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방법 논문

종양 관련 대식세포 시험 관 모델링: 종양 미세환경 역학에서 분비 인자의 역할

453 조회수

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DOI:

10.3791/69406

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2025년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

이 논문에서

요약

이 논문은 인간 단핵구를 종양 세포주에서 나온 조건화된 배지에 노출시켜 종양 관련 대식세포 유사 세포를 생성하는 시험관 내 프로토콜을 제시합니다.

초록

대식세포는 놀라운 가소성을 보여, 다양한 환경 신호에 반응하여 뚜렷한 기능 상태를 획득할 수 있습니다. 고형 종양에서는 종양 미세환경 내에서 가장 풍부한 면역 세포 집단을 자주 차지하며, 이를 종양 관련 대식세포(TAM)라고 부릅니다. TAM은 악성 세포와 밀접하게 상호작용하여 종양 진행, 혈관형성, 면역 회피를 적극적으로 촉진합니다. 종양 세포는 직접 세포 간 접촉과 다양한 분비 인자를 통해 대식세포를 재프로그래밍하여 종양 친화적 표현형으로 분극을 형성합니다. 이러한 TAM 분극 메커니즘을 시험관 내에서 연구하기 위해, 우리는 인간 단핵구를 종양 세포주 조건 배지 내 수용성 인자에 노출시키는 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 통제된 조건 하에서 TAM 유사 대식세포를 생성할 수 있게 하여, 종양 유래 신호에 의해 유발된 표현형 및 기능 변화 분석을 용이하게 합니다. 우리의 접근법은 종양-대식세포 상호작용을 연구할 재현 가능하고 생리학적으로 적합한 모델을 제공하며, 대식세포 재프로그래밍에 대한 이해를 심화시키고, 암 면역학 및 면역치료 분야의 새로운 치료 전략 연구를 지원합니다.

서론

대식세포는 환경 신호에 반응하여 다양한 표현형을 채택할 수 있는 놀라운 가소성 덕분에 다기능적인 선천 면역 세포입니다. 고형 종양 내에서 대식세포는 종종 가장 풍부한 면역 세포 집단이 되어 종양 관련 대식세포(TAM)로 분화합니다2. 이 세포들은 종양 미세환경에 의해 종양 성장을 지원하고, 혈관신생을 촉진하며, 전이를 촉진하고, 효과적인 항종양 면역 반응을 억제하기 위해 적극적으로 재프로그래밍됩니다. 종양 세포는 직접 세포 간 상호작용과 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 등 분비 인자들의 복잡한 레퍼토리를 통해 이 분비를 유도하여 대식세포 전사 및 기능 프로그램을 재형성합니다. 이러한 역동적 상호작용은 TAM이 암 생물학에서 중심적 역할을 하는 것을 뒷받침하며, 대식세포 가소성이 치료 개입의 도전이자 기회임을 강조합니다2.

TAMs의 임상적 중요성은 점점 더 인식되고 있습니다: 종양 내 TAM의 풍부함은 종종 예후가 좋지 않고 치료에 대한 저항성과 상관관계가 있습니다 4,5. 그 결과, TAMs6은 매력적인 치료 표적으로 부상했습니다. 이들의 모집을 차단하거나 생존을 억제하거나 염증성 및 종양 파괴성 표현형으로 재프로그래밍하는 전략이 현재 연구 중이다6. 따라서 종양 유래 인자가 대식세포를 TAM으로 극극화하는 메커니즘을 이해하는 것은 효과적인 면역요법 개발에 필수적입니다. 면역 체크포인트 차단법은 많은 암에서 큰 성공을 거두었지만, 다른 암에서는 그 효능이 제한적입니다. 항프로그램세포사결단백질 1(PD-1) 또는 항프로그램세포사멸리간드 1(PDL-1) 항체와 같은 T 세포 표적 치료제와 대식세포 재프로그래밍 전략을 결합하면 전반적인 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있습니다.

TAM 생물학을 연구하는 전통적인 실험 모델에는 생체 내 쥐 암 모델이 포함되었으며, 이는 복잡하고 생리학적으로 중요한 환경을 제공합니다8. 이 모델들은 TAM 채용과 기능에 대한 근본적인 통찰을 제공했습니다. 그러나 면역 신호, 종양 생물학, 대식세포 발생 현상에서 상당한 종 간 차이가 있어 인간 질병으로의 직접적 번역을 제한할 수 있습니다 9,10. 더불어, 생체 내 시스템의 복잡성 때문에 대식세포 분극을 유발하는 특정 신호 전달 경로나 분자 사건을 분리하고 연구하는 것이 어렵습니다.

