저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

Summary

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

Abstract

선천성 면역의 중요한 백혈구인 호중구는 전통적으로 균질한 세포 집단으로 간주되어 왔습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 증거에 따르면 호중구는 여러 하위 집단에 존재합니다. 그러한 하위 집단 중 하나는 저밀도 호중구(LDN)입니다. LDN은 건강한 사람의 혈액에서 소량으로 발견되지만 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 질환, 암 및 감염과 같은 질병에서는 그 수가 크게 증가합니다. 이러한 경우 LDN은 질병의 발병기에 참여할 수 있습니다. LDN을 분리하는 유일한 방법은 말초 혈액의 밀도-구배 원심분리를 통해서입니다. 그러나 원심분리 후 LDN은 단핵 세포와 공동 정제됩니다. 따라서 이 호중구 하위 집단을 연구하는 것은 어렵습니다. LDN을 단핵 세포에서 분리하는 표준 방법론은 없습니다. 일반적으로 LDN은 유세포 분석기에서 세포 분류에 의해 분리됩니다. 그러나 이 방법은 추가 기능 연구를 위해 충분한 순수 세포를 얻기 위해 긴 분류 시간(시간)이 필요합니다. 이는 세포의 생존력과 기능에 심각한 영향을 미칩니다. 여기에서는 단시간에 많은 수의 순수하고 생존 가능한 LDN을 얻을 수 있는 실용적인 방법을 제안합니다. 밀도 구배 원심분리 후, 단핵 세포 분획을 항-CD66b 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 < 30분 안에 자기 컬럼을 통해 분리합니다. 정제된 LDN(CD66b⁺ 세포)은 CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b 및 CD98에 대한 단클론 항체로 표지되고 확인을 위해 유세포 분석법으로 분석됩니다. 정제된 LDN은 활성 산소종을 생성하고 호중구 세포외 트랩을 형성하는 능력으로 표시되는 바와 같이 완전히 기능합니다. 이 새로운 정제 방법은 단기간에 고순도(90% 이상)와 생존율(96% 이상)을 가진 LDN을 생성합니다. 이 방법은 생화학적 또는 기타 오믹스 분석을 통해 다양한 질병에서 LDN 기능을 평가하기 위해 많은 수의 순수 LDN을 얻기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

Introduction

인간^혈액에서 우세한 백혈구인 호중구1는 선천성 면역 체계의 주요 참여자입니다. 그들은 염증이나 감염이 있는 조직에 대량으로 도착합니다². 그곳에서 호중구는 식균작용 ^3,4, 탈과립 ^5,6 및 호중구 세포외 트랩(^NET)의 형성과 같은 여러 이펙터 기능을 활성화합니다7. 또한 호중구는 적응 면역 반응에도 참여합니다⁸. 호중구에 대한 고전적인 견해는 호중구를 미리 결정된 반응을 갖는 골수에서 생성되는 균질한 세포로 간주합니다 ^9,10. 그러나 최근 연구에 따르면 호중구는 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 여러 표현형 및 기능 상태를 갖는 이질적인 세포입니다 11,12,13,14,15.

여러 호중구 하위 집단 중에서 저밀도 호중구(LDN)는 고유한 특성과 여러 질병에서 수가 증가하기 때문에 많은 관심을 끌었습니다 16,17,18. LDN은 1986년 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 환자의 혈액에서 발견되었습니다¹⁹. 그들은 밀도 구배^20,21에서 백혈구를 분리하는 과정에 따라 검출되었습니다. 밀도 배지(예: Ficoll-Paque)에서 혈액 또는 백혈구가 풍부한 혈장을 원심분리한 후 단핵구와 림프구(말초 혈액 단핵 세포[PBMC]로 알려짐)는 튜브의 상부(저밀도) 부분에 밴드를 형성합니다. 튜브 바닥에 있는 호중구 침전물. PBMC 중에서도 몇 가지 호중구도 발견되었습니다. LDN입니다(그림 1). 소수의 LDN은 건강한 개인의 혈액에 있습니다²². 그러나 LDN 수치는 SLE^23,24, 패혈증²⁵, 건선²⁶, 천식²⁷, 소아 특발성 관절염²⁸, 항호중구 세포질 항체(ANCA) 관련 혈관염²⁹, HIV 감염³⁰, 말라리아³¹ 및 결핵³²를 포함한 다중 면역 억제 및 만성 염증 상태에서 크게 증가합니다. LDN 수는 언급된 모든 병리에서 증가하지만 LDN은 대부분 SLE¹⁷의 맥락에서 연구되었습니다. SLE 환자의 혈액에서 추출한 LDN은 NET을 형성하고(³³), 다량의 전염증성 매개체⁽³⁴)를 분비하고, T 세포를 활성화하는 능력이 더 큰 것으로 보입니다²⁴. 그러나, 암과 같은 다른 조건에서, LDN은 성숙한 호중구³⁵, T세포 억제 특성 36,37,38을 갖는 것으로 보고된다. 유사하게, COVID-19 환자에서도 LDN은 T 세포 증식을 억제하는 것으로 보고되었지만³⁹, SLE와 달리 LDN은 더 적은 수의 NET을 생성하는 것으로 보인다³⁹. 따라서 LDN의 기원, 구성 및 기능적 특성은 여전히 논란의 여지가 있습니다.

