당 500 μL adDMEM/F12++로 대체하세요( 재료표 참조).
   2. P1000 피펫을 사용해 ECM 드롭을 기계적으로 방해하세요. 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 모으세요. 튜브당 최대 두 개의 우물만 채취하세요.
   3. adDMEM/F12++를 최대 10mL까지 보충하세요. 튜브를 부드럽게 3-4번 뒤집어 섞으세요. 450 x g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 가열합니다.
2. 단일 세포로의 3D 오가노이드 파괴
   1. 상정액을 흡인하세요. 펠릿을 2mL의 예열(37 °C) TrypLE Express 효소에 10 μM RHOKi를 보충하여 재현탁합니다.
   2. 37°C의 물욕에서 15분간 배양하세요. P1000 피펫을 사용해 5분마다 셀 현탁액을 혼합하세요.
      참고: 4배 대물렌즈를 사용해 세포 부탁액을 확인하여 세포가 대부분 단일 세포인지 확인하세요. 2-3개의 세포 단위로 작은 덩어리가 있으면 괜찮습니다. 일반적으로 15분의 배양이 충분하지만, 필요하면 더 연장할 수 있습니다.
   3. adDMEM/F12+/+ 10mL를 보충하세요. 튜브를 부드럽게 3-4번 뒤집어 섞으세요. 450 x g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 가열합니다.
3. 단셀 현탁 도금
   1. 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 상정액을 흡인하세요. 세포 펠릿을 10 μM RHOKi(1.1.1단계에서 사용된 3D 오가노이드 웰당 300 μL 배양 배양지)를 보충한 배양 배양지에 재현탁합니다.
      참고: 배양액은 다음과 같은 성분으로 구성되어 있습니다: Advance Dulbecco's 변형 이글 배지/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1m N-아세틸시스테인, 10% 노긴 조절 배지, 10% R-스폰딘 1개 조절 배지, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-디하이드로테스토스테론(DHT), 0.2 μM TGFβi, 100 ng·^mL-1 프리모신( 재료표 참조). 감염 실험을 위해서는 프리모신 없이 배양지를 사용하세요.
   2. 노이바우어 계수 챔버를 사용해 현탁액 내 셀 수를 세세요.
   3. 세포 현탁액을 10 μM RHOKi를 보충한 배양 배양액에서 62,500 세포·^mL-1의 농도로 희석합니다. 48웰 플레이트에 씨앗을 위해 웰당 200 μL 세포 현탁액을 사용하세요(제조사에서 조직 배양 처리 , 재료표 참조) 또는 챔버 μ 슬라이드에서는 웰당 300 μL( 재료표 참조). 플레이트를 37°C, 5%_CO2의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
      참고: Step 1.1.1에서 사용된 각 3D 오가노이드 웰. 일반적으로 약 200,000개의 세포를 생산합니다.
   4. 하루가 지나면 대부분의 단일 셀이 2D 표면에 부착됩니다. 배양지는 2-3일마다 교체하세요. 합류 시점은 7일 이내에 도달합니다.
      참고: RHOKi는 초기 시딩에만 추가되고 이후 매체 변경 시에는 첨가되지 않도록 주의하세요.
4. 오가노이드 기반 모델의 차별화.
   참고: 다음 단계를 따라 하루날루 세포가 풍부한 분화된 오가노이드 기반 모델을 얻으세요.
   1. 세포 현탁액에 10 nM DHT를 추가하세요 (단계 1.3.3). 이후 배지 교환(2-3일마다)에는 10 nM DHT를 보충한 배양지를 사용하세요.
      참고: 세포 부탁액에 DHT가 첨가되지 않고(이후 배양지를 변경하면), 오가노이드 기반 모델은 기저 세포로 농축됩니다.

2. 초상피 전기 저항(TEER) 측정

1. 62,500 세포·^mL-1 농도로, 300 μL(1.3.3단계에서 획득)을 8웰 PET μ슬라이드에 40개의 전극을 장착해 오가노이드 세포 현탁액을 시딩합니다(재료 표 참조). 세포가 없는 웰 중 하나에 1.3.1에 설명된 300 μL 배양지를 추가합니다.
   참고: 셀 프리 우물은 측정을 위한 빈 공간으로 사용됩니다.
2. μ슬라이드를 임피던스 기반 세포 분석 시스템(재료 표 참조)에 연결하고, 16웰 스테이션을 조직 배양 인큐베이터 안에 배치합니다. TEER를 400Hz에서 7일간 측정하세요. 배양지는 2-3일마다 교체하세요.

3. 면역형광 염색

참고: 이 방법에서는 세포가 챔버형 μ슬라이드(재료 표 참조)에 시딩되어야 하며, 이는 고해상도 현미경 응용과 호환됩니다.

