방법 논문

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

DOI:

10.3791/69400

⸱

2025년 10월 28일

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인핸서로 알려진 핵심 시스 조절 요소는 다양한 세포 기능과 발달 과정을 제어하는 표적 유전자의 정확한 전사 조절을 가능하게 하는 데 중심적인 역할을 합니다. 이러한 인핸서는 종종 양방향으로 전사되어 인핸서 RNA(eRNA)라고 하는 긴 비코딩 전사체를 생성합니다. eRNA의 발현은 H3K27ac 및 공동 활성화제 모집과 같은 활성 염색질 특징과 밀접하게 연관되어 있으며 기능적으로 표적 유전자의 전사 활성화에 기여합니다. 그럼에도 불구하고 eRNA의 검출 및 정량화는 특히 숙주 유전자 전사와 겹치는 경우 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 초기 RNA 시퀀싱 데이터에서 인핸서 전사를 분석하기 위한 표준화되고 사용자 친화적인 계산 워크플로를 제시합니다. 이 프로토콜은 데이터 전처리, 판독 매핑 및 품질 관리를 통해 사용자를 안내한 후 신호 할당이 복잡한 유전자 내 인핸서에 대한 전용 절차와 함께 인핸서 관련 전사의 가닥 특이적 정량화를 안내합니다. 시각화 모듈을 사용하면 게놈 컨텍스트 전반에 걸쳐 인핸서 활성을 명확하게 검사할 수 있으며 내장 옵션은 유전자간 및 유전자내 인핸서 분석을 모두 지원합니다. 생물정보학 전문 지식이 제한된 연구자를 위해 설계된 이 워크플로는 인핸서 전사에 대한 일관되고 재현 가능하며 확장 가능한 연구를 위한 실용적인 프레임워크를 제공하여 다양한 시스템에서 인핸서 생물학의 광범위한 적용을 촉진합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인핸서는 염색질 루핑을 조직하고 전사 기계를 모집하여 표적 유전자 전사를 제어하는 시스 조절 DNA 요소입니다 1,2,3. 이들의 조직 특이적 활동은 발달 및 계통 헌신 동안 정확한 조절을 가능하게 합니다 4,5,6,7,8. 활성 인핸서는 H3K4me1(히스톤 H3 라이신 4 모노메틸화) 및 H3K27ac(히스톤 H3 라이신 27 아세틸화)와 같은 특징적인 염색질 특징을 나타내며 일반적으로 개방 염색질 9,10,11,12를 표시하는 DNase I 과민성 영역에서 발견됩니다. 이러한 특징을 통해 전사 인자와 RNA 중합효소 II는 DNA에 접근하여 인핸서 유전자좌 13,14,15,16에서 초기 전사를 시작합니다.

이 순차적인 생물학적 과정은 양방향, 비코딩 및 일반적으로 비폴리아데닐화 RNA인 eRNA라고 하는 인핸서 유래 전사체를 생성합니다 13,14,15,16. eRNA는 인핸서 활성의 마커 역할을 하며 그 자체로 이펙터 역할을 합니다 16,17,18,19,20,21,22,23,24. 이들은 일시 중지된 RNA 중합효소 II16,19에서 NELF(Negative Elongation Factor)를 방출하여 생산적인 신장을 촉진하고 인핸서-프로모터 루프 17,18,20을 안정화하는 데 도움을 줍니다. 그들은 또한 잠재적으로 m6A(N6-메틸아데노신) 변형 21,22,23을 통해 전사 응축물의 형성을 지원합니다.

그럼에도 불구하고 유전자체 내의 조절 요소에서 시작되는 유전자 내 인핸서 전사의 기능은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 일부 연구에서는 유전자 내 인핸서의 eRNA가 잠재적으로 NELF 방출 및 자극 의존적 생산 신장을 촉진함으로써 숙주 유전자 발현을 증가시킨다고 보고합니다25 26,27. 대조적으로, 다른 연구에서는 이 전사가 RNA 중합효소 II 충돌 또는 전사 간섭을 통해 숙주 유전자를 방해하여 감쇠 또는 조기 종료를 초래할 수 있음을 시사합니다28,29. 이러한 상충되는 관찰은 마커 및 조절자로서 eRNA의 이중 역할과 함께 신중한 정량화 및 기능적 해부의 필요성을 강조합니다. 그러나 유전자 내 eRNA를 측정하는 것은 종종 감각-가닥 숙주 전사체와 겹치기 때문에 어렵습니다 13,25,26,30. 인핸서가 중첩된 유전자가 있거나 두 가닥에 중복되는 전사가 있는 영역에 상주하여 인핸서 특이적 신호를 모호하게 만들 때 문제가 증폭됩니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 특히 유전자 내 영역에 중점을 두고 인핸서 관련 전사체를 검출, 정량화 및 시각화하는 생물정보학 파이프라인을 개발했습니다. 이 파이프라인은 시퀀싱(ATAC-seq), 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq), 글로벌 런온 시퀀싱(GRO-seq) 및 게놈 주석을 사용하여 트랜스포자제-접근 가능한 염색질 분석을 통합하여 복잡한 게놈 상황에서도 인핸서 수준의 분해능을 달성합니다.