반면, 시험관 내 모델은 이러한 메커니즘을 해부할 수 있는 더 단순하고 통제된 조건을 제공합니다. 가장 널리 사용되는 방법은 인간 단핵구 유래 대식세포를 특정 자극으로 분극시키는 것입니다: 인터페론 감마(IFN)와 박테리아 지질다당(LPS)을 통해 촉진염증성 대식세포(M1)를 생성하거나, 인터루킨 4(IL-4)와 인터루킨 10(IL-10), 또는 덱사메타손을 통해 다양한 항염증 대식세포(M2) 아형을 생성합니다 11,12,13,14. 이 모델들은 정통 대식세포 분극 상태와 관련된 분자 표지자와 전사 프로그램을 규명하는 데 도움을 주었습니다. 그럼에도 불구하고, 이들은 종양 내에서 대식세포가 마주하는 복잡하고 다인자 환경을 재현하지는 못하는데, 여기서 분극은 수많은 용해성 매개체, 대사 신호, 세포 간 상호작용의 동시 영향으로 발생합니다15,16. 고전적인 M1/M2 분류법이 대식세포 기능 상태를 설명하는 데 여전히 유용하지만, 이전보다 훨씬 더 많은 대식세포 집단이 존재한다는 것이 이제 명확해졌습니다. Dr. Ginhoux 연구팀과 다른 연구자들의 단세포 전사체 접근법을 통해 생리학적 조건과 질병 내에서 발견되는 대식세포 소집합의 폭넓은 다양성을 입증했습니다17,18. 이는 TAM이 종종 M2 유사 프로필로 묘사되지만, 정준 사이토카인만으로 분화된 대식세포와 엄밀히 동일하지는 않다는 점을 강조합니다; 오히려 특정 특징을 공유하지만 동시에 구별적이고 맥락에 따라 차이를 보이기도 합니다.

이 격차를 메우기 위해, 우리는 종양 세포주에서 수집한 조건화된 배지를 인간 단핵구 유래 대식세포에 노출시켜 TAM 유사 분극을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 암세포가 분비하는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자가 풍부한 혼합물인 종양 분비체의 영향을 포착합니다. 따라서 종양에서 유래한 용해성 인자에 반응하는 대식세포의 표현형 및 전사 재프로그래밍을 연구할 수 있는 관련성 있고 실험적으로 접근 가능한 시스템을 제공합니다. 단핵구를 종양 조건 매질에 직접 노출시킨 이전 접근법과 달리, 이 프로토콜은 대식세포의 재프로그래밍에 중점을 두어 종양 미세환경 내 거주 대식세포의 행동을 더 잘 반영합니다19,20. 또한, 유세포분석을 통해 대식세포 분극을 평가할 수 있는 최적화되고 직관적인 표면 표지 패널을 통합하여, 구현이 쉽고 연구자의 필요에 따라 확장할 수 있습니다14,21. 마지막으로, M-CSF가 단핵구를 M2 유사 표현형 10,15,22,23,24로 유도하는 것으로 나타났기 때문에, 관측된 대식세포 분극이 종양 세포주 유래 조건 배지 노출에 특이적으로 의해 발생하는지 확인하기 위해 의도적으로 생략했습니다.

이 접근법은 여러 가지 강점을 가지고 있습니다: 시험관 내 시스템의 재현성과 단순성을 유지하고, 더 높은 번역적 관련성을 위해 1차 인간 세포를 사용하며, 단일 사이토카인 모델보다 종양 미세환경의 이질적이고 다인적인 특성을 더 잘 반영한다는 점입니다 25,26,27,28. 더불어, 다양한 종양 유형이나 유전자 변형 암세포의 조건 매지에 대한 대식세포 반응 비교 연구를 촉진하며, TAM 분극을 변화시킬 수 있는 약리학적 약물을 시험하는 플랫폼 역할을 합니다. 일반적인 적용 외에도, 이 방법은 적절한 세포주를 선택하거나 조건부 배지의 비율을 조절하여 다양한 종양 모델에 맞게 조정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 사용자는 건강한 기증자와 종양 세포주 간의 변동성이 재현성에 영향을 미칠 수 있음을 인지해야 하며, 이는 신중한 실험 설계와 표준화의 중요성을 강조합니다.

