방법 논문

면역조절 증진을 위한 골수 유래 중간엽 기질 세포의 표준화 분리 및 사이토카인 프라이밍

DOI:

10.3791/69397

⸱

2025년 12월 5일

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Laboratory, ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health, Indian Council of Medical Research (ICMR), 2Department of Medicine and Carbone Cancer Center, University of Wisconsin in Madison

이 논문에서

요약

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여기서는 마우스 골수 유래 중간엽 기질 세포를 분리하는 프로토콜과 BMSCs의 면역 억제 효과를 증폭시키는 사이토카인 프라이밍 방법을 시연합니다.

초록

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중간엽 기질 세포(MSCs)는 강력한 재생 및 면역조절 기능을 가지고 있습니다. 이러한 특성들은 MSC를 다중 면역 질환 치료에 강력한 세포 약물로 만듭니다. 골수는 MSCs의 주요하고 가장 자주 사용되는 공급원입니다. 마우스 모델을 이용한 전임상 기전 연구는 인간 임상시험에서 BMSCs의 최적의 약물 전달 전략을 이해하는 데 매우 중요합니다. 따라서 마우스 MSCs의 제조 공정 표준화는 더 나은 치료 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 핵심 목표는 제어된 인터페론감마(IFN-γ) 프라이밍이 BMSCs의 내재적 면역억제 특성을 어떻게 증진하는지 입증하는 것입니다. 우리는 미처리 또는 IFN-γ 사전 허가된 BMSC에서 조건 배지(CM)를 생성하는 과정을 기술하고, 일차 복막 대식세포를 사용하여 그 생물학적 활성을 평가합니다. ELISA와 유동세포 프로파일링을 통해 프로토콜은 특히 IFN-γ 프라임 시 BMSC 유래 분비체가 IL-10 생성 증가와 M2 관련 표면 표지자 증가를 특징으로 하는 항염증 대식세포 분극을 어떻게 유도하는지 상세히 설명합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 기능적으로 일관된 마우스 BMSC를 생성하고 면역조절 능력을 평가하기 위한 통합된 틀을 확립합니다. 기술적 변동성을 줄이고 시각적·절차적 명확성을 제공함으로써, 전임상 MSC 연구에서 재현성을 향상시키고 중개 연구를 위한 최적화된 MSC 배포 전략을 촉진합니다.

서론

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골수 유래 중간엽 기질 세포(BMSC)는 전임상 및 임상 연구에서 널리 활용되고 있습니다. 낮은 면역원성, 쉽게 접근할 수 있는 접근성, 그리고 다중 계통 분화 능력 덕분에 BMSC는 임상 환경에서 세포 약물로 사용될 유망한 후보로 떠올랐습니다 1,2,3. 이들의 면역억제 및 재생 특성은 이식편대숙주 질환(GVHD)4, 패혈증5, 염증성 장질환(IBD)과 같은 염증성 질환 치료에 임상 연구에서 광범위하게 활용되어 왔습니다. 골수 기질 지위는 이질적인 기질 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 MSC는 국제세포치료학회(ISCT)가 정의한 기준을 충족하며, 여기에는 다음과 같은 조건이 포함됩니다: 성형 부착, 표면 수용체 발현 -- 인간의 CD73, CD90, 그리고 생쥐의 CD29, CD44, CD90 -- 조혈 또는 내피 표지자의 발현 없이 - CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, 그리고 지방 생성 능력 등이 포함됩니다. 연골성 또는 골형성적 분화7.

BMSC는 시크릿옴이라 불리는 파라크린 인자들의 방출을 통해 기능을 유지하는데, 여기에는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포외 소포 및 다양한 용해성 및 접촉 의존성 분자가 포함됩니다 8,9. MSC의 분비체는 선천 면역계의 요소들과 양방향으로 상호작용하여 지위를 조절합니다10. MSCs-대식세포 상호작용 중 방출되는 인자들은 대식세포를 촉진염증 또는 항염증 표현형으로 전환시킬 수 있습니다 11,12. 반대로, MSC의 기능 상태는 특히 대식세포를 중심으로 국소 면역 세포에 의해 피드백 메커니즘을 통해 조절됩니다11. 이 MSC-대식세포 교차 작용은 MSC의 면역억제 기능에 필수적입니다. 입양 전달된 MSC는 대식세포가 있을 때만 조직 염증을 감소시키며, 이는 대장염 마우스 모델에서 관찰됩니다. 반면, 대식세포가 없는 상태에서 MSC가 B 또는 T 림프구와 상호작용하는 것은 치료 효과를 발휘하기에 충분하지 않습니다13.