파이프라인은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다: (i) 전처리, 정렬, 피크 호출 및 신호 생성(31); (ii) 염색질 특징을 이용한 인핸서 동정; (iii) 특히 유전자체 내에서 가닥 방향 할당; (iv) 초기 인핸서 전사체의 정량화 및 시각화. 이 프레임워크는 본 연구에서 분석된 마우스 배아 줄기 세포와 같이 고해상도 시퀀싱 데이터가 있는 시스템에 특히 유용하며, 적절한 데이터 세트를 사용할 수 있는 경우 다른 유기체로 확장할 수 있습니다. 기존 파이프라인이 부족한 경우 인핸서 특정 정량화를 가능하게 함으로써 이 워크플로는 다양한 게놈 맥락에서 유전자 내 eRNA 전사를 벤치마킹하고 연구하기 위한 실용적인 도구를 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 워크플로에 사용되는 모든 원시 데이터 세트는 표 1에 나열되어 있습니다. 생물정보학 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다. 이 파이프라인에 사용되는 스레드 수는 각 스크립트의 맨 위에 정의된 THREADS 변수를 수정하여 조정할 수 있습니다. 사용자는 사용자의 CPU 리소스에 따라 분석을 가속화하기 위해 수를 늘릴 수 있습니다.
각 단계가 끝나면 로그 파일이 생성됩니다. 빠른 실패 확인을 위해 cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. 다음 단계 전에 수정하십시오." || echo "확인: 오류 마커 없음". ERROR가 나타나면 단계를 실패로 처리하고 먼저 해결하십시오.

1. GitHub 리포지토리에서 전체 분석 파이프라인 다운로드

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. 사용하는 운영 체제에 적합한 CLI(Command-Line Interface)를 시작합니다.
    1. Windows: WSL(Linux용 Windows 하위 시스템)을 사용하여 Linux 환경을 설정합니다. 32를 진행하기 전에 공식 지침에 따라 WSL을 설치하고 구성합니다.
    2. macOS: macOS는 Unix 기반이므로 추가 설정 없이 계속합니다. 공식 가이드를 참조하여 터미널33을 엽니다.
    3. Linux 사용자, 특히 Ubuntu를 사용하는 사용자: 참조된 지침34에 설명된 대로 터미널을 엽니다.
  2. 터미널에서 wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   를 실행하여 인핸서 식별 및 인핸서 RNA 정량화를 위한 파이프라인을 다운로드합니다.
  3. 터미널에 unzip ~/pipeline.zip -d ~/ 를 입력합니다. 이렇게 하면 필요한 모든 파일이 홈 디렉토리에 추출됩니다.
  4. rm ~/pipeline.zip 실행하고 mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization을 입력하여 아카이브를 제거하고 추출된 폴더의 이름을 바꿉니다.
  5. cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/을 입력하고 chmod +x scripts/*를 실행하여 "scripts/" 디렉토리의 모든 스크립트를 실행 가능하게 만듭니다.

2. 분석 파이프라인을 위한 맘바/콘다 환경 설정

  1. bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh 입력하여 mamba 가상 환경을 만들고 실행합니다. 실행 중에 메시지가 표시되면 Y를 입력하고 Enter 키를 눌러 패키지 설치를 확인합니다. macOS의 경우 2.1.1단계를 따르십시오. Mamba 또는 Conda가 이미 설치된 시스템의 경우 2.1.2단계를 따릅니다.
    1. MacOS: 스크립트를 열고 miniconda 다운로드 링크를 macOS 버전으로 바꿉니다.
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      그런 다음 2.1단계를 따릅니다.
    2. 프롬프트에 (enhancer-env)가 나타나면 bash scripts/Step2_package_installation.sh 입력하여 다운스트림 분석에 필요한 패키지를 설치합니다. Y를 입력하고 설치 중에 메시지가 표시되면 Enter 키를 누릅니다.
    3. 2.2단계를 실행한 후 터미널 출력에서 오류 메시지를 확인합니다. 문제를 해결하십시오. 그런 다음 2.2단계를 다시 실행합니다.
    4. (선택 사항) mamba list 를 실행하여 재료 표 의 모든 mamba 관리 패키지가 설치되었는지 확인합니다. HOMER은 수동으로 설치되며 맘바 목록에 나타나지 않습니다. "~/homer/" 디렉토리가 있는지 확인하여 HOMER을 확인하십시오.

