클로닝을 위한 핵 기증자로서 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하는 간단한 미세 흡기 기법

요약

이 프로토콜은 냉동 보존된 말 정액에서 생존 가능한 체세포(SCs)를 분리하는 간단한 미세 흡인 기법을 제시합니다. 전통적인 방법과 달리, 이 기술은 장기간 시험관 배양을 피하고 정자 오염을 극복하여 체세포 클로닝에 즉각적으로 활용할 수 있게 합니다.

초록

정액은 정자 외에도 면역 세포, 미성숙 남성 생식세포, 상피세포, 섬유아세포 등 다른 세포 집단을 포함하는 복잡한 액체입니다. 이 세포들은 이배체 상태를 공유하여 체세포 핵전달(SCNT) 클로닝의 핵 공여자로 적합합니다. 이 세포들을 이용해 생존 가능한 배아와 자손의 생성이 입증되었습니다. 정액에서 이들을 분리하는 효과적인 방법으로는 원심분리 및 삼투압 구배 기법이 있습니다; 그러나 이러한 분리된 세포에서 1차 배양을 확립하기 위해서는 장기간의 시험관 내 배양 기간이 필요합니다. 더불어, 채취된 샘플에는 정자 양이 많아 시험관 내 배양 구축과 유지에 방해가 되었습니다. 현재까지 1차 배양은 신선한 정액 샘플로만 성공적으로 확립되었으며, 냉동 보존 정액을 이용한 시도는 꾸준히 실패해 왔습니다. 이 한계는 냉동 보존 정액 샘플에서 클론을 생성하는 가능성을 크게 제한합니다. 본 연구는 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하기 위한 간단한 미세 흡인 기반 방법론을 제안합니다. 이 방법은 SCNT 클로닝 절차에 즉시 사용할 수 있도록 충분한 수의 세포를 신속하게 회수할 수 있게 합니다.

서론

체세포 핵이식 클로닝은 동물공학적·과학적 관심사가 있는 개체를 구출하고 증식시키는 데 매우 귀중한 도구입니다. 피부, 근육, 육아세포, 림프구, 소변 세포 1,2,3,4 등 수많은 세포주가 핵 기증자로 사용되었습니다. 흥미롭게도, 정액은 클로닝을 위한 핵 공여자로 사용할 체세포(SC)를 수집하는 새로운 대안으로 등장^{했습니다.} 이 발견은 정액만 보존된 개인의 구조에 특히 중요합니다. 그러나 냉동 정액에서 분리된 SCs에서 1차 배양을 구축하는 것은 성공하지 못했으며, 현재까지도 이 출처에서 복제 동물을 얻는 데 있어 주요 장애물로 남아 있다 ^7,8,9. 이 세포들은 아마도 선반 상피와 세뇨관 내막, 정액 분비물, 그리고 중요한 것은 소변에 의한 정액 오염에서 기원할 가능성이 높으며, 후자는 증식이 높고 미분화 전위를 가진 체세포의 잘 알려진 출처입니다^.

정액에서 SC를 분리하는 다양한 방법이 도입되었으며, 여기에는 원심분리⁵, 삼투압 구배^{7, 8}, ¹⁰, 유세포^{측정 11}이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법으로 분리된 체세포는 부착, 성장, 증식을 위한 최적의 조건이 여전히^{필요합니다.} 이러한 세포의 특수적 요구사항은 1차 세포 배양을 확립하기 위해 장기간의 잠복 기간이 필요하므로 시험관 내 배양을 더욱 복잡하게^{만듭니다.} 더불어, 샘플 내 높은 농도의 정자는 이러한 배양의 시작과 유지 모두에 방해가^됩니다.

이전에 설명한 방법과 달리, 이 미세흡입 기법은 여러 가지 명확한 장점을 제공합니다. 크기와 형태를 기준으로 스카이크를 선택할 수 있게^{하며, 생존} 가능한 세포와 비생존 세포 모두에서 핵을 회수할 수 있게 하는데, 이는 냉동 보호제가 없는 냉동 조직¹³과 동결건조 생식 세포 14,15,16에서 성공적으로 입증된 전략입니다. 중요한 점은, SCs가 정액 해동 직후에 사용할 수 있어, 동물 복제에 사용되는 1차 체세포의 장기간 시험관 배양에서 발생하는 배수체 오류 위험을 줄인다는 것이다^17,18. 구체적으로, 이 기술은 말의 정액을 냉동 보존하는 데 중점을 두어, SCNT¹²에 즉시 사용할 수 있는 충분한 수의 SC를 수집할 수 있게 합니다.