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프로토콜

헬싱키 선언에 따라 건강한 기증자로부터 사전 동의 후 말초혈액 샘플을 채취하였습니다. 이 프로토콜은 부에노스아이레스 대학교 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료와 시약에 대한 자세한 내용은 재료표 를 참조하십시오.

참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지하며, 생물안전 레벨 2(BSL-2) 캐비닛에서 작업하고 세포 생존율을 90%> 보장하세요. 폐기물 처리 시 모든 생물학적 폐기물은 먼저 10% 차아염소산나트륨 용액에 최소 30분간 담가 오염 제거를 한 후 적절한 생물학적 위험 처리 용기에 보관해야 합니다.

1. 종양 세포주 배양 및 컨디셔닝 배지 준비

  1. MDA-MB-231 삼중음성 인간 유방암(또는 기타 선택된 종양) 세포주를 액체 질소 저장에서 해동합니다. 즉시 세포주가 담긴 냉동관을 37°C 물에 담그고 부드럽게 휘저어 빠르고 균일한 해동을 보장합니다. 대부분 해동되면 즉시 바이알을 꺼내세요.
  2. 해동된 세포를 5mL 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)가 들어 있는 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 셀 현탁액을 400 × g 에서 실온(RT)에서 5분간 원심분리합니다.
    참고: 해동 과정은 세포의 생존력을 유지하기 위해 신속히 진행되어야 합니다.
  3. 상정액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 신속히 1mL의 신선한 완전 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 재현탁하세요. 이 배지에는 고혈당(4.5 g/L)과 10% 태아 소 혈청(FBS), 4 mM 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨이 들어 있습니다. 재현탁된 펠릿 내 셀 수를 세고, 다음과 같은 2단계 연속 희석을 수행합니다:
    1. 먼저 멸균된 DMEM 배지에 1:5 세포 현탁액을 희석한 후, 생존 염색 트리판 블루(Trypan Blue)와 함께 (1:2)를 사용해 최종 1:10 희석을 얻습니다.
    2. 노이바우어 혈구계(또는 카운팅 챔버) 내에서 생존 가능한 세포를 세기 위해 광학 현미경을 사용하세요. 생존 가능한 세포(파란 염료를 제외한 세포만)를 세고, 큰 모서리 칸당 평균 생존 가능한 세포 수를 계산합니다.
    3. 최종 농도를 계산하려면 다음 공식을 사용합니다: Cells/mL = (평균 세포 1제곱) x (희석 계수) x 10,000.
      참고: 최종 농도인 1x 105cells/mL를 얻기 위해 원하는 부피의 완전한 DMEM 배지에 세포를 재현탁하세요.
  4. 2.5 x 10 5에서 5.0 x 105 세포를 5mL 완전 DMEM 배양지를 포함한 T25 배양 플라스크에 씨앗을 넣습니다. 5%CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양물을 유지하여 수확에 필요한 세포 밀도에 도달할 때까지 유지합니다.
  5. 씨앗을 뿌린 다음 날, 현미경으로 세포 부착 상태를 확인하세요. 세포의 50% 이상이 떠 있다면(세포 사멸을 의미), 오래된 배지를 부드럽게 흡인하고 신선하고 예열한 배지 2.5mL로 교체하세요.
  6. 세포 성장을 매일 모니터링하세요. 배양이 약 90% 합류(추정 2.3 x 106 세포 내 T25 플라스크)에 도달하면, 보통 5일 이내에 세포가 분리(subcultureing)될 준비가 됩니다. 셀을 1:8 비율로 나누려면 다음 단계를 따르세요:
    1. 사용한 배지를 멸균 파스퇴르 피펫으로 제거하세요.
    2. 세포 단층을 멸균 1x PBS 3mL로 한 번 헹구어 트립신을 억제하는 잔류 혈청을 제거하세요. 흡입 후 PBS 1회 폐기하세요.
    3. 세포에 0.25% 트립신-1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 용액 1mL를 추가하고, 37°C, 5%CO2에서 가습 인큐베이터에서 3분간 배양하여 세포를 분리합니다.
      참고: 트립신/EDTA의 최적 잠복 시간은 특정 세포주에 따라 다르며, 조정이 필요할 수 있습니다. 3분 후 세포를 현미경 아래에서 확인하여 완전히 분리되었는지 확인하세요.
    4. 3mL의 완전한 DMEM 배지를 첨가하여 효소 활성을 중화합니다. 즉시 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 완전히 분리하고 떠 있게 하세요.
  7. 세포 현탁액 3.5mL를 15mL 원뿔관에 옮기고, 400 x g RT에서 5분간 원심분리합니다.
  8. 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 냉동 배지(반드시 90% FBS와 10% 디메틸 설폭증(DMSO)를 포함해야 함)에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 크라이오비알에 옮기고 분할 배치하여 향후 사용을 위해 튜브당 5 x 105 셀 농 도를 확보합니다.
    1. 냉동은 미스터 프로스티(Mr. Frosty)나 유사한 제어 속도 냉동 용기에 넣어 점차 냉각해야 합니다. 용기를 -80°C 냉동고로 옮기고 셀을 하룻밤 동안 냉동시키세요. 세포는 -80°C에서 며칠간 보관할 수 있지만, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겨야 합니다.
      참고: 세포 통과 기록을 상세히 보관하고 초기 통과를 실험에 활용하세요. 20개 미만의 통로를 가진 세포를 사용하는 것이 권장됩니다.
  9. 새로운 배양물이 다시 ~90% 합류율에 도달하면, 15mL 원뿔형 튜브에 상청액을 흡입하고 채취합니다. 배양을 계속 진행하고 싶다면, 수집된 볼륨을 새로운 완전한 DMEM 매체로 교체하세요.
    1. 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거하고 펠릿으로 제거합니다. 상청액(정화된 조건 매체)은 보관하고 펠릿은 버리세요.
  10. 정제된 가공 배지를 1mL 단위로 나누어 튜브에 라벨을 붙인 뒤, -20 °C에서 보관하여 사용 시까지 보관합니다.
    참고: 품질 관리를 위해 조건 매체 채취 날짜와 알리코트가 이전에 해동되었는지 항상 기록하세요. 같은 알리코트를 두 번 이상 해동하는 것을 강력히 권장하지 않습니다. 또한, 얼음 날짜로부터 한 달 이내에 컨디셔티드를 사용해 최적의 활성을 유지하세요.