3. SRA(Sequence Read Archive)에서 공개적으로 사용 가능한 ChIP-seq, ATAC-seq 및 GRO-seq 데이터 세트를 다운로드합니다.

  1. cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./를 실행하여 원시 읽기 처리에 필요한 셸 스크립트를 복사합니다.
  2. bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1을 입력하고 Enter 키를 눌러 SRA에서 원시 시퀀싱 데이터를 다운로드하고 처리합니다.
    참고: 이 스크립트는 분석을 위한 공개 시퀀싱 데이터의 다운로드 및 준비를 자동화합니다. "MATERIAL/" 아래에 분석 유형 및 복제(생물학적: rep1/rep2, 기술적: trep1/trep2)별로 구성된 표준화된 폴더 구조를 생성합니다. SRA 액세스 번호의 기본 제공 목록은 프리페치(v3.2.0)를 사용하여 검색하고, fasterq-dump(v3.2.0)(쌍을 이루는 끝: --split-files)를 사용하여 FASTQ로 변환하고, 스토리지를 줄이기 위해 pigz(v2.8)를 사용한 압축을 구동합니다. 처리는 prefetch, fasterq-dump, pigz를 따르며 해당 "00.Rawdata/" 디렉토리에 출력이 기록됩니다.

4. 원시 판독의 품질 관리 및 트리밍 수행

  1. bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1을 입력하여 원시 FASTQ 파일의 읽기 트리밍 및 품질 관리를 수행합니다.
    참고: 이 스크립트는 해당 입력 컨트롤을 사용하여 GRO-seq, ATAC-seq 및 ChIP-seq(H3K27ac, H3K4me1)의 원시 FASTQ 파일을 처리합니다. 원시 판독에서 FastQC(v0.12.1)35 를 실행한 다음 분석별 매개변수를 사용하여 Trim Gulare(v0.6.10)36 으로 어댑터를 트리밍합니다. GRO-seq의 경우 먼저 NextSeq G 꼬리와 매우 짧은 판독(--nextseq 20, --length 20)을 제거한 다음 Cutadapt(v5.1)37 을 사용하여 긴 폴리-A 관을 벗기고 20 뉴클레오티드보다 긴 판독을 유지합니다( -a A{15}, -m 20). ATAC-seq의 경우 쌍을 이루는 끝 라이브러리를 처리하고 Tn5/Nextera 어댑터(--paired, --nextera)를 대상으로 합니다. H3K27ac 및 해당 입력의 경우 쌍 종단 ChIP-seq 라이브러리(--paired)를 처리합니다. H3K4me1 및 해당 입력의 경우 표준 단일 끝 트리밍(기본값)을 수행합니다. FastQC는 트리밍된 판독에서 다시 실행됩니다. 출력은 각 분석의 "01.Clean/" 디렉토리에 기록되고 중간 GRO-seq 어댑터 트리밍 파일은 제거됩니다.

5. Bowtie2 참조 인덱스 준비

  1. 아래 두 가지 옵션 중 하나를 선택하여 mm10(Mus musculus) 참조 게놈에 대한 Bowtie2(v2.5.4)38 게놈 지수를 준비합니다.
    1. bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1을 실행하여 개발자가 제공한 사전 구축된 Bowtie2 인덱스를 사용합니다.
    2. 달리다 배쉬 Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       을 사용하여 원시 MM10 게놈 서열을 다운로드하고 수동으로 인덱스를 구축합니다.
      참고: 두 방법 모두 "reference_index/" 디렉토리에 대한 인덱스 파일을 생성하며 표준 맞춤과 기능적으로 동일합니다.

6. 트리밍된 판독을 mm10 참조 게놈에 정렬

  1. bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1을 입력하여 각 분석의 판독값을 BAM 파일을 참조하고 생성하도록 정렬합니다.
    참고: 이 단계는 각 분석의 판독값을 이전에 인덱싱된 mm10 참조에 매핑합니다. H3K27ac ChIP-seq 및 해당 입력은 기본 감도에서 균형 잡힌 정확도(-1, -2)를 위해 쌍 종단 매핑을 사용합니다. H3K4me1 ChIP-seq 및 해당 입력은 기본 설정(-U)에서 단일 종단 매핑을 사용합니다. ATAC-seq는 고감도 매핑을 사용하여 쌍단 입력(-1, -2)이 있는 가변적이고 긴 Tn5 파생 단편(--매우 민감, -X 2000)을 수용합니다. GRO-seq는 고감도 매핑을 사용하여 단일 종단 입력(-U)으로 짧고 트리밍된 읽기(--very-sensitive)를 더 잘 배치합니다. SAM 파일은 BAM으로 변환되고 samtools(v1.22.1)39 보기로 필터링되며, ChIP/입력(-b, -q 10)에 대해 중간 정도의 MAPQ를 사용하고 ATAC-seq 및 GRO-seq(-b, -q 30)에 대해 더 엄격한 임계값을 사용합니다. 최종 BAM 파일은 각 데이터 세트의 "02.Align/" 디렉터리에 기록됩니다.