마이크로피펫의 제작과 미세 흡인 기술의 발전은 최근 수십 년간 크게 발전했습니다. 이 도구들의 사용은 생식세포, 배아, 그리고 그 세포구조를 정밀하게 조작할 수 있게 하여 생식 생명공학(https://www.jove.com) 분야에서 새로운 가능성을 창출합니다. 미세 조작 기술은 세포 기계적 특성을 평가하고 생리학적 상태에 대한 귀중한 통찰을 제공하지만^(19,20), 이 분야는 아직 비교적 탐구되지 않은 상태입니다.

현재까지 어떤 미세조작 변형 절차로도 정액에서 소카이크를 분리하는 효과적인 기법을 상세히 밝힌 연구는 없습니다. 기존 분리 방법의 한계를 고려할 때, 본 연구는 냉동 보존된 말 정액에서 SC를 분리하기 위한 실용적인 미세 흡인 기반 프로토콜을 제안하여, 채취 후 체세포 복제 절차에 즉시 사용할 수 있게 합니다.

프로토콜

액체 질소에 19년 이상 보존된 냉동 보존 정액 샘플은 멕시코 관련 수의학 당국이 승인한 상업적 유통업체로부터 획득되었으며, 이는 가축 정액의 동물 위생 과정을 규제하는 공식 표준 NOM-027-ZOO-1995를 준수합니다. 사용되었든 분석에 부적합하든 모든 정액 샘플은 기관 생물안전 프로토콜과 관련 규정(여기에는 멕시코 내 생물학적 감염성 폐기물 관리를 위한 NOM-087-ECOL-SSA1-2002 포함)에 따라 비활성화 및 폐기되었습니다. 잔류 불화수소산(HF)은 연기 후드 아래에서 플라스틱 용기에 천천히 옮기고,_CaCO3 또는 Ca(OH)₂를 소량 첨가하여 발화가 사라질 때까지 안전하게 중화하여 불용성 CaF₂를 형성했습니다. 중화된 현탁액의 pH는 현지 규정에 따라 무기 화학 폐기물로 관리되기 전 6에서 8 사이로 확인되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 체세포 분리를 위한 마이크로피펫 바늘 제작

1. 일부 붕규산 유리 모세관(1.0 mm O.D. × 0.78 mm 내경 × 100 mm).
2. 마이크로피펫 풀러를 사용해 끝이 가는 모세혈관을 만들어 보세요. 팁 직경을 조절하기 위해 절단점을 조절하세요.
3. 모세관을 풀러에 넣고 단단히 잠가세요.
4. 마이크로피펫을 조심스럽게 빼서 마이크로포지 위에 수평으로 올려놓으세요.
5. 히터와 마이크로피펫을 현미경 시야 안에 정렬하세요.
6. 접안렌즈 조준선을 사용해 절단 지점을 찾으세요(그림 1A, B).
7. 마이크로피펫 팁을 히터 필라멘트의 유리 구슬에 닿게 하세요.
8. 끝이 비즈에 녹을 때까지 점차 불을 올립니다.
   1. 히터 꺼.
   2. 팁이 비드에 달라붙도록 두고 분리하세요.
      참고: 마이크로피펫을 구부릴 필요는 없습니다; 직선 형태로도 사용할 수 있습니다. 그러나 연산자가 선호한다면 각도를 만들 수 있습니다(그림 1C).
9. 이 단계는 절차에 필요하지 않으니 끝부분을 매끄럽게 하지 마세요.
10. 피펫 팁을 다음 곳에 순차적으로 ~10초씩 담가서 청소하세요:
    1. 20% 불화수소산(HF).
       주의: 불화수소산은 매우 독성이 강하고 부식성이 강합니다. 공급업체가 지정한 개인 보호 장비를 착용하세요. 눈과 얼굴 보호구, 장갑, 실험실 코트 착용을 강조하고, 항상 연기 후드(fume hood) 안에서 작업하세요.
    2. 멸균된 이중 증류수.
    3. 완전 에탄올이야.
       참고: 피펫 팁 세척을 원활하게 하기 위해, 위 용액을 15mL 멸균 코닝 튜브에 준비하세요.
11. 마이크로피펫을 50°C의 오븐에서 건조시킵니다.
12. 마이크로피펫은 멸균 용기에 보관하세요.

2. 미세흡기 설정

1. 마이크로스포메이션 조이스틱이 제어판 중앙에 위치해 있는지 마이크로스포메이션 시스템이 제대로 작동하는지 확인하세요.
2. 오일을 사용하는 시스템의 경우, 공기 방울이 없는지 반드시 확인하세요. 공기 방울은 움직임의 정밀도에 영향을 줄 수 있습니다.
3. 체세포 흡인 마이크로피펫을 조작자의 우세 손에 있는 홀링 매니퓰레이터에 삽입합니다.
   참고: 체세포 채취 중 팁이 막히면 마이크로피펫을 새 것으로 교체하세요.