2. 말초혈 단핵세포(PBMC) 분리

참고: PBMC는 3.8% 시트레이트나트륨으로 항응고된 말초혈 40mL에서 분리됩니다. 분리는 Ficoll-Hypaque 밀도 구배(1077)와 원심분리를 사용하여 수행됩니다. 이 전체 프로토콜은 BSL2 캐비닛 내에서 멸균 조건에서 수행되어야 합니다.

  1. 항응고가 된 말초혈 샘플을 15mL 또는 50mL 원뿔관 안에 넣어 원심분리 단계에 들어가세요.
  2. 혈액 성분을 분리하기 위해 200 × g을 저속으로 15분 RT 상태로 원심분리합니다. 이 과정은 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 최상층으로, 그 아래 세포 분획(적혈구와 백혈구)을 생성합니다. 최대 5일 때 원심분리기 설정은 가속 4, 감속 2를 사용하세요.
  3. 원심분리 후 상청액(상부 분획)인 PRP를 흡인하여 새로운 멸균관으로 옮깁니다.
    참고: 후속 실험에 필요한 경우, 수집된 PRP를 600 × g RT 에서 10분간 원심분리하여 혈소판을 제거할 수 있으며(최대 가속 및 감속) 혈소판을 제거하고, 다른 분석에서는 혈소판 없이 혈장을 -20°C에 보관할 수 있습니다.
  4. 2단계에서 초기 원심분리에서 얻은 세포 하부 분획은 멸균 상온에서 1x PBS를 사용해 최종 부피의 2배에서 3배 정도로 부드럽게 희석해야 합니다. 생성된 현탁을 반전시켜 부드럽게 균질화하여 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 사용합니다.
  5. 상온 Ficoll-Hypaque 15mL를 멸균된 50mL 튜브에 투여합니다.
  6. 희석된 혈액 30mL를 피콜-하이파크 위에 조심스럽고 천천히 층층이 쌓아 두 상이 섞이지 않도록 합니다.
  7. 피콜-블러드 층 튜브를 600 × g에서 25분간 원심분리합니다. 브레이크 없이 원심분리기를 설정하세요 (가속도: 1; 감속: 0).
  8. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용해 얻은 상단 분획 중 최소 4mL를 버려 흘러나가지 않도록 하세요. 그 후 같은 피펫을 사용해 상부 분획과 피콜-하이파크 투명 분획 사이에 형성된 PBMCs가 포함된 흰색 고리를 회수합니다. PBMC 반지로 피콜을 수집하는 것은 피하세요.
  9. PBMC 링을 튜브에서 멸균된 15mL 원심분리관으로 옮기고, 최소 3mL 이상의 1x PBS가 들어 있습니다.
  10. 15mL 튜브에 1배 PBS를 더 채우고 600 × g (최대 가속 및 감속)에서 원심분리기를 10분간 RT로 가열합니다.
  11. 상원액을 반전으로 제거하고, 다시 1x PBS를 채운 후 600 × g (최대 가속 및 감속)에서 10분간 RT 원심분리합니다.
  12. 상원액을 제거하고 PBMC 펠릿을 멸균 1x PBS와 2% 열로 비활성화된 FBS(1x PBS-2% FBS)가 섞인 2에서 3 mL에 재현탁한 후 부피를 10 mL로 올립니다. 세포를 세어 멸균 냉각 1x PBS에 희석한 1:5 세포 현탁액을 만든 후 0.4% 트라이판 블루에 (1:2) 섞어 최종 1:10 희석액을 얻습니다. 1.3.2단계에서 설명한 것처럼 광학 현미경의 세포 챔버를 사용하여 계수합니다.