7. H3K27ac ChIP-seq 데이터의 기술 복제 병합

  1. bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1을 실행하여 H3K27ac ChIP-seq의 기술 복제 및 해당 입력 BAM 파일을 병합합니다.
    참고: 이 스크립트는 sambamba (v1.0.1)40 정렬을 사용하여 기술 복제에 대한 BAM 파일을 정렬한 다음 H3K27ac ChIP-seq 및 해당 입력 복제를 sambamba 병합을 사용하여 통합 BAM으로 병합합니다. 사용자의 데이터 세트에 기술 복제가 포함되어 있지 않은 경우 이 단계를 건너뛰고 개별 BAM 파일로 진행합니다.

8. 중복 및 비필수 염색체 제거

  1. 중복을 제거하고 ChIP-seq 및 GRO-seq에 대한 매핑된 읽기를 정렬합니다.
    1. bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1을 입력하여 히스톤 ChIP-seq 데이터 세트에서 중복을 제거하고 ChIP-seq 및 GRO-seq 출력 BAM을 모두 정렬합니다.
      참고: 이 스크립트는 sambamba 마크드업(-r)을 사용하여 PCR 중복을 제거하고 sambamba sort를 사용하여 좌표 정렬을 제거합니다. H3K27ac의 경우 처리는 병합된 기술 복제의 BAM을 대상으로 하며 ChIP와 입력을 별도로 처리합니다. H3K4me1의 경우 각 복제 및 일치 입력이 개별적으로 처리됩니다. GRO-seq의 경우 중복 제거를 건너뛰고 좌표 정렬만 적용됩니다. 출력은 각 데이터 세트의 "02.Align/" 디렉터리에 저장됩니다.
  2. 중복을 제거하고 ATAC-seq에서 미토콘드리아 염색체 매핑 판독을 필터링합니다.
    1. bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1을 입력하여 PCR 중복을 제거하고, 미토콘드리아 판독값(chrM)을 필터링하고, ATAC-seq BAM을 정렬합니다.
      참고: 이 스크립트는 ATAC-seq 데이터 처리에 대한 ENCODE 파이프라인 권장 사항을 참조합니다. sambamba sort(-n)를 사용하여 이름 정렬을 수행하고 samtools fixmate(-m)를 사용하여 메이트 쌍 정보를 수정하는 것으로 시작합니다. 이 단계는 중복을 표시하기 전에 메이트 정보가 올바르게 할당되었는지 확인합니다. 그런 다음 sambamba markdup(-r)을 사용하여 PCR 중복을 제거합니다. 미토콘드리아 읽기는 samtools idxstats(chrM 및 * 제외)에서 keep-list를 생성하고 samtools 보기(-b)를 사용하여 나열된 참조만 유지하여 제거됩니다. 최종 좌표 정렬은 sambamba 정렬로 수행됩니다. 정리된 BAM은 각 복제본의 "02.Align/" 디렉터리에 기록됩니다.

9. 각 데이터 세트에 대한 피크 호출 수행

  1. bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1을 입력하여 9단계 스크립트를 실행하여 ChIP-seq 및 ATAC-seq 데이터에 대한 피크 호출을 수행합니다.
    참고: 이 스크립트는 ATAC-seq 및 ChIP-seq(H3K27ac, H3K4me1)에 대해 MACS3(v3.0.3)41 을 사용하여 피크 통화를 수행합니다. ATAC-seq는 모든 복제 BAM을 시프트/확장(-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01)이 있는 노모델 모드에서 신호로 제공하여 피크를 생성합니다. H3K27ac는 일치하는 입력(-f BAMPE, --broad)을 사용하여 병합된 기술 복제에서 광범위한 피크를 호출합니다. H3K4me1은 단일 종단 광범위 모드(-f BAM, --broad)에서 일치하는 입력으로 각 복제를 개별적으로 처리하고 침대 도구(v2.31.1)42 가 교차하여 겹치는 피크를 얻습니다. 출력은 각 데이터 세트의 "peak_calling/" 디렉터리에 기록되며 "peak_calling/overlapped_peak/" 아래에 신뢰도가 높은 H3K4me1 피크가 있습니다.