미국 Osiris Therapeutics가 스테로이드 저항성 GVHD(NCT00366145)1 치료를 위해 동종 BMSC를 사용한 첫 3상 임상시험을 완료했습니다. 그 이후로 수많은 전임상 및 임상 연구가 수행되었으나, 임상 시험의 성공은 전임상 결과를 근거로 기대에 미치지 못했습니다. MSC 기반 임상시험의 성공률을 높이기 위해서는 약물 배포 전략의 최적화가 필수적입니다. 최적의 전달 경로, 치료 세포 용량, 그리고 치료 현장에서 세포의 생리학적 상태를 이해하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어, 생체 내 대장염 마우스 모델에서 연구들은 냉동 보존 MSC나 정맥 주사 투여가 최적의 투여 방법이 아니라는 것을 보여주었다14.

사이토카인 사전 허가, 유전자 변형, 저산소 전조건 처리 등 다양한 접근법이 MSC의 생체 내 지속성과 치료 유용성을 향상시키기 위해 널리 연구되어 왔습니다15. 쥐 뒷다리 허혈 모델에서는 저산소 전처리(2%O2)가 열충격 단백질인 78-kD 포도당 조절 단백질(GRP78)의 발현을 증가시켜 MSC의 증식과 이동 능력을 향상시켰다16. IL-1β(인터루킨-1 베타)는 MSC가 호중구, 단핵구, 림프구, 호산구를 활용하는 능력을 증강합니다17. 생체 내 전달 후, MSC는 활성화된 T 및 NK 세포에서 유래한 IFNγ에 노출되어,MSCs 18에 의한 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 생성이 증가합니다. IDO는 MSC의 분비체에서 중요한 구성 요소로, T 세포 증식률을 낮춥니다. 흥미롭게도, MSC는 생쥐 유래 T 림프구와 공동 배양할 때 면역억제 능력이 감소합니다19. 연구들은 IFN-γ 사전 허가가 냉동 보존 MSCs에서 T 세포 매개 세포자멸사율을 감소시키는 것으로 확인되었습니다13,20. IFNγ 프라이밍은 BMSCs13의 치료 결과를 향상시킵니다. 이 모든 증거는 IFNγ가 더 강력한 면역억제 MSC 생성에 필수적인 역할을 함을 시사합니다.

가장 효과적인 MSC의 전달 방식을 결정하기 위해, 동물 모델은 윤리적 접근성을 위해 널리 사용되어 왔습니다. 전임상 결과의 변동성을 줄이기 위해서는 MSC의 제조 공정에 최적화된 방법을 확립하여 높은 수율, 세포 생존성, 그리고 시간에 따른 일관성을 보장하는 것이 중요합니다21. MSC의 통과는 다양한 치료 결과를 만들어내는 중요한 변수입니다. 시험관 내 배양 과정에서 통과는 MSC의 특성화와 효능을 조절할 수 있으며, 일정 횟수의 통과 후 세포는 노화(sending)를 유지합니다. 따라서 임상 또는 전임상 연구에서는 MSC 통과 번호 사용에 일관성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 마찬가지로, MSC 격리에 대한 특정 프로토콜과의 일관성도 MSC 사용 결과의 재현성을 달성하는 데 핵심 요소입니다. 여러 방법 중 항체 기반 세포 분류법23, 음성 선택 방법24, 효소 소화25 가 MSC 분리의 대표적인 방법입니다. 그러나 이러한 방법의 적용 가능성은 원천에 따라 달라지며, 부적절한 사용은 수확량, 효능, 삼계통 분화 능력을 감소시킵니다.

여기서는 선호되는 통과 번호, 냉동 보존 기법, BMSC 유래 상태 배지 수집을 강조하는 BMSC 분리 및 특성 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 또한 IFN γ 매개 MSC 프라이밍 프로토콜을 제공하며, 마지막으로 복막 대식세포가 정상 또는 IFN-γ 사전 허가된 BMSC에 어떻게 차별적으로 반응하는지에 대한 비교 연구를 시연합니다.