  13. PBMC 서스펜션을 300 × g 에서 8-10 °C에서 5분간 돌려 내립니다. 세포를 원하는 부피의 무균 차가운 1x PBS-2% FBS에 재현탁하여 최종 농도인 108 cells/mL를 얻습니다. 다음 단계까지 이 세포들을 4 °C에 두세요.
    참고: 이 시점에서 채취된 PBMC는 108 셀/mL의 냉동 배지(90% FBS-10% DMSO)에서 냉동 바이알에 냉동 보존할 수 있습니다. 세포가 천천히 얼도록 하기 위해 -80°C에서 Mr. Frosty 용기에 하룻밤 보관하세요. 다음 날에는 세포를 저장 상자에 옮기고 -80°C에서 며칠간 두거나, 액체 질소 탱크로 옮겨 장기간 보관하거나 프로토콜을 계속하세요.

3. CD14+ 단핵구 분류 자기 구슬을 이용한

참고: 정제된 CD14+ 단핵구는 인간 CD14+ 양성 선택 자기 분류 키트11을 사용해 PBMC에서 얻습니다. PBMC에서 CD14+ 세포 비율은 기증자에 따라 다르지만, 약 10%(5-20% 범위)로 추정할 수 있습니다. 실험에 필요한 단핵구 수에 따라 초기 PBMC 수와 최종 반응 부피를 조정하세요. 권장되는 최소 반응량은 1 × 107 PBMC 보다 적을 때도 100 μL입니다.

  1. PBMC 100μL 1개당 양성 선택 칵테일 10 μL을 추가하고, 피펫을 위아래로 돌린 후 15분간 얼음 위에 보관합니다.
  2. 사용 전에 30초 동안 구슬 서스펜션을 소용돌이로 돌리세요. 그 다음 100 μL PBMC 현탁액에 10 μL 비즈를 추가합니다. 잘 섞고 얼음 위에 15분간 부화시키세요.
  3. 최종 부피 2.5 mL에 PBS-2% FBS -1 mM EDTA 1x를 추가하고, 부드럽게 현탁액을 섞은 후 튜브를 자석에 삽입하고 5분간 배양합니다.
  4. 자석을 (튜브를 빼지 않고) 버려진 수신관 위에서 2-3초 동안 뒤집어 흔들림을 피하세요. 양성 세포는 튜브 안에 남게 됩니다.
  5. 튜브를 자석에서 분리하고 튜브 벽 위에 1개의 PBS- 2% FBS -1 mM EDTA를 넣어 최종 부피가 2.5mL가 되도록 합니다.
  6. 튜브를 다시 자석에 넣고 5분간 배양하세요.
  7. 자석을 (튜브를 빼지 않고) 버려진 수신관 위에서 2-3초 동안 뒤집어 흔들림을 피하세요. 자석에서 튜브를 꺼내 튜브 벽 위에 1x PBS-2% FBS 3mL를 넣어 모든 세포를 회수합니다.
  8. 노이바우어 챔버 내 CD14+ 세포 수를 광학 현미경으로 세기 위해 10 μL을 사용하세요. 트라이판 블루 1:2로 희석하세요.
    참고: 다음 식에 따라 세포 수를 계산하세요: CD14+ 세포 수 = 배지 사분면당 생세포 수 x 희석 계수 x 10.000.
  9. CD14+ 세포 현탁액을 새로운 멸균 15mL 튜브에 넣고, 4°C에서 600× g (최대 가속 및 감속)에서 10분간 원심분리하여 세포를 세척합니다.
  10. CD14+ 세포를 RPMI 1640 배지에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 완전배지를 보충하여 적절한 부피로 재현탁하여 다음 단계에 필요한 2.5 x 106 세포/mL를 얻습니다.
    참고: CD14+ 단핵구는 다음 단계까지 얼음 위에 보관하여 이 세포들이 플라스틱 튜브 벽에 부착되는 것을 방지하세요.