3. 냉동 보존된 말 정액의 해동 및 희석

1. 액체 질소에서 빨대를 제거하고 10초간 공기에 노출시킨 후 37°C에서 30초간 해동하세요.
2. 첫 번째 정액 희석: 해동된 정액(250 μL)에서 샘플을 채취하고, 1.0mL DMEM/F12 배양지에 10% 태아 소 혈청, 0.1 mg/mL 소 혈청 알부민, 12.5 μM β-머캅토에탄올, 1% 항생제-항균제를 첨가하여 희석합니다.
   1. 혼합물을 37°C에서 30분간 부화하세요.
3. 두 번째 정액 희석: 첫 희석액에서 25 μL을 추출하고, 1x DPBS 975 μL 용량에 0.1 mg/mL 폴리(비닐 알코올)(PVA) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 첨가하여 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 담근 후 부드럽게 섞습니다.
   1. 세포 채집 과정 내내 이 혼합물을 37°C로 유지하세요.

4. SC 수집용 요리 준비

1. 35mm 직경의 배양 접시에서 두 개의 뚜껑을 사용해 SC를 채취합니다.
2. 첫 번째 뚜껑은 다음과 같이 준비하세요(뚜껑 #1, 그림 2A).
   1. 두 번째 정액 희석액 100 μL을 가져와 뚜껑 중앙에 보관합니다( 그림 2A 참조).
   2. 첫 번째 드롭 위에 1x DPBS를 0.1 mg/mL PVA 또는 PVP를 보충한 두 번째 마이크로드롭(10 μL)을 만듭니다( 그림 2A 참조).
   3. 두 마이크로드롭 모두 파라핀 오일로 완전히 덮어 증발을 방지하고 SC의 흡인 시 온도 안정성을 유지하세요.
3. 두 번째 뚜껑을 준비하여 세포 잔해와 동반되는 정자를 제거하세요(뚜껑 #2, 그림 2B).
   1. 30-50 μL 용량의 1x DPBS와 0.1 mg/mL PVA 또는 PVP를 3방울 눈꺼풀 중앙에 놓으세요; 미네랄 오일로 덮지 마세요.
      참고: 이 배양 접시는 공기 노출로 인해 DPBS 용액의 물리화학적 특성 변화를 방지하기 위해 모든 체세포가 선별된 후에만 준비하십시오.
4. 모든 미세 흡입 과정을 거꾸로 현미경으로 실온에서 수행하세요. 갑작스러운 온도 변화를 피하세요.

5. 냉동 보존된 말 정액에서 SC를 분리하기 위한 미세흡인 절차

1. 첫 번째 뚜껑(뚜껑 #1, 그림 2A)을 현미경 스테이지에 올려놓고 SC를 채취할 준비를 합니다.
2. 적절한 직경의 마이크로피펫을 선택하여 SC를 채취하여 기계식 흡입 시스템에 연결하세요.
3. 마이크로피펫을 조심스럽게 마이크로드롭에 넣고 접시 뚜껑 바닥과 정렬하세요. 피펫이 배양지를 흡입한 후에는 개별 SCs 포집을 시작하세요.
4. 접시 바닥에는 다양한 세포 형태가 보여야 합니다(그림 3).
5. 마이크로피펫 팁을 각 SC 옆에 위치시키고 음압 상태에서 흡입하세요. 크기와 상관없이 모든 원형 및 길쭉한 세포를 흡입하세요. 흡입 볼륨은 SC 캡처마다 다릅니다.
6. 10개의 세포를 포획한 후, 위에 위치한 마이크로드롭(10μL)에 투입합니다(그림 2A). 복제 실험에 필요한 SC 수를 얻을 때까지 이 과정을 반복합니다.
7. 수집 과정 내내 이 마이크로드롭 내에 포획된 모든 체세포를 보관하세요.
8. 복제에 필요한 수의 SC가 확보되면, 마이크로드롭을 사용해 수반된 정자, 세포 잔해, 미생물 오염물질을 제거하는 간단한 세척 절차를 수행합니다.
9. 두 번째 접시 뚜껑을 가져와 SCs(뚜껑 #2, 그림 2B)를 순차적으로 3단계 세척합니다:
   1. 체세포를 마이크로피펫으로 포집하여 첫 방울 표면에 조심스럽게 부착하세요. 3-5분 정도 가라앉게 두세요(그림 2B; 드롭 #1).
   2. 5.9.1 단계를 반복한 후 두 번째 드롭에 투입합니다(그림 2B; 드롭 #2).
   3. 5.9.1 단계를 반복하고 체세포를 세 번째 방울에 배치합니다(그림 2B; 드롭 #3).
10. 마지막 단계로, 분리된 체세포를 체세포 핵전달 절차에 사용할 최종 마이크로드롭에 침착시킵니다(그림 4D).
    참고: 재포획 시 정자, 이물질, 미생물 오염물질을 최소화하기 위해 가능한 한 작은 중간 부피로 SC를 흡입하세요.