1. 선택한 시점에서 배지를 제거하고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다. 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 상온에서 15분간 고정하세요(빛 노출 피하기).
   주의: 4% 파라포름알데히드는 알레르기 피부 반응, 심각한 눈 손상을 일으킬 수 있으며, 암을 유발할 가능성이 의심됩니다. 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 먼지, 연기, 가스, 안개, 증기 또는 스프레이 흡입을 피하세요. 보호 장갑을 착용하고 오염된 옷은 적절히 오염될 때까지 실험실 내에 보관되도록 하세요. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설을 통해 폐기하세요.
2. 고정 후에는 세포를 1x PBS로 3번(각각 5분씩) 세척하세요. 0.5% Triton X-100( 재료표 참조)으로 실온에서 15분간 투과화합니다.
   주의: Triton X-100은 피부 자극과 심각한 눈 손상을 일으킵니다. 이 식물은 수생 생물에 매우 독성이 강하며 장기적인 영향을 미치며 환경에서 내분비계 교란을 일으킬 수 있습니다. 다룰 때는 보호용 장갑, 눈, 얼굴 보호구를 착용하세요. 내용물과 용기는 승인된 폐기물 처리 시설을 통해 폐기하세요. 환경으로의 방출을 피하세요.
3. 세포를 1x PBS로 두 번(각각 5분씩) 세척하세요. 셀을 차단 버퍼(PBS의 1% BSA, 재료표 참조)로 상온에서 30분간 차단합니다.
4. 1차 항체를 차단 완충제(1% BSA in 1x PBS)에 희석한 후, 4°C에서 흔들기 플랫폼 위에서 세포와 함께 하룻밤 배양합니다. 다음 날에는 실온에서 1시간 부화하세요. (항체 희석에 대해서는 재료표 참조).
   참고: F-액틴을 팔로이딘으로 염색하거나 CellMask로 원형질막을 염색할 경우( 재료표 참조) 3.4단계를 건너뛰세요.
5. 셀을 1x PBS로 3번(각각 5분씩) 세척하세요. 2차 항체인 팔로이딘 또는 CellMask(재료 표 참조)를 차단 버퍼(1% BSA in 1x PBS)에 희석한 후 실온에서 세포와 함께 1시간 배양합니다.
6. 셀을 1x PBS로 3번(각각 5분씩) 세척하세요. 세포를 1x PBS에 희석한 Hoechst( 재료표 참조)와 함께 실온에서 15분간 배양하여 핵을 염색합니다.
7. 세포를 1x PBS로 3번(각각 5분) 세척하고, 세포는 1x PBS로 남기세요. 4°C에서 보관하세요.
8. 챔버 μ 슬라이드(재료 표 참조)를 레이저 주사 공초점 현미경 또는 형광 현미경으로 영상화합니다.
   참고: 개요 이미지는 형광 현미경의 20배 대물렌즈를 사용하여 전체 감염 효율과 분포를 평가할 수 있습니다. 40배 수중 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용해 상피 세포 내에 부착되거나 내화된 개별 박테리아를 시각화하기 위해 고해상도 이미지를 얻었습니다. 형광체는 사용된 형광체에 따라 405, 499, 590, 653 nm 거리의 레이저 라인을 사용해 여기되었습니다. 방출은 Hoechst의 경우 415에서 516 nm, GFP 또는 Alexa 488의 경우 509 nm에서 573 nm, mcherry 또는 Alexa 594의 경우 600 nm에서 651 nm, Alexa 647의 경우 663 nm에서 720 nm로 설정하여 검출되었습니다. Z 스택은 0.5 μm 스텝 크기로 얻어졌으며, 상피층 전체 두께를 덮었습니다. 이미지는 1024 x 1024 픽셀 해상도로 촬영되었으며, 스캔 주파수는 400 Hz, 프레임 평균은 4로 설정되어 우수한 화질을 제공합니다. 레이저 출력과 검출기 이득은 동일한 실험 내 모든 조건에서 일정하게 유지되었습니다. 레이저 출력, 검출기 이득, 스캔 속도, 평균화 등 모든 영상 매개변수는 사용되는 공초점 현미경에 따라 필요에 따라 최적화 및 조정되어야 합니다.

4. 요로병원성 대장균 (UPEC) 균열 감염

참고: 다음 단계에서는 프리모신 없이 7일간 유지되는 오가노이드 기반 모델을 반드시 사용하세요( 재료표 참조).

이 연구에는 플라스미드 pFPV-mCherry에서 mCherry 단백질을 구성적으로 발현하는 요로병원성 대장균 균주인 UTI89(암피실린 내성)가 사용되었습니다.

주의: 감염성 병원체(생물안전 레벨 2)를 다룰 때는 장갑과 적절한 눈 및 얼굴 보호구를 착용하세요. 항상 단추를 완전히 잠긴 실험복을 입으세요. 모든 절차를 인증된 생물학적 안전 캐비닛 내에서 진행하세요. 생물학적 물질을 다룬 후에는 작업면을 소독하고 손을 철저히 씻으세요. BSL-2 폐기물을 오토클레이빙에 적합한 지정된 생물학적 위험 용기에 수집하세요. 폐기물 폐기물 전에는 오토클레이빙 또는 기타 적절한 제염 방법으로 오염을 제거하세요.

1. 감염 실험 3일 전, UPEC 균주를 LB 한천 플레이트에 스트레이핑하고 해당 항생제(이 프로토콜에서는 암피실린 100 μg·^mL-1 사용)를 보충하여 37 °C에서 16-24시간 인큐베이션합니다.
   주의: 일부 항생제는 접촉 시 알레르기 반응이나 자극을 유발할 수 있으며, 부적절하게 버릴 경우 항생제 내성을 유발할 수 있습니다. 항상 생물학적 안전 캐비닛 안에 항생제를 준비하고 추가하며, 적절한 개인 보호 장비(장갑과 안구 보호구)를 착용하세요. 항생제 함유 용액을 승인된 폐기물 처리 시설을 통해 화학 폐기물로 폐기하세요.
2. 감염 실험 이틀 전, 한천 플레이트에서 단일 UPEC 콜로니를 사용해 LB 육수 3mL에 해당 항생제(암피실린 100 μg·^mL-1)를 접종합니다(단계 4.1). 37°C에서 12-16시간 정적으로 배양하세요.
3. 감염 실험 하루 전, 4.2단계의 박테리아 배양물을 소용돌이로 측정하고 OD₆₀₀을 측정합니다. 다음 공식으로 3mL LB 육수를 암피실린(100 μg·^mL-1)으로 접종하여 시작 OD₆₀₀ 0.05에 접종하는 데 필요한 부피를 계산합니다: 부피(μL) = (0.05 * 3,000 μL) / 측정된 OD₆₀₀. 4.2단계에서 계산된 배양 부피를 더합니다. 신선한 LB 육수로 옮겨 37°C에서 24시간 동안 정적으로 배양합니다.
   참고: 4.2단계 오버나이트 배양의 OD₆₀₀ 은 1.7에서 2.2 사이여야 합니다.
4. 감염 당일에는 4.3단계의 박테리아 배양을 소용돌이로 측정하고 OD₆₀₀을 측정합니다. 배양액에서 OD₆₀₀ 1을 수확한 후, 12,000 x g 에서 실온에서 2분간 원심분리합니다. 상정액을 제거하세요.
5. DHT 없이 프리모신 프리 오가노이드 배양지 1mL에 재현탁합니다. MOI 100까지 희석하세요.
   참고: 48웰 플레이트의 각 웰은 7일째에 약 150,000개의 셀을 가진 것으로 간주됩니다. 이 추정치는 감염 전 우물에서 여러 실험을 통해 산출되었습니다. MOI를 정확히 조절하려면 감염 전에 세포 수를 측정하기 위해 한 개의 추가 씨앗을 심는 것이 권장됩니다. 필요한 박테리아 현탁 부피(4.4단계)를 결정하려면, 우물당 세포 수를 MOI로 곱해 우물당 필요한 총 박테리아 수를 얻고, 이 수치를 박테리아 농도(8 × 10⁵ 박테리아/μL)로 나누어 μL 부피를 구합니다.
6. 오가노이드 기반 모델의 배양 배지를 박테리아 함유 배양지로 교체합니다. 배양 표면에 따라 부피를 조절하세요: 48웰 플레이트는 웰당 200 μL, μ 슬라이드에는 300 μL 사용. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C,_CO2 5%에서 1시간 배양합니다.
7. 배양 기간 후, 오가노이드 기반 모델에서 박테리아 함유 배지를 추출합니다. 우물을 adDMEM/F12++로 3번 세척하여 세포외 박테리아를 제거하세요.
8. 세포외 박테리아를 죽이기 위해 50 μg·^mL-1 겐타미신 배양지를 추가합니다. 30분 정도 부화시키세요.
   참고: 겐타미신 농도는 사용되는 박테리아 균주에 따라 조절이 필요할 수 있습니다. 50 μg·^mL-1 이상의 농도를 사용할 경우, 세포 독성 검사가 권장됩니다.
9. 배지를 제거하고 남은 감염 기간 동안 10 μg·^mL-1 겐타마이신을 보충한 신선한 배지로 교체하세요.
   감염된 세포를 형광 염색을 위해 3 절 다음, 유세포측법으로 정량화하기 위해 5절 다음에 처리합니다.