LDN은 PBMC와 함께 발견되기 때문에 연구하는 것은 기술적으로 복잡합니다. 다양한 병리에서 LDN 특성을 완전히 탐색하려면 이를 정제해야 합니다. LDN 분리의 일반적인 절차는 형광 세포 분류 22,40,41,42,43,44,45입니다. 그러나 세포 분류는 세포 분리에 오랜 시간이 필요합니다. 분류 시간이 충분하지 않으면 세포 손실 또는 낮은 회수율로 이어질 수 있습니다. 또한 세포는 과도한 스트레스를 받아 이러한 세포의 기능을 연구하는 동안 다양한 결과를 초래합니다. 분류 시간이 길면 실험 절차 비용도 증가하고 전문 인력이 필요합니다.

여기에서는 매우 짧은 시간에 많은 수의 순수하고 생존 가능한 인간 LDN을 얻을 수 있는 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 밀도 구배 원심분리 후 LDN은 자기 세포 분류(MACS; 그림 1). 이 정제 방법의 주요 장점은 LDN이 고순도(90% 이상)와 생존율(96% 이상)으로 분리된다는 것입니다. 또한 정제된 LDN은 활성 산소종(ROS)을 생성하고 NET을 방출하는 능력으로 표시되는 바와 같이 완전히 기능합니다. 이 프로토콜은 호중구 생물학에 관심이 있는 모든 실험실에서 쉽게 구현하여 이러한 세포를 추가로 연구하기 위해 여러 질병을 가진 사람들의 혈액에서 LDN을 신속하게 분리할 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜의 모든 절차는 Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México(UNAM)의 인간 연구 생명윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 호중구 분리

1. 정맥 천자를 통해 건강한 성인 지원자로부터 약 10mL의 혈액을 채취합니다. 항응고제로 헤파린 10U/mL를 첨가합니다.
   주의 : 바늘을 생물학적 위험 바늘 폐기 용기에 폐기하십시오. 주사기 및 혈액과 접촉하는 기타 물질은 폐기 전에 가방에 넣고 고압멸균해야 합니다.
2. 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 PBS에 2mL의 6% 덱스트란 T500을 첨가합니다. 그런 다음 튜브 측면으로 배출하여 10mL의 혈액을 추가합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 혈액과 덱스트란을 혼합합니다.
3. 적혈구가 침전되는 동안 튜브를 45분 동안 그대로 둡니다. 백혈구가 풍부한 혈장은 적혈구층 위에 나타납니다.
4. 다른 15mL 원심분리기 튜브에 5mL의 밀도 구배 배지를 추가합니다. 적혈구를 건드리지 않고 혈장을 조심스럽게 피펫팅하고 배지 위에 층층이 쌓습니다. 두 개의 개별 단계를 형성해야 합니다.
5. 튜브를 4°C에서 20분 동안 516 x g 으로 원심분리합니다. 단핵 세포(PBMC)는 혈장과 배지층 사이에 밴드를 형성합니다. 호중구는 바닥에 펠릿을 형성합니다(그림 1).
6. PBMC의 격리
   1. 세포를 건드리지 않고 PBMC 상단의 혈장을 흡인하여 제거합니다. 혈장과 배지 사이의 밴드에서 세포를 수집합니다. 가능한 한 적은 매체를 흡인하십시오.
   2. 세포를 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. PBS 20mL를 첨가합니다. 튜브를 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   3. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 튜브를 긁어 세포를 분리합니다. 10mL의 차가운 PBS를 첨가하여 세포를 재현탁합니다. Neubauer 챔버를 사용하여 PBMC를 계산합니다.
      참고: 세포를 손상시킬 수 있으므로 피펫을 사용하여 세포를 재현탁하지 마십시오.
7. 호중구 분리
   1. 밀도 구배 매체를 제거합니다. 튜브를 긁어서 세포를 분리하고 10mL의 차가운 PBS를 추가합니다.
   2. 세포를 신선한 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 4°C에서 5분 동안 400 x g 으로 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 1.6.3단계에 설명된 대로 세포를 분리합니다.
8. 잔류 적혈구를 제거하려면 차가운 저장성 용액(0.2% NaCl, 1% BSA, 20mM Hepes, pH = 7.4) 10mL를 첨가하고 정확히 1분 동안 부드럽게 혼합합니다.
9. 10mL의 차가운 고장성 용액(1.6% NaCl, 1% BSA, 20mM HEPES, pH = 7.4)을 빠르게 첨가하여 용액을 등장성으로 만듭니다.
10. Neubauer 챔버(순도 > 95%)를 사용하여 호중구를 계산합니다. 1.6.2단계와 같이 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그리고 차가운 PBS에 재현탁합니다. 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.
    참고: 시험관 내 호중구의 반감기는 8 - 12 h 46,47,48인 것으로 보고되었습니다. 이 프로토콜에 대한 우리의 경험에 따르면 호중구는 약 6-8시간 동안 기능을 유지합니다.