10. 다운스트림 신호 분석을 위해 ChIP-seq 및 ATAC-seq BAM 파일의 생물학적 복제 병합

  1. bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1을 실행하여 ATAC-seq 및 H3K4me1 ChIP-seq의 생물학적 복제에서 BAM 파일을 병합합니다.
    참고: 이 스크립트는 ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq 및 해당 H3K4me1 입력에 대한 sambamba 병합과 복제 BAM을 결합합니다. 병합된 BAM은 다운스트림 분석(예: bigWig 신호 생성, 정규화)을 지원합니다. 출력 BAM은 각 샘플 경로 아래의 "merge/02.Align/" 디렉터리에 저장됩니다.

11. 태그 디렉토리를 생성하고 매핑된 읽기에서 bigWig 파일에 신호를 보냅니다.

  1. bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1을 실행하여 태그 디렉터리를 만들고 각 데이터 세트의 매핑된 읽기를 위한 bigWig 신호 파일을 생성합니다.
    참고: 이 스크립트는 makeTagDirectory를 사용하여 HOMER 태그 디렉토리를 구축한 다음 HOMER(v5.1)43 및 ucsc-bedgraphtobigwig(v482)44 패키지를 사용하여 makeUCSCfile 명령으로 bigWig 신호 트랙을 생성합니다. 모든 신호 트랙은 UCSC Genome Browser(https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/)의 염색체 크기 파일을 사용하여 생성됩니다. GRO-seq는 가닥별 신호 트랙(-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig)을 생성합니다. ATAC-seq는 병합된 BAM(-bigWig)에서 정규화되지 않은 트랙을 생성합니다. ChIP-seq(H3K27ac, H3K4me1)는 의사 개수가 1인 입력 정규화된 트랙(-bigWig, -i, -pseudo 1)을 생성합니다. 출력은 "03.TagDir/" 및 "04.bigwig/" 아래에 구성됩니다.

12. 인핸서 식별을 위한 파일 준비

  1. 터미널에 bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 을 입력하여 인핸서 식별에 필요한 파일과 참조를 준비합니다.
    참고: 이 단계에서는 인핸서 식별에 필요한 모든 파일을 "ATAC/", "Histone/" 및 "Annotation/" 폴더로 구성된 "01.E_identification/material/"로 수집합니다. 피크 파일(ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1)을 적절한 디렉토리에 복사합니다. GENCODE M23 주석 파일(mm10)이 자동으로 다운로드되고 ENCODE 블랙리스트45 (mm10-blacklist.v2.bed) 및 염색체 크기 파일(mm10.chrom.sizes)을 포함한 참조 파일이 미리 정의된 경로에서 복사됩니다.

13. 주석에서 프로모터 후보 및 유전자체 식별

  1. cd 01.E_identification/를 입력하여 작업 디렉토리로 들어간 다음 cp를 실행합니다. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ 를 사용하여 인핸서 식별 스크립트를 복사합니다.
  2. bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1을 실행하여 GENCODE 주석을 사용하여 프로모터 영역, 유전자 본체 및 PCG(Protein-Coding Genes)에 대한 BED 파일을 생성합니다.
    참고: 이 스크립트는 다운로드한 GENCODE M23 유전자 전달 형식(GTF)을 처리하여 프로모터 후보, 모든 유전자체 및 PCG 체에 대한 BED 파일을 생성하고 출력을 "material/Annotation/"에 저장합니다. 프로모터는 침대 도구 슬롭(-b 2000, -g mm10.chrom.sizes)이 있는 각 전사체의 TSS(전사 시작 부위) 주위에 2kb 창으로 정의됩니다. 유전자 및 단백질 코딩 바디는 유전자로 주석이 달린 GTF 항목에서 파생되며, 단백질 코딩 항목은 "gene_type = protein_coding"로 추가로 필터링됩니다.

14. 인핸서 식별을 위한 공정 피크

  1. bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1을 실행하여 인핸서 식별을 위해 ATAC-seq 및 히스톤 ChIP-seq 피크 파일을 전처리합니다.
    참고: 이 스크립트는 인핸서 호출을 위한 피크 세트를 전처리합니다. ATAC-seq의 경우, bedtools 빼기(-A)로 블랙리스트 영역과 겹치는 영역을 제거한 다음 bedtools 뺄셈(-A)으로 프로모터 후보와 겹치는 피크를 제외합니다. 히스톤 마크(H3K27ac, H3K4me1)의 경우 침구 슬롭(-b 1000 -g mm10.chrom.sizes)으로 각 피크를 양쪽에서 1kb씩 대칭적으로 확장한 다음 침구 빼기로 프로모터 중첩을 제거합니다.