5. 유세포분석을 통한 감염 정량

1. 배양지를 흡인하고 1x PBS로 세포를 3번 세척하세요. 100 μL 트립LE 발현효소를 사용해 세포를 분리하세요. 모든 세포가 분리될 때까지 5-10분간 배양하세요.
   참고: 48웰 플레이트의 우물만으로도 조건에 따라 충분합니다.
2. 셀 현탁액을 수집하여 96웰 플레이트(원뿔형 바닥)의 웰로 옮깁니다. TrypLE Express 효소를 비활성화하기 위해 100 μL 플로우 사이토미터 버퍼(1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA)를 추가합니다.
3. 96웰 플레이트를 450 x g 압력에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 150 μL 유동 세포계 완충액에 재현탁합니다.
4. 유세포계를 사용하여 감염된 세포를 획득하고 정량화하세요(재료 표 참조).
   참고: 유세포분석은 m체리 양성 세포 검출을 위해 488 nm 여기 레이저와 615/20 nm 방출 필터를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 높은 유량(66 μL·min⁻¹)으로 수집되었으며, 샘플당 최소 10,000건의 사건을 수집했으며, 순방향 산란 고도 값이 80,000보다 큰 사건만 포함되었습니다. 감염된 세포는 이물질과 이중선을 제외한 후, mCherry 형광을 기준으로 비감염(순진) 대조군과 비교하여 확인하였다. 생존 지표(예: 프로피듐 요오화물 또는 기타 생/죽음 염색)를 게이팅 전략에 포함시켜 세포 생존 가능성을 평가할 수 있습니다. 이는 세포 해리가 세포에 부정적인 영향을 미치지 않도록 모델을 처음 작업할 때 특히 유용할 수 있습니다.

Results

이 프로토콜은 생쥐 전립선 상피의 오가노이드 기반 모델을 생성하여 천연 조직의 상피 구획의 세포 유형과 전사 발현을 재현하는 과정을 설명합니다. 이 모델은 성체 마우스 전립선 조직에서 생성된 3D 성체 줄기세포 오가노이드를 사용하여 생성됩니다. 이 오가노이드 배양물들은 배양 내에서 유지되며 매주 전달됩니다. 오르가노이드 기반 모델의 경우, 워크플로우의 첫 단계(그림 1A)는 7일 된 3D 오가노이드를 사용하는 것으로 시작됩니다. 이 기간은 이들이 2D 표면에 시딩될 수 있는 적절한 크기와 세포 밀도에 도달하는 데 필요합니다. 통과 후, ECM에 오르가노이드의 작은 조각들(그림 1B, 0일차)을 시딩하여 성장하도록 허용했습니다. 시간이 지나면서 7일째에는 뚜렷한 내부 내강을 가진 크고 구형 구조로 성장합니다(그림 1B). 7일 된 오가노이드를 단일 세포로 해리한 후, 세포들은 3D 오가노이드 배양과 동일한 배양지(1nM DHT)를 사용하여 조직 배양 처리판(그림 1C, 0일차)에 시딩되어 단일층을 형성했습니다. 첫날부터 유착 세포가 증식하기 시작했습니다. 이후 며칠 동안 단일층은 팽창하여 3일차와 5일차 사이에 합류하는 지점에 도달했으며, 이는 밝시야 현미경으로 관찰되었습니다(그림 1C). 시간에 따른 형태학적 변화를 특성화하고 오가노이드 기반 모델이 합류점에 도달하는 시점을 모니터링하기 위해, 우리는 CellMask로 원형질막을 염색하고 여러 시점에서 형광 영상을 수행했습니다(그림 1D).

안드로겐 수용체(AR) 신호 전달은 전립선 세포 분화의 핵심 조절자이며, 오가노이드 배양 배양 내 테스토스테론(또는 DHT) 농도를 조절하면 줄기세포가 기저 또는 하내막 세포로 방향성 분화되는 것으로 나타났기 때문에^, 배양 배양 내 DHT 수치를 조절하여 하강 세포(DHT 10 nM) 또는 기저 세포(DHT 없음) 중 하나의 풍부도를 촉진하도록 했습니다. 통제; 방법1, 그림 2A). 그림 2 (B-F)에서 볼 수 있듯이, 세포 성장이나 합류에서 큰 차이는 관찰되지 않았습니다. 예상대로 대조군(DHT가 없는 오가노이드 배양 배양지)에서는 대부분의 세포가 전립선 기저 줄기세포의 표지자인 사이토케라틴 5(KRT5)를 발현했습니다(그림 2B, E). 반면, 분화된 하강전립선 세포의 지표인 CD24a의 수치를 낮은 수치로 표현한 세포는 소수에 불과했습니다(그림 2B, F).

앞서 설명한³²개의 1 nM DHT를 보조하면, 기저세포와 하강세포가 모두 포함된 혼합 집단이 형성되었습니다. 그러나 CD24a 발현은 낮게 유지되어 하내세포로의 분화가 불완전함을 나타냈다(그림 2C, F³²). DHT를 10 nM으로 증가시키면 7일간 배양 후 일부 기저 세포를 유지하면서도 하내막 세포의 완전한 분화가 촉진되었습니다(그림 2D-F). 오가노이드 기반 모델의 구분은 밝은 필드 현미경을 사용해 평가할 수도 있습니다. 세포가 희박할 때(0-5일, 그림 1C, 보조 그림 1A) 상태의 차이는 명확하지 않지만, 7일째 밝시야 현미경을 통해 세 배양 조건 간 세포 형태와 외관이 뚜렷하게 드러납니다(그림 1C, 보조 그림 1A,B). DHT가 없을 때 세포는 더 평평하고 불규칙한 형태로 보였으나, 10 nM DHT에서는 다각형 배열로 조약돌 형태를 닮은 세포로 빽빽하게 빽빽하게 모여 있었다(보충 그림 1B).