4. 대식세포의 분화

  1. 플레이트를 정제한 CD14+ 단핵구를 2.5 x 105 세포의 5세포 크기로, 48웰 처리판에서 250 μL 완전 RPMI 배지(10% FBS-1% PS)에 매 웰에 현탁했습니다.
    참고: 96웰 처리된 플레이트의 세포 수만 절반으로도 가능합니다.
  2. 판 인큐베이션 중 증발을 줄이기 위해 주변 빈 우물에 멸균수를 추가하세요.
  3. 가습 인큐베이터에서 5% CO₂를 사용한 37°C에서 5일간 세포를 교란 없이 배양하며, 형태, 분화 및 생존 가능성을 매일 모니터링합니다.
    참고: 분별을 위해 M-CSF(25 ng/mL)를 추가할 수 있지만, 저희 프로토콜은 5일간의 배양 후 M0 대식세포를 얻기 위해 10% 고품질 FBS만 사용한다는 것을 확인했습니다. 특히 단핵구를 M2 유사 표현형으로 유도할 수 있기 때문에 M-CSF는 피할 것을 권장합니다10,22.

5. 대식세포의 조건 매체 노출 및 분석

  1. 분화 5일째에는 각 웰에서 매질의 50%(125 μL)를 부드럽게 제거하고 다음 중 하나로 교체합니다:
    1. 125 μL 신선한 RPMI 완전 배지(대조군),
    2. 125 μL 종양 세포주 조절 배지(예: MDA-MB-231 유래), 또는
    3. 125 μL DMEM 완전 배지(조절 배지 대조).
      참고: 새로운 종양 세포주에 대한 초기 최적화를 위해 다양한 조절 배지 농도(예: 10%, 25%, 50%)를 테스트하십시오. 이 범위는 대식세포의 생존성과 분화 변화를 보장하기 위해 권장됩니다. 높은 대식세포 생존성을 보이는 조건 조절 배지를 선택하세요.
  2. 7일째까지 부화를 계속하세요.
    참고: 5일째에는 M0 대식세포를 얻고, 그 후 조건화된 배지 환경에서 2일간 더 배양하면 표면 편광 표지의 발현이 유도됩니다. 편극 표면 마커는 유세포분석으로 결정되며, 표준화된 사이토카인을 사용해 M1 또는 M2 대식세포를 생성할 때도 마찬가지입니다11,14.
  3. 매일 현미경으로 대식세포 생존 능력과 형태를 평가하세요.
    참고: 7일 배양 기간 동안 매일 대식세포 분화를 모니터링하세요. 세포 부착 여부는 건강하고 생존 가능한 배양의 지표로 사용됩니다. 방추형 세포의 비율이 높을수록 조건 배지(CM) 처리군에서 분화와 분극이 증가함을 나타내며, 이는 그림 2에서 볼 수 있습니다.

6. 유세포분석을 통한 분극 마커 평가를 위한 대식세포 채취

참고: 종양 관련 대식세포의 표현형 특성을 추가로 확장하기 위해, RNA를 분리하여 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)을 통해 분극 관련 유전자(예: TGM2, IRF-4, CXCL10)의 발현을 측정하거나,11그룹이 보고한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 표준 사이토카인 생산(예: TNFα, IL-6, IL-10)을 측정하기 위해 배양 상원액을 수집할 수 있습니다. 14.