프로토콜

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본 연구는 ICMR-국립생식아건강연구소(IAEC 프로젝트 No.09/23) 동물윤리위원회와 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스 기관 동물 관리 및 이용 위원회의 승인과 지침을 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 6-8주 성인 암컷 C57Bl/6J 쥐를 특정 병원체가 없는 환경에서 교배 및 사육한 개체가 사용되었습니다.

참고: 우리는 in vivo 또는 in vitro 연구를 진행하면서 기관 생명안전위원회(IBSC)가 정한 생물안전 프로토콜을 따랐습니다. 간단히 말해, 동물 연구에서는 스트레스와 부상 위험을 줄이기 위해 부드러운 다루기를 유지했습니다. 우리는 안전안경, 장갑, 실험실 코트, 마스크, 일회용 부펀 캡 등 적절한 개인 보호 장비를 착용했습니다. DMSO와 같은 생물학적 위험 화학물질 시약의 경우, 화학물질을 다루기 위해 생체 안전 캐비닛을 사용했습니다. 특정 폐기물 용기를 사용해 생물학적 위험 시약이나 날카로운 물체를 버렸습니다.

1. 쥐 골수 간엽 기질 세포의 분리

참고: 뒷다리 채취 후에는 나머지 단계들을 조직 배양 층류 후드와 멸균 무균 기법26에서 수행해야 합니다.

  1. 쥐를 자궁경부 탈구로 안락사시키고, 이어서 70% 에탄올로 철저히 헹군습니다. 안과 겸자를 사용해 쥐의 두 엉덩이 관절 사이 복부 피부를 부드럽게 비틀고 가위로 조심스럽게 피부를 절단합니다.
  2. 피부를 발 쪽으로 살짝 당겨 벌리세요. 엉덩이 관절과 발목을 아래로 절개하여 뒷다리 양쪽을 자유롭게 합니다.
  3. 뒷다리를 얼음처럼 차가운 DMEM에 신속히 옮기고, 1x 페니실린/스트렙토마이신과 2% FBS를 보충하여 조직 손상을 방지하고, 이후 해리 과정 전까지 진행하세요.
  4. 얼음처럼 차가운 매체가 들어 있는 페트리 접시에 뒷다리를 모두 넣어 보세요. 뼈의 간극부를 부드럽게 긁어내며 대퇴골과 경골에서 근육과 결합 조직을 조심스럽게 떼어내세요. 깨끗이 씻은 뼈를 얼음 식지가 들어있는 새 페트리 접시로 옮깁니다.
  5. 대퇴골과 경골을 절단한 후, 골수 강 끝 바로 아래 경골과 대퇴골 끝에 절개를 합니다. 대퇴골과 경골 박리 수술 중 골수를 최대한 보호하세요.
  6. 1mL 멸균 주사기와 21G 바늘을 사용해 페트리 플레이트에서 배지를 채취하세요. 멸균 겸자로 절제된 대퇴골을 잡고 바늘을 부드럽게 골수에 삽입하세요. 골수를 채취하려면 골수강을 세척하세요. 이 과정을 뼈가 하얗게 될 때까지 반복합니다. 경골도 같은 방식으로 세척하세요.
  7. 피펫을 부드럽게 넣었다 빼내어 페트리 접시 안의 세포 덩어리를 흩어줍니다. 70mm 필터 메쉬를 사용해 세포 현탁액을 걸러내어 뼈 입자를 제거합니다. 여과액을 수집해 230 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
  8. 상청액을 버리고 완전한 배지(DMEM, 10% FBS, 5% L-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신)와 함께 펠릿을 재현탁합니다. 혈구계를 이용해 트리판 블루 배제와 카운트를 통해 세포의 수확량과 생존력을 측정합니다.
  9. 세포를 5000 세포/cm2의 조직 배양 플라스크에 완전 DMEM 배지13에 씨앗 뿌립니다. 배양 후 48시간 후 배지를 교체하여 비부착 조혈 세포를 제거하세요. 매체는 격일로 3-4일마다 새 매체로 교체하세요.
    참고: 오염을 피하려면 접시 대신 세포 배양용 플라스크를 사용하세요. 세포 성장에 방해가 되므로 인큐베이터에서 플라스크를 자주 꺼내 세포를 점검하지 마세요.
  10. 부착 세포를 분리하려면 PBS로 세포를 1회 세척하고, 0.25% 트립신-EDTA를 추가한 후 세포를 5분간 트립신에 보관하세요. 이 방법은 셀을 우물에서 분리하는 데 도움을 줍니다.
  11. 전체 배지를 넣고 재현탁한 후 230 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요. 완전한 DMEM 배지를 펠릿에 추가하고, 재현탁한 후 5,000 cells/cm2 밀도로 재씨앗합니다.
  12. 배지를 3-4일마다 교체하여 세포를 매주 전달하세요. 세 번째 통과 후에는 6단계에서 설명한 유동 세포분석 분석으로 MSCs 배양을 분석합니다. 실험에는 3-5번 통로 세포를 사용하세요.
    참고: 세포를 미래 실험용으로 냉동 보존하기 위해, 원하는 부피로 세포를 원심분리한 후 냉동 배지에 재현탁하고, 각 크라이오비아에 1mL 냉동 배지를 1 x 106 세포를 -80 °C에서 하룻밤 보관한 후 장기 사용을 위해 질소로 옮깁니다.
    동결 배지 구성: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. 배양된 MSC에서 조건화된 배지 제조