특히, 3D 오가노이드 배양물은 DHT 농도가 달라질 때 형태학적 변화를 겪기도 했습니다. 구체적으로, 용량 의존적인 오르가노이드 크기가 명확히 증가하는 것이 관찰되었으며, 가장 큰 오가노이드는 10 nM DHT가 존재할 때 형성되었다(그림 1B, 보조 그림 2A,B). 이 결과는 AR 경로가 세포 분화뿐만 아니라 마우스 전립선 오가노이드의 성장 역학 조절에도 중요함을 나타냅니다.

모델의 상피 무결성과 분극을 평가하기 위해, 우리는 DHT가 없거나 10 nM DHT를 배양한 오가노이드 기반 모델에서 경상피 전기 저항(TEER) 측정을 수행하였습니다. TEER 값은 두 조건 모두에서 시간이 지남에 따라 증가했으나, 10 nM DHT가 있을 때는 상당히 높았으며(그림 3A), 이는 상피 장벽 기능이 향상되었음을 나타낸다. 이 결과는 관성 상피 세포의 세포-세포 접합부에서 보통 꼭대기 고리로 조직된 액틴 필라멘트의 팔로이딘 염색에 의해 뒷받침되었습니다. 10 nM DHT 조건에서는 액틴 고리가 대조군보다 더 뚜렷하게 보였으며, 이는 세포 극성과 상피 조직 증가와 일치합니다(그림 3B). 또한, zonula occludens 1(ZO-1)에 대한 면역염색 검사는 10 nM DHT 조건에서 밀착 결합이 증가하는 것을 확인하여 강화된 상피 장벽의 완전성과 하내형 표현형으로의 분화를 더욱 뒷받침하였습니다. 직교 투영법은 10 nM DHT로 배양된 오가노이드가 명확한 상피 극성을 보인다는 것을 보여줍니다(보완 그림 3A). 기저 KRT5⁺ 세포는 바닥에 위치하며, 하강 CD24a⁺ 세포는 상피층을 따라 분포하여 첨단 쪽으로 갈수록 염색 강도가 더 강합니다. 이 구조는 쥐 전립선 조직에서 관찰되는 것과 유사합니다(보충 그림 3B). 주목할 만한 점은, 인간 단백질 지도(Human Protein Atlas) 데이터에 따르면 이 마커들이 인간 전립선 조직에서도 유사한 위치를 가지며, KRT5⁺ 기저 세포가 CD24a⁺ 하강층 아래에 위치해 있음을 보여줍니다(보충 그림 3C)³³. 반면, 대조군 또는 1 nM DHT 조건 하에서 배양된 세포는 기저 및 하내관 표지 사이에 명확한 공간적 구분이 없으며, 세포 높이는 10 nM 조건보다 훨씬 낮았다(보충 그림 3A). 이는 10 nM DHT 보완이 2D 모델에서 상피 분화와 편극을 촉진하며, 이는 원래 전립선 상피와 유사함을 의미합니다. 10 nM DHT로 배양된 오가노이드 기반 모델은 토종 마우스 전립선 상피와 매우 유사하기 때문에(그림 2D, 보조 그림 3A, B), 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 적합한 플랫폼 역할을 합니다. 모델의 적용 가능성을 입증하기 위해, 우리는 UPEC에 감염된 사례, 특히 비뇨생식기 분야에서 가장 흔히 사용되는 UPEC 균주 중 하나인 UTI89 균주를 예로 들었습니다. 그림 4A에 나타난 것처럼, 박테리아는 LB 육수에서 24시간(방법 4에 설명됨)에서 배양한 후 세포와 함께 1시간 배큐했습니다. 그 후 세포외 박테리아는 겐타마이신으로 죽여 침입과 세포 내 복제를 정량화했습니다. 오가노이드 기반 모델에 감염되면 UPEC는 상피세포에 높은 수로 부착되었습니다(0 hpi; 그림 4B, 왼쪽 패널; 그림 4C). 그 후, 겐타마이신 치료(1 hpi) 이후, 세포외 박테리아 사멸로 인해 UPEC 양성 세포 수가 유의미하게 감소했습니다(그림 4B, 중간 패널; 그림 4C). 24 hpi에서 감염된 세포 수는 변함없었으나(그림 4C), 공초점 현미경 영상 결과 세포 내 박테리아가 계속 복제되어 방광 상피에서 이전에 설명된 군집 유사 구조를 형성하는 것이 나타났습니다(그림 4B, 오른쪽 패널). 감염된 세포는 비감염(순진) 대조군을 기준으로 mCherry 형광을 통해 확인되었으며, 이물질과 더블릿을 제외한 결과입니다(보충 그림 4).

그림 1: 전립선 오르가노이드 및 오가노이드 기반 모델의 작업 흐름 및 형태학적 변화에 대한 개요. (A) 실험 작업 흐름의 도식적 표현 (방법 1). (B) 전립선 오가노이드의 형태학적 발달을 보여주는 밝은 필드 이미지로, 1 nM DHT를 보완하여 0, 1, 3, 5, 7일차에 촬영됨(왼쪽에서 오른쪽으로). 스케일 바: 200 μm (n = 3). (C) 0일차, 1일차, 5일차, 7일차에 1 nM DHT를 보완한 오가노이드 기반 모델의 밝시야 이미지(왼쪽에서 우로). 스케일 바: 200 μm (n = 3). (D) 1, 3, 5, 7일차(왼쪽에서 오른쪽)에 1 nM DHT를 보충하고 CellMask(빨간색)로 염색한 오가노이드 기반 모델의 대표적인 면역형광 현미경 이미지. 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 카운터 염색을 했습니다. 스케일 바: 50 μm. (n = 3) 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: DHT는 오가노이드 기반 모델에서 계통 분화를 조절합니다. (A) 미분에 사용되는 다양한 조건의 도식적 표현. (B-D) (B) 1 nM 또는 (D) 1 nM DHT가 없거나 (D) 10 nM DHT가 없는 상태에서 7일간 성장한 오가노이드 기반 모델의 대표적인 면역형광 현미경 이미지. 이미지는 1일차, 3일차, 5일차, 7일차에 촬영되었습니다(왼쪽에서 오른쪽으로). 오가노이드 기반 모델은 CD24a(하강 세포 표지, 녹색)와 KRT5(기저 세포 표지자, 마젠타)에 대해 염색하였습니다. 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 카운터 염색을 했습니다. 스케일 바: 50 μm (n = 4). (E, F) DHT(Ctrl), 1nM 또는 10nM 없이 성장된 오르가노이드 기반 모델에서 (E) KRT5⁺ 및 (F) CD24a⁺ 세포의 이미지 정량화. 데이터는 시야각당 양성 셀의 비율로 표시됩니다. 통계적 검정: Tukey의 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 10 nM DHT로 분화된 오가노이드 기반 모델은 대조군에 비해 세포 분극이 더 높음을 보입니다. (A) DHT(10 nM; 녹색) 부재 및 존재 상태에서 7일간 성장한 오가노이드 기반 모델의 TEER 분석. 오차 막대는 SD(n = 3)를 나타냅니다. 통계적 검정: Tukey의 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA. (B, C) 오가노이드 기반 모델의 대표적인 면역형광 현미경 이미지로, (Ctrl; 상단) 또는 10 nM DHT(하단) 없이 7일간 증육하고, (B) F-actin(빨간색)과 (C) ZO-1(빨간색) 염색을 한 상태입니다. 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 카운터 염색을 했습니다. 스케일 바: 50 μm. (n = 3) 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 4: 오가노이드 기반 모델에서의 감염 역학 분석. (A) 감염 프로토콜의 도식적 표현 (4절). (B) 감염 후 0, 1, 24시간(hpi; 왼쪽에서 오른쪽으로) 감염된 오가노이드 기반 모델을 보여주는 대표적인 면역형광 현미경 이미지. UPEC는 빨간색으로 시각화되어 있습니다. 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 카운터 염색을 했습니다. 스케일 바: 50 μm. (n = 3). (C) 0, 1, 24 hpi에서 UPEC 양성 세포(mCherry 양성 감염 세포)의 유세포 분석. 게이팅 전략은 보조 그림 4에 나와 있습니다. 오차 막대는 SEM (n = 3)를 나타냅니다. 통계적 검정: Tukey의 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: 오가노이드 기반 모델의 형태학적 진화 과정. (A,B) (A) 10 nM DHT가 없는(Ctrl) 및 (B) 존재 상태에서 0, 1, 3, 5, 7일차(왼쪽에서 우로)에 촬영된 오가노이드 기반 모델의 밝은 영역 이미지. 스케일바: 200 μm. (n = 3) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