결과

표 1은 미세 흡인 기법이 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 효율적으로 회수하며, 세 마리의 종마에서 시간당 317.7± 9.60에서 424.7 ± 33.65 세포/시간 포획 속도를 보여줍니다. 종마 #03은 장기 보관 샘플에서도 이 방법의 효과가 입증되어 가장 높은 수확량을 보였습니다. 데이터는 이 기술이 정액에서 체세포를 일관되고 효과적으로 분리하며, 평균 포획률과 표준편차가 효율과 일관성을 정량적으로 측정하여 체세포 핵 이식에 적용할 수 있음을 보여줍니다.

각 체세포 분리는 큰 흡인 힘이 필요하지 않았으나, 일부 세포는 과정 중 마이크로피펫 끝에 부착하는 경향이 있었다. 조작 과정에서 관찰된 특징 중 하나는 분리된 세포의 강성과 낮은 변형성이었습니다.

토론

세포와 생식세포의 미세 조작은 복잡한 보조 생식 기술을 단순화할 수 있게 했습니다. 예로는 Hand Made Cloning²¹에 의한 체세포 복제, 보조 부화²², 세포질 내 정자 주입(ICSI)²³, 접합자²⁴의 원핵 미세주사 등이 있습니다.

정액에서 체세포를 분리하는 효과적인 방법 개발은 현대 동물 번식 기술에 매우 귀중한 도구입니다. 그러나 많은 생물학적 측면이 아직 알려지지 않았으며, 여러 기술적 요인들이 체세포 복제와 같은 생명공학에서 이러한 세포의 사용을 계속 제한하고 있습니다. 이전에 보고된 원심분리⁵ 또는 삼투압 구배 ^7,8 기반 분...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2 베타 머캅토에탄올	시그마	M7522	체세포 배양
1개의 DPBS	GIBCO	참조번호-21600010	체세포 조작
절대 에탄올	하이셀	엘 크리솔 50181-1L73	피펫 제작을 위해
항생제-항흡입제 100배	인비트로 SA. 사랑스럽고; 시코		체세포 배양
붕규산 모세혈관 (1.0 mm 길이 및 시간; 0.78 mm 내경 및 시간 길이 100 mm)	하버드 어퍼퍼러스, 미국	EC1-30-0035	피펫 제작을 위해
BSA	시그마	A3311	체세포 배양
DMEM/F12 중간 크기	GIBCO	참조-12500-062	체세포 배양
말 냉동 보존 정액 샘플			냉동 보존된 정액 샘플은 상업용 유통업체로부터 입수했으며, 액체 질소에 19년 이상 보존되어 있었습니다. 모든 냉동 말 정액 샘플은 멕시코 관련 수의학 당국이 승인한 상업적 유통업체로부터 획득되었으며, 이는 멕시코 공식 표준 NOM-027-ZOO-1995, 가축 정액의 동물 위생 과정에 따른 것입니다.
접안렌즈 조준점		피펫 제작용 도구	필수 장비
태아 소 혈청	GIBCO	참조번호-26140-079	체세포 배양
하이드로플루산산	시그마-올드리치	339261	피펫 제작을 위해
역광현미경	이클립스, TE 200	니콘	체세포 미세조작
실험실 및 nbsp; 드라이 오븐		피펫 제작용 도구	필수 장비
마이크로포지		피펫 제작용 도구	필수 장비
역현미경용 마이크로매니퓰레이터 세트		세포의 미세 조작	필수 장비
마이크로피펫 풀러	P-97, 서터 계기	피펫 제작용 도구	다음 설정을 사용하세요. 열기: 720; 풀: 30; 속도: 50; 시간: 220; 압력
광유	시그마	M8410	체세포 조작
Nunclon  세포 배양 접시, 직경 및 시간; H 35 mm & 시간; 10mm	눈클론	눈 153066
PVA	시그마	P8136	체세포 배양
PVP	시그마	P5288	체세포 배양
트리판 블루 용액 0.4%	GIBCO	심판- 15250061	세포 염료