  1. 세포를 6개의 웰 플레이트에 5000 cells/cm 2 밀도로 씨앗을 넣으세요. 80% 합류할 때까지 MSC를 배양하세요.
  2. 조절된 배지를 세포 배양판에서 수집하고 230 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리기로 채취한 후 필터에 넣어 처리에 사용하세요.

3. 배양된 MSC에서 IFNγ 프라이머드 조건 배지 제조

  1. 세포를 6웰 플레이트에 5000 cells/cm2 밀도로 씨앗을 뿌립니다. 세포를 25 ng/mL IFNγ로 48시간 처리합니다. MSC에 대한 IFNγ의 최적 효과를 얻기 위해 용량 의존 연구를 수행하세요. 이 실험에서는 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL 등 IFNγ 농도 범위를 선택하여 MSC를 사전 허가합니다. 5 ng/mL와 10 ng/mL 농도는 대식세포 분극에 유의미하게 덜 효과적이었으며, 25 ng/mL가 최적 농도로 확인되었습니다(보충 그림 1).
  2. IFN-γ 함유 매체를 디캔트한 후에는 우물을 PBS로 2번 세척하여 IFN-γ가 완전히 제거되도록 합니다. 잔여 IFN-γ은 연구 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
  3. 세포를 37°C의 일반 DMEM 배지에서 추가로 24시간 배양합니다. 24시간 후, 2단계에 따라 조건 매체를 수집하세요.

4. 복막강에서 유래한 대식세포의 분리 및 배양

  1. 쥐의 복강에 얼음처럼 차가운 PBS 5mL(FBS 3% 포함)를 주입한 후 복부를 부드럽게 마사지하세요.
  2. 무균 주사기로 PBS 용액을 회수하세요. 10mL 튜브에 모으세요. 용액을 300 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
  3. 상정액을 제거하세요. 이 펠릿을 완전한 RPMI 배지(RPMI, 10% FBS, 1x 페니실린, 스트렙토마이신)에 녹입니다. 세포를 5000 세포/cm²로 도판하세요.
  4. 24시간 후 비부착 세포를 제거하고 배양하여 합류할 때까지 진행하세요. 필요에 따라 세포를 추가 실험 절차에 사용하세요.

5. 효소 결합 면역흡착 분석

  1. BMSCs-CM 처리된 대식세포에서 유래한 IL-10을 검출하려면 아래 단계를 따르세요.
    1. 대식세포를 BMSCs-CM으로 24시간 치료한 후 다음 날 상원액을 채취하세요.
    2. 제조사의 설명서에 따라 IL-10 ELISA 키트를 사용해 IL-10 양을 측정하세요.
  2. BMSC 또는 IFNγ 처리된 BMSC에서 유래한 CCL2를 검출하려면 제조사의 지침에 따라 CCL2 ELISA 키트를 사용하세요.