추가 그림 2: DHT 농도는 3차원 전립선 오가노이드 성장에 영향을 미칩니다. (A) 10 nM DHT가 없거나 존재하는 상태(Ctrl; 위쪽)에서 0일차, 1일차, 3일차, 5일차, 7일차에 촬영된 오가노이드 기반 모델의 밝명시야 이미지(왼쪽에서 오른쪽으로). 스케일 바: 200 μm (n = 3). (B) 3일 차에 3D 오가노이드 크기를 세 가지 조건에서 배양: DHT 없음(Ctrl; 분홍색), 1 nM DHT(보라색), 10 nM DHT(녹색) 하에서 배양됨. 통계 검정: Tukey의 사후 검정(n = 3)을 이용한 일원 ANOVA 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: 전립선 오가노이드 형태 및 상피 극성의 특성 분석. (A) 서로 다른 DHT 농도(Ctrl, 1 nM, 10 nM DHT) 하에서 상피 조직과 끝에서 기저 극성을 나타내는 공초점 z-스택의 직교 투영. 기저 세포는 KRT5(마젠타)로, 하강 세포는 CD24a(녹색)로 염색하였다. 스케일 바: 50 μm.(B) OCT 내장된 마우스 전립선 조직의 면역형광 염색 기저부(KRT5, 마젠타) 및 하내막(CD24a, 녹색) 상피 표지자를 보입니다. 핵은 DAPI(파란색)로 카운터 염색합니다. 스케일 바: 50 μm. 간단히 말해, 쥐 조직 조각은 4% PFA로 고정하고, 30% 자당으로 하룻밤 탈수했으며, OCT 임베드에³²를 적용했습니다. 슬라이드는 PBS에 10분간 재수화되고 3절 후 면역염색을 했습니다. (C) 인간 전립선 조직에서 CD24a 및 KRT5 단백질 발현에 대한 면역조직화학 분석 (패널 C 는 인간 단백질 아틀라스 데이터베이스(버전 25.0)에서 추출됨; 인간 단백질 아틀라스 proteinatlas.org), Uhlén, M. 외(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: 감염 세포 식별을 위한 유세포 게이팅 전략. 세포는 먼저 측면 산란 높이(SSC-H)와 전방 산란 높이(FSC-H)를 기준으로 게이팅하여 잔해를 배제했고, 이어서 SSC-H와 측면 산란 면적(SSC-A)을 기준으로 게이팅하여 단일 셀을 선택했습니다. m체리 양성(감염된) 세포는 Counts 대 PE-Texas 적-H 형광(히스토그램)을 사용하여 확인하였습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

양성 전립선 비대증, 전립선염, 전립선암 등 다양한 질병이 전립선에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 질환들은 매우 흔하며 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칩니다². 이들이 의료에 큰 영향을 미치지만, 특히 비암성 질환에서 기저 기전과 숙주 반응에 대한 이해는 제한적입니다. 이는 주로 생리학적으로 관련된 실험 모델의 부족 때문입니다. 한편으로, 불멸화된 세포주는 정상 전립선 상피의 복잡성이나 분화 상태를 포착하지 못합니다. 반면, 주로 설치류를 중심으로 한 동물 모델은 윤리적 문제를 일으키며 비용 효율적이지 않습니다. 또 다른 접근법으로는 인간 1차 세포나 환자 유래 조직 추출물을 사용하는 방법이 있습니다. 하지만 신선한 전립선 조직의 제한된 가용성으로 인해 광범위한 적용이 제한됩니다. 이러한 한계는 생리학적으로 관련성이 높고 사용하기 쉬우며 실험적으로 관리 가능한 다른 시험관 내 시스템의 필요성을 강조합니다. 이와 관련해 성인 줄기세포 오가노이드 기술은 질병 모델링을 혁신했습니다. 이 3D 배양은 자기조직화 능력을 가지고 있어 상피 정체성과 상피 세포 다양성을 보존합니다 23,34,35,36,37,38. 3D 아키텍처는 암 연구, 약물 시험, 재생 의학 분야에 응용 을 가능하게 했지만, 23,34,35,36,37,38,39,40,41, 39,40,41 등 실험적 접근에 실질적인 어려움이 있습니다 감염 모델. 끝이 나간 오가노이드는 상피 극성을 반전시켜 이 한계를 해결하며, 직접 감염 연구를 위해 꼭대기 표면을 노출시킵니다^27,28. 그러나 감염 모델로서의 효과는 크기 변동, 병원체에 대한 불균등한 노출, 장기 감염 시 취약성으로 인해 제한될 수 있습니다.