  1. 각 웰의 총 배양 배양액을 멸균 파스퇴 피펫 또는 팁으로 부드럽게 흡입하여 폐기하고, 세포 채취를 위해 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA 버퍼 200 μL 차가운 버퍼를 추가합니다.
  2. 얼음에서 10분에서 15분간 배양한 후 1x PBS-2% FBS 200 μL 첨가하여 EDTA 버퍼를 희석합니다. 대식세포를 피펫팅으로 위아래로 5분 더 채취해 모든 세포가 분리될 때까지 계속 섭취하세요.
    참고: 이 단계는 생존 가능한 대식세포를 충분히 확보하는 데 매우 중요합니다. 세포 생존력을 유지하기 위해 권장 이상으로 EDTA 노출 기간을 늘리지 않는 것이 중요합니다. 시술 후 현미경 아래 세포를 확인하여 완전히 분리되어 있는지 확인하세요.
  3. 1.5mL 마이크로튜브에 대식세포를 채취한 후, 1x PBS-2% FBS 1mL로 400 × g에서 원심분리하여 8-10 °C에서 5분간 세척합니다.
  4. 대식세포 펠릿을 1x PBS-5% FBS 200 μL 용량으로 재현탁한 후, RT에서 비특이적 차단을 위해 96웰 둥근바닥 마이크로플레이트로 옮깁니다. 셀을 400 x g 에서 8-10 °C에서 5분간 원심분리합니다.
  5. 플레이트를 빠르게 뒤집어 상청액을 버리세요.
  6. 각 항체마다 1:50 희석 인자를 사용하여 1x PBS-2% FBS에 적절한 직접 접합 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플을 항체 혼합물 50 μL로 염색한 후 얼음 위 어두운 곳에서 30분간 배양합니다.
    참고: 항체 혼합제: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL), CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). 사전 유도된 항체 농도는 표 1에 나와 있습니다; 카탈로그 번호는 재료표에서 확인할 수 있습니다.
  7. 염색된 대식세포를 150 μL 1x PBS를 첨가하고 400 × g 에서 원심분리기를 8-10 °C에서 5분간 세척합니다.
  8. 플레이트를 빠르게 뒤집어 상청액을 버리세요.
  9. 세포 생존 가능성을 측정하기 위해 고정 가능한 생존 염소인 Zombie Violet 100 μL (1:1,000 비율, 1x PBS)를 추가하고 얼음 위에서 어두운 곳에서 30분간 배양합니다.
  10. 염색된 세포를 세척하여 1x PBS 100 μL 주입을 추가하고, 400 x g 에서 8-10 °C에서 5분간 원심분리합니다. 200 μL 1x PBS를 사용해 세척 과정을 반복하세요.
  11. 세포 펠릿을 20μL의 신선한 1% 파라포름알데히드로 재현탁한 후 얼음과 어둠 속에서 20분간 배양하여 정착합니다.
    참고: 고정에는 1% 파라포름알데히드가 사용되었으며, 투과성 없이. 선택 사항: 상업용 고정제(BD 고정제/투과성 키트의 제품)도 이11단계에 사용할 수 있습니다.
  12. 180 μL 1x PBS-2% FBS를 첨가하고 400 x g 에서 8-10 °C에서 5분간 원심분리하여 셀을 세척합니다. 세척 과정을 1x PBS-2% FBS 200 μL 사용으로 반복합니다.
  13. 상청액은 판 역전으로 폐기하고, 1x PBS 200 μL 용량에 펠릿을 재현탁하여 유동 세포 측정 장비로 가져갑니다.
    참고: 염색 및 고정 샘플을 같은 날 유세포 검사로 검사할 수 없을 경우, 4 °C에 보관하고 빛을 차단하세요. 다음 며칠 동안 가능한 한 빨리 샘플을 분석하세요.
  14. FlowJo 소프트웨어를 사용해 유세포 분석 결과를 분석하세요. 게이팅 전략은 전방 및 측면 산란(FSC/SSC)을 이용해 잔해를 제외하는 것으로 시작합니다. 그 후 살아있는 대식세포를 CD11b⁺ 좀비 바이올렛 세포 로 선택합니다.
    참고: 대식세포의 자가형광은 기증자에 의존하기 때문에 각 실험마다 동일한 기증자로부터 도출된 대조군을 사용하는 것이 필수적입니다.