15. 인핸서 식별 및 분류

  1. bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1을 실행하여 염색질 피크 데이터를 사용하여 인핸서를 정의하고 분류합니다.
    참고: 이 단계에서는 침대 도구를 사용하여 인핸서를 정의하고 주석을 달습니다. ATAC-seq 피크와 슬롭 확장 H3K4me1 피크 사이의 중첩은 교차(-wa, -u)로 얻어지며, 측면 H3K27ac 피크와 겹치는 영역은 교차(-wa, -u)가 있는 활성 인핸서로 분류됩니다. 비활성 인핸서는 빼기를 사용하여 전체 인핸서 세트에서 활성 영역을 제거하여 파생됩니다. 각 인핸서 세트와 겹치는 ATAC-seq 정상은 교차(-u)로 수집된 다음 정상은 유전자체에 대해 교차(-v 또는 -u)가 있는 유전자간 및 유전자내로 분할됩니다. 인핸서 간격은 최종적으로 교차(-u)와 관련된 피크의 관련 정상을 기반으로 유전자간/유전자 내 클래스에 할당됩니다. 모든 결과는 "01.allE/", "02.interE/" 및 "03.intraE/" 아래의 "01.E_identification/"에 저장됩니다.

16. 유전자 내 강화제에 임시 가닥 정보 할당

  1. bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1을 입력하여 임시 가닥 정보를 유전자 내 인핸서 BED에 할당합니다.
    참고: 이 단계는 침대 도구 교차(-wa, -wb)를 사용하여 인핸서 간격을 유전자체와 겹쳐서 유전자 가닥 라벨을 유전자 내 인핸서에 할당합니다. 열 1, 2, 3, 4, 5, 16은 awk로 유지된 다음 레코드가 정렬되고 중복 제거됩니다. 출력은 "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed"로 저장됩니다.

17. 두 가닥 유전자가 겹치는 인핸서에 대한 가닥 할당의 우선 순위 지정

  1. bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1을 입력하여 두 가닥에서 유전자가 겹치는 유전자 내 인핸서의 가닥 방향을 해결합니다.
    참고: 이 스크립트는 PCG 중첩의 우선 순위를 지정하여 두 가닥에서 유전자를 겹치는 유전자 내 인핸서에 대한 가닥 모호성을 해결합니다. 두 가닥에 존재하는 인핸서가 먼저 분리되고(크롬/시작/끝/id/가닥에 의한 awk 그룹화), 동일한 가닥의 PCG 중첩 사례는 침대 도구 교차(-s, -wa, -u)로 선택되고, 비 PCG 사례는 침대 도구 교차(-v)로 유지됩니다. 선택된 세트와 유지된 세트는 연결되고 정렬됩니다. 출력: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. PCG 우선 순위가 지정된 유전자와 겹치는 유전자에 대한 가닥 특이적 백만 매핑 판독당 킬로베이스당 읽기 값(RPKM) 값 계산

  1. bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1을 입력하여 동일한 가닥에서 인핸서가 겹치는 유전자에 대한 가닥 특이적 RPKM을 계산합니다.
    참고: 이 단계는 17단계의 "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed"를 사용하며, 여기에는 (i) 한 가닥에서 PCG를 겹치고 가닥을 받거나, (ii) 두 가닥에서 PCG를 겹치고 모호하게 유지되거나, (iii) PCG 겹침이 없고 두 가닥을 모두 유지하는 인핸서가 포함되어 있습니다. 동일한 가닥 중첩 유전자는 bedtools 교차(-s, -wa, -u)로 선택되고, awk를 통해 GTF로 변환되고, featureCounts(v2.1.1)46 가닥 특이적 카운트 모드(-s 1, -t 유전자, -g gene_id, -O, --fraction)를 사용하여 GRO-seq에서 정량화됩니다. 총 매핑된 판독값은 sambamba flagstat로 얻고 RPKM은 유전자 길이, 카운트 및 총계에서 계산됩니다. 출력은 "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/"에 기록됩니다.

19. 중첩 유전자의 유전자 발현(RPKM)에 기반한 최종 가닥 할당

  1. bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1을 입력하여 유전자 내 인핸서에 대한 가닥 할당을 완료합니다.
    참고: 이 단계는 단계 18의 유전자 발현 지원을 사용하여 가닥을 유전자 내 인핸서에 할당합니다. 인핸서(ES_E_intragenic_PCG_priority.bed)와 유전자 사이의 동일한 가닥 중첩은 침대 도구가 교차하는 경우(-s, -wa, -wb)에서 발견됩니다. 유전자 RPKM 값은 awk/sort/join을 통해 유전자 간격에 결합되어 유전자-RPKM BED를 생성합니다. 각 인핸서에 대해 RPKM이 가장 높은 중복 유전자가 선택되고 인핸서는 해당 유전자의 가닥을 상속합니다. 결과는 "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed"에 저장됩니다.