여기서는 토착 쥐 상피의 상피세포 구성과 전사 프로필을 재현하고, 첨단 표면에 쉽게 접근할 수 있도록 하는 쥐 전립선의 오르가노이드 기반 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이전 연구^에서 최적화된 이 모델은 씨앗 밀도, 자극에 대한 균일한 노출, 정의된 박테리아-세포 비율(MOI), 그리고 기존 3D 오가노이드 시스템에서 표준화하기 어려운 고처리량 영상 매개변수 등 주요 실험 변수를 정밀하게 제어할 수 있게 합니다.

동물 실험의 3Rs 원리(대체, 감소, 정제)에 따라 이 모델에서 1차 세포 공급원으로 사용되는 오가노이드는 번식과 같은 다른 목적으로 희생된 야생형 순진한 쥐에서 유래했습니다. 전립선은 인근 동물 시설에서 기부를 통해 얻어, 이 프로토콜을 위해 추가 동물을 희생할 필요가 줄어듭니다.

오가노이드와 오가노이드 기반 모델의 견고하고 신뢰할 수 있는 분별은 천연 조직의 세포 구성과 기능 특성을 충실히 재현하고, 이들이 시험관 내 모델로서 적합성을 확보하는 데 매우 중요합니다. 오가노이드 내 세포 분화는 배양지의 특정 조성, 특히 성장인자와 약리학적 물질(예: 약물 억제제)의 정확한 농도에 크게 영향을 받습니다. 이러한 인자들을 조작하면 다양한 오가노이드 시스템에서 입증된 것처럼 특정 세포 계통을 직접 분화할 수 있습니다. 예를 들어, 장 내 오가노이드에서는 WNT의 제거가 장세포 분화를 촉진하며, 인터페론 감마(³⁸번 검토)에 의해 이를 더욱 강화할 수 있습니다. 고블릿 세포로의 분화는 p38 억제제와 니코틴아마이드를 제거하거나 DAPT/DBZ를 이용한 노치 억제(³⁸번 검토)를 통해 달성할 수 있습니다. IGF-1과 FGF-2는 분비성 세포 농축 배양의 장기 확장을 지원하는 것으로 나타났습니다⁴³. 더불어 IL-22는 Paneth 세포의 분화를 촉진하며, Notch와 BMP³⁸을 포함한 경로를 억제하여 장내분비 세포가 생성됩니다. 마찬가지로, 위오가노이드와 오가노이드 기반 단일층은 배양 배지에서 WNT를 추출할 때 구덩이 세포 쪽으로 분화하는 반면, 니코틴아마이드를 배양지에 첨가하면 세포가 선(목 및 주세포)으로 전환됩니다31,44,45.

전립선에서 안드로겐 수용체(AR)는 조직 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다 46,47,48,49. 고환의 라이디히 세포에서 생성되는 테스토스테론은 5α-환원효소에 의해 전립선 상피 세포에서 DHT로 전환됩니다. DHT는 AR을 활성화하여 이합체화하고 핵으로 전장하며, 안드로겐 반응 요소에 결합하여 세포 분화와 항상성에 관여하는 유전자를 조절^합니다. 이전 연구들은 3D 마우스 전립선 오가노이드에 1 nM을 보충하면 세포가 하내막 세포로 분화하는 데 충분하다는 것을 보여주었다⁵¹. 다른 연구자들은 비타민 D(특히 1,25-디하이드록시비타민 D) 보충이 전립선 오가노이드 성장을 촉진하고 WNT 계열 구성원인 DKK3⁵²를 억제함으로써 분화를 가속화한다는 것을 보여주었다. 그러나 이 연구들에서는 3D 오가노이드만 사용되었습니다. 이전 연구⁽³²)와 기타^연구(53)는 3D 오가노이드에서 10 nM DHT 보충만으로는 완전한 분화를 달성하기에 충분하지 않음을 보여주었습니다. 반면, 여기서 설명한 2D 모델, 즉 세포에 10 nM DHT를 시딩하는 방식만으로도 모델을 자연 조직과 유사한 상태로 구분하기에 충분하다³². 3D 모델과 2D 모델 간의 차이를 이해하려면 추가 연구가 필요하지만, 시스템 간 기계적 물리적 단서의 차이나 3D 모델 내 성장 인자를 포함한 ECM의 존재로 설명될 수 있습니다.

성인 전립선 조직에는 세 가지 주요 상피세포 유형이 있습니다: 루내막 세포, 기저 세포, 신경내분비 세포입니다. 이 중 지금까지 발표된 모든 오가노이드 모델에는 하강 세포와 기저 세포만 존재합니다. 희귀한 신경내분비 세포가 없다는 점은 현재의 오가노이드 프로토콜이 완전히 최적화되지 않았을 가능성을 시사합니다. 하내막세포와 기저세포 사이에는 전립선 중간 세포 집단이 하내기(즉, CD24a)와 기저(즉, SCA-1) 마커를 모두 발현하는 전이 상태로도 기술되어 있습니다^18,51. 이 하위 집단은 주로 요도 주변 전립선 부위에 위치하며, 그래서 요도 주변 하강세포(⁵⁴)라고 자주 불립니다. 특정 분화 또는 신호 전달 조건^53,55에서 일부 3D 오가노이드 시스템에서 보고된 바 있지만, 우리 시스템 내에서 관실 세포와 중간 세포 간의 명확한 구분은 관찰되지 않습니다³². 한 가지 가능한 설명은 3D 오가노이드 생성 과정에서 서로 다른 전립선 부위를 구분하지 않고, 요도 세포 오염을 피하기 위해 요도 전립선 연결 바로 옆 조직을 제거한다는 점입니다. 따라서 근위 또는 요도 인접 부위에서 유래한 오가노이드 배양이 중간 세포를 생성하는 데 더 적합할 가능성이 높습니다.

장벽의 완전성은 성숙하고 분화된 상피의 특징으로 여겨지며, 독소와 미생물이 기저 조직에 도달하는 것을 막는 보호 장벽을 제공합니다. ZO-1 단백질이 풍부한 타이트 접합부(⁵⁶)는 세포 내 투과성 조절과 상피 장벽의 완전성 유지에 중요한 역할을 합니다⁵⁷. 상피세포가 분화하면서 이 세포 간 접합부의 성숙은 장벽을 강화합니다⁵⁸. 따라서 장벽 무결성 평가는 시험관 내 상피 모델에서 중요한 측정 결과입니다. 본 프로토콜에서는 장벽 무결성 평가를 위한 세 가지 보완적 방법을 보여줍니다: TEER 측정, ZO-1 면역염색, F-액틴 염색입니다. 세 가지 방법 모두 장벽의 무결성을 효과적으로 평가하지만, 필요한 장비와 자원에서는 상당히 다릅니다. TEER 측정은 시간에 따라 추적할 수 있는 정량적 값을 제공하여 장벽 기능에 대한 동적 통찰을 제공합니다; 하지만 이 기술은 모든 실험실에서 제공되는 것은 아닐 수 있는 특수 하드웨어와 소프트웨어를 요구합니다. 반면, 항ZO-1 항체나 팔로이딘으로 염색하는 것은 시간과 비용 면에서 훨씬 관리하기 쉽습니다(예: 팔로이딘 염색은 약 3시간 내에 할 수 있습니다 - 섹션 3).