6. MSCs에 대한 유세포 분석 및 대식세포 표현형 분석

  1. 셀을 6웰 플레이트에 씨앗 뿌리고 합류시키세요. PBS(1mL)로 1번 세척한 후 트립신 추출을 합니다. 0.25% 트립신을 추가하고 5분간 트립신에서 배양하여 세포를 완전히 배양합니다.
  2. 트립신 활동을 비활성화하는 미디어 추가. 세포를 10mL 폴리스티렌 튜브에 모으세요. 대식세포는 300 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기, BMSC는 4°C에서 230 x g 에서 5분간 원심분리기를 사용했습니다.
  3. 상청액을 제거하고 세포를 2mL의 염색 완충제(얼음처럼 차가운 PBS, 2% FBS와 0.05% 아지드)에 재현탁합니다. 230 x g 로 7분간 돌리세요. 펠릿을 디캔트하고 교란시키세요. 고스트 레드 780 생존 염료 1mL와 FACS 완충제 50mL를 추가한 후 재현탁한 후 유동 튜브에 넣습니다. 어둠 속에서 30분간 스테인을 사용하세요.
  4. 30분 후에는 1mL의 염색 버프로 세포를 세척합니다. 펠릿을 디캔트하고 교란시키세요. 원하는 항체 또는 아이소타입 대제 양을 추가하세요. 어둠 속에서 30분 더 부화하세요. 세포를 스테인 버퍼로 세척한 후 디캔트한 후 400mL 스테인 버퍼에 재현탁하세요. 샘플 튜브 채취 준비가 완료되었습니다.
  5. 생체-죽음 염색 제어를 준비하기 위해, 트립신화 및 원심분리 후 펠릿을 2mL 염색 완충제에 용해합니다. 다른 마이크로 원심분리관에서 1mL를 꺼내 여기에 10mL의 DMSO를 넣어 세포를 죽입니다. 10분간 보텍스하고 부화하세요. 이제 이 1mL를 다른 세포 함유액과 플로우 튜브에 섞어 주세요.
  6. 스테인 버퍼 1mL를 넣고 230 x g 에서 7분간 돌립니다. 펠릿을 디캔트하고 교란시키세요. 고스트 레드 780 생존 염료 1mL와 FACS 완충제 50mL를 추가한 후 재현탁한 후 유동 튜브에 넣습니다. 어둠 속에서 30분간 스테인을 사용하세요. 30분 후에는 1mL의 염색 버프로 세포를 세척합니다. 펠릿을 디캔트하고 교란시키세요. 400mL 스테인 버퍼에 다시 부탁하세요. 살아있는 죽은 채취 샘플이 준비됐어.
    참고: 마우스 대식세포 염색의 경우, 표준 염색 프로토콜 전에 추가 염색 단계를 추가해야 합니다. 흐름 데이터의 부정확성을 방지하기 위해 FC 수용체의 차단은 비특이적 항체가 세포 내 Fc 수용체에 결합하는 것을 막는 중요한 단계입니다. Fc 수용체를 차단하기 위해 세포 현탁액에 1mL의 Fc 차단 시약(정제된 항생쥐 CD16/CD32 항체)을 첨가하고 실온에서 15분간 인큐베이션합니다. 나머지 유동 항체 염색 단계는 Fc 차단 시약을 씻어내지 않고 수행하세요.
  7. 흐름 데이터를 분석하기 위해서는 우선 순방향 산란 및 측면 산란 매개변수를 기반으로 단일 셀을 선택해야 합니다. 이 단계는 잔해와 세포 집합체를 제거하는 데 매우 중요합니다. 그 후 단일 세포는 생체-죽음 염색에 따라 게이트가 됩니다. 생세포 집단을 기반으로 추가 분석을 수행하세요(보충 그림 2).

결과

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전체 실험 도식은 그림 1에 설명되어 있습니다. 대퇴골과 경골 모두에서 쥐 골수를 채취하여 씨앗 채취, 통과 및 유세포검사를 분석하였습니다(그림 1A). BMSC의 상태 배지(BMSCs-CM)를 IFNγ 사전 허가 유무에 관계없이 수집했으며, BMSCs-CM 소량은 향후 실험 필요를 위해 -80°C에 보관되었습니다(그림 1B).