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결과

MDA-MB-231 세포주에서 50% 조건화된 배지(CM)를 사용해 단핵구 유래 대식세포를 처리하여 삼중음성 유방암 종양 관련 대식세포(TAM) 유사 세포를 생성했습니다. 단핵구는 6명의 독립적인 건강한 기증자의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 분리되어 프로토콜에 따라 분화되었습니다. CM 제제는 90% 합류율의 MDA-MB-231 세포를 사용했습니다(그림 1). CM은 5일째에 대식세포 배양에 추가되었고, 세포는 7일째에 채취되었습니다. 그림 2는 CM 유제 및 무단 7일차 세포의 형태를 보여주며, 방추형 세포 비율이 높으면 CM 처리 세포에서 분화와 분극이 증가함을 나타냅니다. 편광 상태는 유세포 검사와 표면 마커 패널 CD206, HLA-DR, CD64, CD163을 사용하여 명확히 정량되었습니다.

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토론

여기서 설명하는 프로토콜은 인간 단핵구 유래 대식세포를 종양 세포주 조절 배지에 노출시켜 종양 관련 대식세포 유사 분극을 재현 가능하고 실용적으로 연구할 수 있는 접근법을 제공합니다. 이 시스템은 종양 미세환경 내에서 대식세포 재프로그래밍에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 종양 세포가 분비하는 용해성 인자의 영향을 포착합니다 7,9,10,15,19,20. 분석에서 세포 간 직접 접촉을 분리함으로써, 이 방법은 대식세포 표현형과 기능을 조절하는 용해성 성분을 집중적으로 조사할 수 있게 합니다.

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리는 국가과학기술진흥청(ANPCyT-FONCYT)이 PICT 2021 I-INVI-00034(DR에게), PICT 2021-I-A-00807(E.A.C.S.에게), PICT 2021-I-A-00716(A.E.E.에게)을 통해 제공한 재정 지원을 인정합니다. 또한 국립과학기술연구위원회(CONICET)의 PIP 2022-0763 보조금과 부에노스아이레스 대학교의 PIDAE 2022 지원금에 감사드립니다.

M.C.L.은 부에노스아이레스 대학교 의과대학에서 레가도 페룰 펠로우십을 받았으며, ANPCyT-FONCYT 박사 펠로우십을 수상했습니다. D.R., E.A.C.S., A.E.E.는 CONICET의 경력 조사관입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알렉사 플루어 488 마우스 안티휴먼  CD206 항체 클론 15-2BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.고양이# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 마우스 항인간 CD64 항체 클론 10.1BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD 사이토픽스/사이토퍼름BD 바이오사이언스, 캘리포니아주 산호세캣# 554714고정제/투과성 키트
둘벡코 변형 이글 미디엄(DMEM), 고혈당깁코와 nbsp; 미국 매사추세츠주 월섬의 써모피셔 사이언티픽;캣# 11965092
EasySep 인간 CD14 양성 선택 키트; 이지셉 긍정 선택 칵테일; 이지셉 자기 나노입자; 이지 셉 마그넷STEMCELL 테크놀로지스, 캐나다 밴쿠버카탈로그# 18058
FACS 칸토 세포계기 벡턴 디킨슨, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스.
태아 소 혈청, 자격, 뉴질랜드  깁코 및 무역; 그리고 nbsp; 미국 매사추세츠주 월섬의 써모피셔 사이언티픽;캣# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE 헬스케어 - 생명과학, 미국캣# 17144003
플로우조플로우조 LLC.RRID:SCR_008520
그래프패드 프리즈앤 nbsp; 그리고 nbsp;그래프패드 소프트웨어 주식회사RRID:SCR_002798
파텍 사이플로우 공간 세포계기 시스맥스 파르텍, 독일
PE 항인간 HLA-DR 항체 클론 L243BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.Cat# 307605; 리드:AB_314683
PE/Cy7 쥐 항생쥐/인간 CD11b 항체 클론 M1/70BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.캐트# 101216; RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 마우스 항인간 CD163 항체 클론 GHI/61BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.캣# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 미디엄깁코와 nbsp; 미국 매사추세츠주 월섬의 써모피셔 사이언티픽;캣# 11875119
피루브산나트륨 용액시그마-올드리치 머크, 미국 미주리주 샌루이스.  Cat#  S8636
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드깁코와 nbsp; 미국 매사추세츠주 월섬의 써모피셔 사이언티픽;캣# 25200056
좀비 바이올렛 고칠 수 있는 생존 키트BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.캣# 423113

참고문헌

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

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