이 프로토콜은 3D 마우스 전립선 오가노이드를 사용해 끝부분에 접근 가능한 2D 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 여러 리뷰에서 숙주-병원체 상호작용 연구에서 오가노이드 및 오가노이드 기반 시스템의 장단점이 제시되었습니다 23,36,59. 감염 연구에서는 병원체와 숙주 상피 간의 자연스러운 상호작용 부위를 고려하는 것이 매우 중요합니다. 전립선에서는 하내막 세포가 일반적으로 첫 접촉점이므로, 감염 역학을 정확히 모델링하는 데 꼭 필요한 심근 표면 접근이 필수적입니다. 기존의 3D 전립선 오가노이드에서는 꼭대기 표면이 오가노이드 내강을 향하고 있어 직접 접근할 수 없습니다. 이 경우 병원체 노출은 미세주입을 통해 이루어질 수 있는데, 이는 저처리량이고 기술적으로 도전적이며, 오가노이드를 교란하여 상피 극성을 훼손하고 비생리적 상호^{작용 부위}를 형성합니다. 반면, 이 프로토콜에서 제시된 apically 접근 가능한 2D 모델은 광량 표면에 직접 접근할 수 있습니다. 이를 통해 병원체에 대한 통제되고 생리학적으로 적합한 노출, MOI의 정밀한 조절, 그리고 고처리량·고해상도 또는 생세포 영상 플랫폼과의 호환성이 가능해집니다. 여기서는 UPEC 기준 균주인 UTI89를 사용하여 이 모델을 시험관 내 감염 시스템으로 활용한 사례를 소개합니다. UTI89는 박테리아 전립선염⁹의 주요 박테리아 종을 대표하는 널리 사용되는 참고 사례입니다. 그러나 이 모델은 Enterococcus faecalis나 Pseudomonas aeruginosa와 같은 다른 전립선 병원체 연구에 쉽게 적용할 수 있어, 전립선 감염 생물학을 위한 다목적 플랫폼이 됩니다.

3D 오가노이드의 해리는 오가노이드 기반 모델을 성공적으로 확립하는 데 매우 중요한 단계입니다. 3D 오가노이드를 완전히 해리하지 못해 큰 조각이 생기면 세포가 배양 표면에 부착하는 데 어려움을 줄 수 있으며, 해리 시약에 30분 이상 장기간 노출되면 세포 생존력이 저하됩니다. 더불어, 해리 및 씨앗 형성 전 약 7일간의 일관된 통과 간격을 유지하는 것이 필수적인데, 오르가노이드의 생리적 상태가 부착 및 분화 능력에 큰 영향을 미치기 때문이다. 전립선 오가노이드 기반 모델 개발에 영향을 미치는 또 다른 중요한 변수는 씨앗 밀도입니다. 여기서 사용된 파종 농도는 7일간의 분화에 최적화되었습니다. 이 농도를 높이거나 줄이면 분화 시간이 달라질 가능성이 큽니다. 더불어, 도금 전 세포 재현탁이 부족하면 웰 내 세포 분포가 고르지 않아 세포 밀도가 변동되어 증식과 분화에 영향을 미칩니다. 또한, 다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, ECM 또는 성장 인자의 배치에 따라 성장 및 분화 능력에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 성장 인자 배치나 로트 번호가 변경된 후에도 오가노이드 기반 모델이 일관된 표현형을 유지하는지 확인하는 것이 중요합니다.

오르가노이드 기반 모델이 확립되면 감염 매개변수도 신중하게 최적화되어야 합니다. 박테리아 균주와 선택한 측정 결과에 따라 견고하고 재현 가능한 감염 수준을 달성하기 위해 서로 다른 MOI가 요구되는 경우가 많습니다. UPEC 균주 UTI89(여기 및³²에서 사용됨)와 여러 전립선염 분리株³²의 경우, MOI가 100이면 유착, 침윤, 복제 시점에서 신뢰할 수 있는 감염 세포 수를 얻기에 충분했습니다. 그러나 박테리아와 세포의 배양 기간을 1시간 이상 연장해야 할 경우, 배지 내 UPEC의 세포 외 과증식과 그에 따른 세포 독성을 방지하기 위해 낮은 MOI를 사용해야 합니다. 이 프로토콜에서는 감염을 평가하는 두 가지 방법이 사용되었습니다: I) 감염된 세포의 비율을 정량화하는 유세포분석, II) 박테리아 위치 파악을 위한 공초점 현미경. 그러나 박테리아³²를 측정하는 콜로니 형성 단위 분석, 숙주 또는 박테리아 마커³²를 검출하는 면역염색, 숙주 반응을 프로파일링하는 전사체 분석 등 여러 다른 방법도 사용할 수 있습니다.