골수 유래 세포는 헤모세포미터(그림 2A)로 개수되어 완전한 DMEM 배지에서 5000 세포/cm2의 밀도로 시딩하였습니다. 48시간 후에는 첫 매질을 교체했고, 이후 매개체는 3/4일마다 교체되어 완전히 합류할 때까지 계속되었습니다. 세포가 80% 합류에 도달했을 때 통과시켰습니다(그림 2B). 4번째 통로에서는 MSC 특이적 마커 발현을 기반으로 세포를 특성화하였습니다. 세포는 CD44, CD29, CD90 양성이었고, CD45, CD11b, CD34는 음성이었습니다(그림 2C). BMSC는 지방발생, 골형성, 연골생성 계통으로 분화할 수 있습니다14, 27, 28, 29. 이는 국제 세포 치료 학회 신원 지침을 유지합니다.

MSCs-CM의 면역억제 효과를 이해하기 위해, 복막강 유래 대식세포(PMφ)를 치료하고 BMSCs-CM으로 처리하였습니다(그림 3A). 우리는 BMSCs-CM 처리된 대식세포의 유동 세포분석 분석을 수행했습니다(그림 3B, C). 복강 상주 배양 적응 대식세포는 M1 및 M2 특이적 표면 표지로 염색되었습니다. 우리는 세포 표지가 실제로 염색되기 전에 정제된 항마우스 CD32/CD16(마우스 Fc 블록)으로 대식세포를 인큐베이팅하여 비특이적 항체 결합을 방지했습니다. M1 특이 마커인 CD86과 iNOS, 그리고 M2 특이 마커인 CD206과 CD163의 발현이 연구되었습니다. 세포는 처음에 조혈 마커 CD45.2(C57BL6에 해당)를 기반으로 게이트가 결정되었습니다. IL-10은 M2 표현형의 시그니처 사이토카인입니다. MSCs-CM 처리된 대식세포에서 방출된 IL-10은 ELISA 연구를 통해 측정되었습니다(그림 3D). LPS/IFNg가 M1 편극을 유도하기 때문에 이 처리는 음성 대조군 역할을 했습니다.

CCL2는 MSC의 분비구에서 확인된 시그니처 사이토카인 중 하나로, 대식세포 분극을 유발합니다. MSC에서 방출된 CCL2는 ELISA에 의해 검출되었습니다(그림 3E). CCL2가 대식세포 분극에서 어떤 역할을 하는지 확인하기 위해, CCR2 억제제로 대식세포를 전처리한 후 MSC-CM 처리를 시행하였고(그림 3F), 다시 IL-10 ELISA 연구로 대식세포 분극이 검출되었습니다(그림 3F).

우리의 결과는 MSC의 분비체가 항염증 대식세포 분극을 유도할 수 있음을 명확히 보여주며, 이는 조건부 배지 처리 후 장 유래 대식세포에서 IL-10 생성이 증가하는 것으로 입증됩니다(그림 3).