20. 유전자 내 인핸서 및 인핸서 서밋에 가닥 정보 할당

  1. bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1을 입력하여 결정된 가닥 정보를 모든 유전자 내 인핸서 및 각 정상에 할당합니다.
    참고: 이 단계는 bedtools를 사용하여 유전자 내 인핸서 및 매칭 서밋에 대한 가닥 할당을 완료합니다. 반대쪽 가닥 간격은 빼기(-S)로 제거되고, 가닥 지정 인핸서는 교차(-wa, -u)를 사용하여 활성 및 비활성 집합과 교차하며, 정상 파일은 교차(-wa, -wb)를 통해 가닥 지정 인핸서와 겹치는 정상에 주석을 다시 추가하고 awk로 가닥을 얻습니다. 결과는 "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" 및 "summit/" 하위 폴더"에 저장됩니다.

21. 인핸서 검증, eRNA 정량화 및 시각화를 위한 입력 파일 준비

  1. cd .를 입력합니다. / 또는 cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization을 사용하여 파이프라인 루트로 이동한 다음 cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./를 입력하여 다운스트림 분석 준비를 위한 스크립트를 복사합니다.
  2. bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1을 실행하여 인핸서 응집, GRO-seq 신호 처리 및 eRNA 정량화에 필요한 모든 파일을 준비합니다.
    참고: 이 단계에서는 "02.E_visualization_quantification/"에서 인핸서 검증, eRNA 정량화 및 신호 시각화를 위한 입력 파일 및 디렉토리 구조를 준비합니다. bigWig 파일, 인핸서 BED, BAM, 신호 행렬, 카운트 및 플롯에 대한 하위 폴더가 생성됩니다. 정상 BED, bigWigs, 인핸서 목록 및 GRO-seq BAM과 같은 주요 입력이 적절한 위치에 복사됩니다.

22. 인핸서 검증을 위한 집계 플롯 생성

  1. cd 02.E_visualization_quantification/를 입력하여 작업 디렉토리로 들어간 다음 cp .를 입력합니다. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ 다운스트림 분석에 필요한 스크립트를 복사합니다.
  2. bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1을 실행하여 각 유형의 인핸서 서밋 주위에 염색질 신호의 집계 플롯을 생성합니다.
    참고: 이 단계는 deepTools(v3.5.6)47의 computeMatrix 및 plotProfile을 사용하여 인핸서 서밋을 중심으로 평균 염색질 신호 농축을 시각화합니다. 정의된 각 인핸서 세트에 대해 computeMatrix 참조 지점(--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero)은 ATAC-seq, H3K27ac 및 H3K4me1용 bigWig 파일을 사용하여 인핸서 정상 주변의 10kb 창 내에서 신호 밀도를 계산합니다. 출력 행렬은 인핸서 그룹 간의 비교를 위한 신호 집계 곡선을 생성하는 plotProfile에 전달됩니다. 집계 플롯은 "01.Profiling/04_1.aggregation/" 디렉토리에 저장됩니다.