전립선 오가노이드 기반 모델은 생리학적으로 중요한 시스템을 제공하지만, 감염 연구에 적용할 때 몇 가지 한계를 고려해야 합니다. 이 모델의 주요 제약 중 하나는 거주 또는 말초 면역 세포가 없다는 점으로, 이는 감염에 대한 숙주 반응(예: 면역 세포 모집 또는 면역 매개 제거)을 완전히 포착하는 데 제한을 줍니다. 모델에서 빠진 다른 필수 요소로는 혈관, 기질, 신경이 있으며, 이들은 모두 숙주-병원체 상호작용에 영향을 미칠 수 있습니다. 기질 섬유아세포, 면역 세포, 내피 세포 등 추가 세포 유형을 도입하면 보다 완전한 조직 미세환경을 재현하는 데 도움이 될 것입니다. 첨단 공동 배양 시스템이나 마이크로유체 기관-온-어-칩 플랫폼은 복잡한 세포 상호작용을 지원하고 감염의 동적 연구를 가능하게 할 수 있습니다. 또한, 동물 모델에서 유래한 오가노이드를 사용할 때는 특히 인간 특이적 병원체를 연구할 때 종별 차이를 고려해야 합니다. 이전 연구인³² 에서는 쥐 전립선 오가노이드 기반 모델의 발견이 인간 조직에서도 재현될 수 있음을 보여주었지만, 유전자 조절, 수용체 발현, 호르몬 반응의 종간 변이로 인해 이 모델이 인간 생리학에 직접적으로 미치는 영향은 여전히 제한될 수 있습니다. 인간 유래 오가노이드를 포함시키는 것은 인간 특이적 병원체 상호작용과 반응 연구를 가능하게 하여 번역 가치를 높일 것입니다. 이러한 추가는 오가노이드 기반 모델을 전립선 생물학, 감염 병인, 치료 개발 연구에 강력한 도구로 강화할 수 있지만, 우리가 제시하는 순수 상피 모델은 단순화되고 구획화된 시스템을 제공합니다. 이를 통해 다른 조직 구성 요소의 간섭 없이 상피세포 특이적 숙주-병원체 상호작용을 집중적으로 조사할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48개의 웰 플레이트	사르스테트	83.3923	바닥 모양: 평평한 형태
5&알파;-안드로스탄-17&베타;-올-3-1 디하이드로테스토스테론	시그마-올드리치	A8380	DHT로 지정되었습니다. 기본 해법 10μ 100% 에탄올에 M이 함정
8웰 PET 슬라이드, 웰당 40개의 전극을 포함하며,	응용 생물물리학	8W10E+	TEER 측정에 사용되는 슬라이드
96개의 웰 플레이트	사르스테트	82.1583	바닥 모양: 원뿔형
전진 달베코' 개조된 이글 중형/F12 및 nbsp;	써모피셔 사이언티브	12634028	10 mmol L&minus를 보완하면 adDMEM/F12+/+로 지정되었으며; HEPES 1개와 글루타맥스 1개
암피칠린	로스	K029.2	농축 재고 100 mg/mL
항-CD24a 항체	단백질 기술	10600-1-AP	1차 항체; 1x PBS 1%BSA에 1:100 희석
항사이토케라틴 5 알렉사 플루오르 647 항체	Abcam	AB193895	1차 항체; 1x PBS 1%BSA에 1:100 희석
항토끼 IgG 알렉사 플루어488  항체	인비트로젠	A21441	2차 항체; 1x에 1:500 희석 PBS 1%BSA
항-ZO-1 다클론 항체	단백질 기술	21773-1-AP	1차 항체; 1x PBS 1%BSA에서 1:750 희석
B27, 50배	써모피셔 사이언티브	12587010
소 혈청알부민(BSA) 프락션 V, 뉴질랜드-기원	로스	8076.3	1x PBS에서 1% 사용 블로킹 버퍼의 구성 요소
챔버드 &마이크로 슬라이드 8 웰	이비디	80806	표면 변형: ibiTreat
원뿔관 (15 mL)	시그마 올드리치	T1943	평평한 바닥이 작은 펠릿에 더 좋습니다.
디나트륨 에틸렌디아미네테트라-아세테이트 2H2O (EDTA)	로스	8043.2	수제 제품: 400mL H2O에 93.0g, pH를 8.0으로 조절하고, H2O와 최대 500mL까지 부피를 조절합니다; 0.5만 만 EDTA; 유동세포계 버퍼의 구성 요소
둘벡코의 균형 소금 용액(DPBS)	깁코	14190-144	PBS
에코 회전 현미경	메아리
ECIS  Z-쎄타 -& nbsp; 임피던스 기반 셀 분석 시스템	응용 생물물리학	ECIS  Z-쎄타	시스템에는 16 및/또는 96 우물 스테이션이 포함됩니다; 외부 제어 모듈; 노트북 PC; ECIS 제어, 획득 및 디스플레이 소프트웨어; 자동 셀 이동 및 전기천공을 위한 고가 필드 모듈
태아 소 혈청(FBS) 우수	시그마 올드리치	S0615	유세포계 버퍼의 구성 요소; 293T 세포주 배양 배양 성분; 배양 배양HEK293T 세포주 구성 요소
플래시 팔로이딘 레드 594	바이오레전드	424203	1x PBS 1%BSA에 1:250 희석
유세포계 완충기			PBS 1배, FBS 10%, 5mM EDTA
겐타미신	시그마 올드리치	G1272
글루타맥스	써모피셔 사이언티브	35050-038	l-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, adDMEM/F12++ 의 성분;
하버드 바이오크롬 울트로스펙 10 셀 밀도계	피셔 사이언티브	10704417
HCS 셀마스크 진한 빨간색 스테인	라이프 테크놀로지	H32721	1x의 PBS 1%BSA에 1:1,000 희석
HEK293T 마우스 Noggin-Fc 발현 벡터로 트랜스펙션한 세포주	클레버스 교수님의 세포주		노긴 생산에 사용되었으며; 배양액: 500ml DMEM, 고포도당, GlutaMAX, 피루베이트 (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50ml FBS; Farin 외, 위장병학 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	써모피셔 사이언티브	15630056	adDMEM/F12+++ 의 성분;
호에스트(Hoechst 33342)와 nbsp;	라이프 테크놀로지	H3570	1x PBS에서 1:5,000 희석
인간 표피 성장인자(EGF)와 nbsp;	페프로텍	AF-100-15	농축 스톡 500 및 마이크로; g/mL
접종 루프	사르스테트	86.1567.010
접종관	사르스테트	62.515.006
라이카 스텔라리스 5 공초점 현미경	라이카
루리아 베르타니 브로스 (LB 브로스)	로스	X968.1
마트리젤	코닝	356231	세포외 기질 (ECM)
N-아세틸시스테인	시그마-올드리치	A9165-25G	농도 500 mM
노긴 CM
노보세포 양자와 nbsp;	애질런트		플로우 사이토미터
파라포름알데히드 (PFA)	시그마 올드리치	P6148	4% 복용 시 1x PBS, 4% 자당
프리모신	인비보젠	앤트-pm-1
Q-VETTES 세미마이크로	레이티오랩	2712120
로키 (Y-27632)	아브몰	M1817	RhoA/ROCK 억제제; 농도 스톡 10 mM
R-스포딘1 CM
293T 세포주 발현 중인 R-스폰딘1	시그마 올드리치	SCC111	R-spo1 CM을 생산하는 데 사용됨; 배양액: 500ml DMEM, 고포도당, GlutaMAX, 피루베이트 (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGFβ i (A-83-01)	토크리스	2939	ALK4/5/7 억제제; 농축 스톡 5 mM
트리톤 X-100	시그마 올드리치	T9284	PBS에 희석된 0.5% 1회 사용
TrypLE Express 효소	깁코	12605028	3D 마우스 전립선 오가노이드 소화를 위한 효소 세포 해리제(Enzymatic cell dissociation agent)
요로병원성 대장균 균주 UTI89	도브린트 교수님의 WT 균주		pFPV-mCherry(추가유전자 #20956)로 변환됨