그림 1
그림 1: 연구 흐름도. (A) C57BL/6마리의 쥐가 안락사되었습니다. 골수는 대퇴골과 경골에서 세척되어 원심분리한 후 일주일간 배양했고, 배지는 3일마다 교체되었습니다. MSC는 배선되었고, 4번째 통과에서는 유세포검사와 지방생성 연구가 특징지어졌습니다. (B) 4개의 MSC는 6웰 플레이트에 시딩되었으며, 한 세트는 25 ng/mL 농도로 IFNγ가 첨가되었고, 다른 세트는 처리하지 않은 상태로 보관되었습니다. 48시간 후에는 일반 완전 DMEM 매체로 교체하세요. 24시간 후에는 플레이트, 원심분리기, 필터에서 매체를 수집하세요. 상태가 좋은 매체는 -80°C에 보관하여 향후 사용을 위해 보관하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2
그림 2: 표현형 특성화. (A) 골수 유래 세포는 씨앗 전에 혈구계로 집계되었습니다. (B) 세포가 각 통과 전에 80% 합율될 때까지 성장하도록 허용했습니다. (C) 4번 통과 세포는 마우스 MSC 특이적 마커를 이용한 유세포분석 분석으로 특징지어졌다. 스케일 바는 100 mM을 나타냅니다. 그림 2C 는14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3: BM-MSC 분비체 분석. (A) 실험 도면. (B) MSC-CM 처리된 PMφ의 대표적 플로우 세포계 분석 그래프. 복막 유래 세포는 조혈 표지자 CD45.2 양성 집단을 기준으로 게이트가 결정되었습니다. 선정된 집단은 M1 특이 마커 CD86 또는 iNOS, M2 특이 마커 CD206 또는 CD163, 그리고 각 경우에 CD11b 이중 염색을 추가로 수행했습니다. (C) 세포의 M1 또는 M2 집단 비율을 정량화하였다. LPS/IFNγ로 처리한 세포군이 음성 대조군으로 작용했습니다. (D) MSC-CM처리된 PMφ에 의해 방출된 IL-10을 정량하기 위해 ELISA가 수행되었습니다. ELISA는 MSC-CM에서 방출된 (E) CCL2, PMφ가 방출한 (F) IL-10을 정량화하기 위해 수행되었습니다. 그림에서 알 수 있듯이, 한 세트의 실험은 CCR2 길항제가 있는 상태에서 수행되었다. 오차 바는 SEM ± 평균을 나타냅니다. 그룹당 3개의 MSC 샘플을 가진 3개의 독립 실험을 대표하는 데이터입니다. 학생 t-검정을 사용하여 모든 실험에 대한 통계적 분석을 수행했습니다. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001. 그림 3B-F는13에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: BMSC는 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg로 사전 허가되었습니다. 대식세포는 IFNγ 사전 라이선스 MSCs-CM으로 처리되었으며, MSC-CM 처리된 PMφ에서 방출된 IL-10을 정량하기 위해 ELISA가 수행되었습니다. 오차 바는 SEM ± 평균을 나타냅니다. 그룹당 3개의 MSC 샘플을 가진 3개의 독립 실험을 대표하는 데이터입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: (A-C) 단일 셀은 순방향 산란 및 측면 산란 매개변수를 기준으로 선택되었습니다. (D) 단일 세포는 생체-사체 염색을 기반으로 게이트가 설정되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

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마우스 골수 유래 중간엽 기질 세포의 분리는 생체 내 동물 모델에서 MSCs의 고유한 면역억제 및 재생 특성을 이해하는 데 중요한 기술입니다. 방법은 간단하고 따라하기 쉬워 보이지만, 박테리아 오염을 방지하고 최적의 세포 수율을 보장하기 위해 여러 단계를 정밀하게 수행해야 합니다. 절차의 각 단계는 초청정 환경에서 무균적으로 진행되어야 합니다.

세포 수율이 낮아지는 것을 피하려면 6-8주 연령대의 쥐를 선택하세요. 대퇴골과 경골 끝을 절단할 때는 골수를 최대한 보호해야 하며, 세척 과정은 단단하면서도 부드럽게 하여 골수를 완전히 추출해야 합니다. 분리된 셀은 적절한 CO₂ 농도와 가습 조건에서 배양되어야 합니다. 배지 교체 시에는 오염된 조혈 세포를 제거하기 위해 배지를 교체하기 전에 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척하는 것이 필수적입니다. 조혈 세포 오염을 방지하기 위해 재전달 시 트립신화 시간은 5분을 초과하지 않아야 합니다. 초기 통과 시에는 배지 교체가 너무 빠르지 않아야 하며, 빈번한 배지 교체는 박테리아 오염을 일으킬 수 있습니다.

각 통과마다 세포를 여러 배치에 걸쳐 냉동 보존하여 일관성과 가용성을 유지해야 합니다. IFN-γ 프라이밍의 경우, MSC 조건 매체에 대한 가장 효과적인 사전 허가 조건을 결정하기 위해 선량 의존 실험을 수행해야 합니다. 저희 실험에서는 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL 등 다양한 IFNγ 농도를 시험하여 MSC의 사전 라이선스를 받았습니다. 그 후 25 ng/mL가 최적 농도로 확인되었습니다.