23. 인핸서 RNA 발현 정량 및 시각화

  1. bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1을 실행하여 featureCounts를 사용하여 GRO-seq의 eRNA 발현 수준을 정량화합니다.
    참고: 이 단계는 GRO-seq를 사용하여 가닥 특이적 방식으로 정의된 인핸서 영역으로부터의 eRNA 전사를 정량화합니다. 유전자간 인핸서는 가닥되지 않은 모드(-s 0, -t 인핸서, -g gene_id, -O, --분율)에서 featureCounts로 계산되고 유전자 내 인핸서는 중첩 유전자 전사에서 신호를 배제하기 위해 안티센스 모드(-s 2)에서 정량화됩니다. BED 영역은 계산하기 전에 awk를 사용하여 GTF로 변환됩니다. 매핑된 총 읽기는 sambamba flagstat에서 제공되며 개수는 인핸서 길이, 읽기 수 및 총 매핑된 읽기를 사용하여 RPKM으로 정규화됩니다. 출력은 "inter/" 및 "intra/"로 "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" 아래에 구성됩니다.
  2. Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript를 실행합니다. R> Step24_log.txt 2>&1을 사용하여 인핸서 그룹 전반에 걸쳐 eRNA 발현 수준을 시각화하고 비교합니다.
    참고: R 스크립트는 ggplot2(v3.5.2)48 및 cowplot(v1.2.0)49 패키지를 사용하여 RPKM 값을 기반으로 활성 및 비활성 인핸서 표현식을 비교하는 바이올린 및 상자 플롯을 생성합니다. 시각화 및 통계 테스트를 위해 RPKM 값은 로그2(RPKM + 1)로 변환됩니다. 통계적 유의성은 Wilcoxon 순위-합계 테스트를 사용하여 평가됩니다. 요약 플롯과 p-값 테이블은 모두 다운스트림 해석을 위해 "03.eRNA_visualization/"에 저장됩니다.
    참고: 이 파이프라인의 단계가 실패하고 다시 실행한 후에도 지속되면 시각화/문제 https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to 에서 문제를 보고합니다. 실패한 단계를 명확하게 설명하고 로그 파일을 첨부하면 정확한 문제 해결 지원이 보장됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인핸서 전사체 정량화 파이프라인을 위한 개략적인 워크플로우
공개적으로 사용 가능한 ChIP-seq(H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq 및 GRO-seq 데이터 세트(표 1)는 주로 검증을 위해 설계된 표준화된 파이프라인으로 처리되었습니다. 어댑터 트리밍 및 품질 필터링은 Trim Galore 및 Cutadapt를 사용하여 수행한 다음 Bowtie2를 사용하여 mm10 참조 게놈에 정렬했습니다(프로토콜 6단계에서 자세히 설명됨). ChIP-seq 및 ATAC-seq의 경우 MACS3로 피크를 식별하고 다운스트림 시각화 및 정량 분석을 위해 HOMER 및 ucsc-bedgraphtobigwig를 사용하여 신호 강도 트랙(bigWig 파일)을 생성했습니다(그림 1A). 이러한 일관된 전처리는 데이터 호환성을 보장하고 분석별 편향을 최소화하며 다...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인핸서 유래 전사체 13,14,15의 발견 이후, eRNA를 정확하게 정량화하는 것은 특히 eRNA가 종종 숙주 유전자 전사체와 겹치는 유전자 내 맥락에서 주요 과제로 남아 있습니다. 이러한 중복은 가닥 할당 및 신호 귀속을 복잡하게 만들어 실제 인핸서 전사를 배경 유전자 발현과 구별하기 어렵게 만듭니다 13,25,26,30. eRNA가 인핸서 활성의 기능적 지표로 점점 더 인식되고 있지만, 이 분야에는 인핸서 전사체 정량화를 위한 표준화되고 접근 가능한 프레임워크가 부족했습니...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 대한민국 충남대학교 연구기금 [2022-0582-01 (S.-K.K.) 및 2023-0545-01 (S.-K.K.)]의 지원을 받았다. 그림 1 은 BioRender(https://biorender.com/)를 사용하여 작성되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
침대 도구퀸란 연구소, 유타 대학교  v2.31.1BED 파일 편집을 위한 유틸리티
나우타이2랭미드 연구소, 존스 홉킨스 대학교v2.5.4참조 게놈에 리드를 매핑하는 다중 스레드 정렬기
카우플롯윌크 연구소, 텍사스 대학교v1.2.0ggplot2 기반 도표를 결합하고 정렬하는 도구
컷 적응스톡홀름 대학교 생명을 위한 과학 연구소v5.1어댑터 및 폴리-A/G 테일 트리머
딥툴막스 플랑크 연구소 생물정보학 시설v3.5.6정의된 유전체 영역에서 리드를 정량화하는 리드 카운팅 도구
FASTQC바브라함 생물정보학, 바브라함 연구소v0.12.1시퀀싱 리드의 품질 관리
featureCounts (서브리드)모나시 대학교 시 연구소v2.1.1지정된 유전체 영역에 대한 원시 읽기 카운팅 도구
호머캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스(UCSD) 베너 연구소v5.1ChIP-seq, ATAC-seq, 초기 RNA 분석을 위한 툴킷; 태그 디렉터리 생성 및 신호 프로파일링 포함
맥스3찬 저커버그 이니셔티브v3.0.3ChIP-seq 및 ATAC-seq 데이터셋의 피크 호출
피그즈.v2.8gzip 압축 파일을 생성하기 위한 다중 스레드 압축 도구
삼밤바페테르부르크 국립대학교v1.0.1다중 스레드 SAM/BAM 파일 처리 도구 키트
샘툴웰컴 트러스트 생거 연구소v1.22.1SAM/BAM 파일 처리 및 조작을 위한 도구
SRA-툴국립생명공학정보센터(NCBI)v3.2.0NCBI SRA 데이터베이스에서 SRR 파일을 다운로드하기 위해
타이디버스포지트 PBCv2.0.0데이터 조작 및 시각화를 위한 R 패키지 모음
트림-갤러(트림-갤러)알토스 연구소, 케임브리지 과학 연구소v0.6.10어댑터와 다중 스레딩을 이용한 저품질 베이스 트리밍
Ubuntu 20.04파이프라인 개발 및 테스트
UCSC-bedBlogtobigwig 캘리포니아 대학교 산타크루즈 캠퍼스 켄트 연구소V482bigWig 신호 트랙을 생성하는 도구

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

GRO seqATAC seqH3K27

관련 논문