데이터 무결성을 유지하기 위해 모든 실험 분석에는 특정 통과 번호의 세포를 일관되게 사용해야 합니다. MSC의 유동 세포 특성 분석에는 표면 수용체 발현의 신뢰성 높은 검출을 위해 3번 이상의 혈통 세포를 사용해야 합니다. 유세포 염색 시 생세포/죽은 세포 구별은 위음성 결과를 줄여주기 때문에 필수적입니다.

이 결과는 외인성 전달 BMSC가 대장염 중 장 염증을 완화하는 핵심 메커니즘을 보여줍니다. IFN-γ 프라이밍은 MSC 조건 배지가 대식세포 편광에 미치는 영향을 증폭시킵니다. BMSC에서 방출되는 CCL2는 대식세포에 작용하여 M2 분극을 유도하는 임계 화학물질입니다. 이전 연구 결과는 CCL2와 CXCL12 화학인이 대식세포의 분극을 촉진하기 위해 협력적으로 작용함을 보여주었습니다. 이 사건은 T 세포 및 B 세포 표현형의 후속 조절을 통해 항염증 신호를 전파하는 데 필수적입니다13.

우리 연구에서는 MSC의 플라스틱 부착 특성을 기반으로 한 간단한 BMSC 분리 프로토콜을 구체적으로 따랐습니다. 유세포분석 또는 면역자기 분류를 통해 MSC 특이적 표면 마커를 기반으로 BMSC를 분리할 수 있습니다. 하지만 이 두 방법 모두 샘플 준비 과정에서 많은 세포를 잃을 가능성이 있습니다. 마우스 골수에는 MSC의 수가 매우 적으며(약 0.001%에서 0.08% 정도로 추정됨), 우리는 표준 플라스틱 부착 특성 기반 분리 방법을 선호했습니다. 하지만 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 주요 위험은 조혈 세포 오염으로, 이는 MSC의 치료 능력을 저하시킬 수 있습니다. 따라서 MSC 특이적 표면 수용체를 발현하는 상당수의 세포 집단을 식별하는 것이 중요합니다.

공개 사항

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저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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DBT/웰컴 트러스트 인도 연합의 J.G. 초기 경력 펠로우십 지원 원고에는 DM 연구소의 NIRRCH ID: REV/1502/02-2023 기금이 적혀 있습니다. 이 연구는 국립보건원, 국립 당뇨병 및 소화기·신장 질환 연구소의 지원을 받았으며, J. 갈리포에게 수여R01DK109508. 이 연구는 위스콘신 대학교 카본 암 센터의 지원금 P30 CA014520의 지원도 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
수직 층류 유동을 갖춘 세포 배양 후드, UV 조명 및 nbsp;
멸균 수술용 가위
25/75 cm2 플라스크 
27G 바늘이 꽂힌 5/10mL 주사기
6웰 배양 접시와 nbsp;
아큐타제코닝#AT104
적대 마우스 F4/80 장갑병 운행 차량바이오레전드#123116
안티마우스 CD 11b PEBD 파르밍겐#557397
안티-마우스 CD 45.2 APCBD 파르밍겐#558702
안티마우스 CD163 Percp eFluor710e바이오사이언스#46-1631-80
안티마우스 CD206 PE바이오레전드#141706
안티마우스 CD86 FITCBD 파르밍겐#553691
안티마우스 아이노스 PE-Cy7e바이오사이언스#25-5920-80
CCL2 ELISA 키트인비트로젠#554722
CCR2 적대자 (RS 102895)시그마#R1903
원심분리기와 nbsp;
DPBS코닝#21-031-CV
둘벡코 변형 독수리 미디엄 (DMEM)코닝# 10-013-CV
태아 소 혈청시그마#F8067
필터 메쉬(70mm) 
고스트 레드 780 생존 염료톤보 생명과학#13-0865-T100
IL-10 ELISA 키트인비트로젠#88-7105-88
L-글루타민코닝#25-005-CI
위상 차비 장비가 있는 현미경
생쥐 IFN&감마;R& D 시스템#485-MI-100
페니실린-스트렙토마이신코닝#30-002-CI
쥐 안티마우스 CD16/CD32BD 파르밍겐#553142
RPMImedium코닝#10-040-CV
멸균 수술용 겸자(직선 및 곡선)
온도 및 가스 조성 제어 인큐베이터
트립신코닝#25052-cl
온도 조절이 가능한 수욕

참고문헌

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