2. 저밀도 호중구(LDN)의 정제

1. PBMC를 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 120μL의 콜드 워시 완충액(PBS의 1% BSA)에 세포를 재현탁합니다.
2. 35μL의 CD66b 마그네틱 마이크로비드를 첨가합니다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 세포 응집을 방지하기 위해 10분마다 부드럽게 혼합하십시오.
3. 1mL의 콜드 워시 완충액을 추가합니다. 세포를 미세 원심분리기에 넣고 400 x g 으로 3분 동안 회전시킵니다.
4. 상청액을 제거하고 튜브를 긁어서 세포 펠릿을 분리한 다음 세포를 1mL의 세척 완충액에 재현탁합니다.
5. 자석 위에 자기 분리 컬럼을 놓습니다. 0.5mL의 세척 완충액을 컬럼에 첨가하고 컬럼을 통과시킵니다.
6. 세포(1mL)를 컬럼으로 옮깁니다. 버퍼가 열을 한 방울씩 통과하도록 합니다.
7. 0.5mL의 세척 완충액을 컬럼에 넣고 통과시킵니다. 컬럼에 0.5mL의 세척 완충액을 추가합니다.
8. 자석에서 컬럼을 제거하고 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 컬럼에 세척 완충액 1mL를 추가합니다.
9. 플런저를 컬럼 상단에 삽입하고 부드럽게 압력을 가하여 세포를 용리합니다. 플런저를 제거하고 새 미세 원심분리기 튜브 위에 컬럼을 놓습니다.
10. 세척 완충액 1mL를 더 추가합니다. 플런저를 컬럼 상단에 삽입하고 부드럽게 압력을 가하여 세포를 용리합니다.
11. 두 튜브를 미세 원심분리기에 넣고 800 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 마지막으로, 두 튜브의 세포(LDN)를 1mL의 차가운 PBS에 재현탁합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
    참고: 처음 2mL의 플로우 스루에는 나머지 PBMC가 포함되어 있습니다. 이 세포는 다른 연구에 사용될 수 있습니다.

3. 다색 유세포 분석

1. 정제된 세포를 라벨링 완충액(PBS의 1% FBS)에 1 x 10⁶ 세포/mL로 재현탁합니다. 250 μL의 세포를 1.5 mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
2. 호중구 막 분자에 대한 해당 항체를 추가합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 세포를 4°C에서 30분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
3. PBS 1mL를 추가합니다. 튜브를 미세 원심분리기에 넣고 800 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다.
4. 상청액을 흡인하고 튜브를 두드려 세포 펠릿을 부수고 세포를 0.5mL의 1% 파라포름알데히드에 재현탁합니다.
5. 유세포 분석으로 분석할 때까지 세포를 빛으로부터 보호된 4°C로 유지합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하여 샘플당 10,000개의 이벤트를 캡처합니다. 앞서 설명한 바와 같이 세포 분류를 수행한다²².
   주의: 파라포름알데히드는 피부와 호흡기에 자극을 줍니다. 증기를 흡입하지 않도록 하십시오.

4. 활성산소종(ROS) 검출

1. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 2.5 x 10⁵ 세포를 추가합니다. 튜브를 미세 원심분리기에 넣고 800 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다.
2. 상청액을 흡인하고 튜브를 긁어 세포를 분리한 다음 PBS에서 15μM 디하이드로로다민 123 100μL에 세포를 재현탁합니다.
3. 빛으로부터 보호된 세포를 37°C에서 20분 동안 배양합니다. PBS 1mL를 추가합니다.
4. 튜브를 미세 원심분리기에 넣고 800 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 상청액을 흡인하고 튜브를 긁어 세포를 분리한 다음 PBS의 50nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 100μL에 재현탁합니다.
5. 빛으로부터 보호된 세포를 37°C에서 45분 동안 배양합니다. PBS 1mL를 추가합니다.
6. 튜브를 미세 원심분리기에 넣고 800 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 상층액을 흡인하고 튜브를 긁어 세포를 분리한 다음 PBS의 1% 파라포름알데히드 0.5mL에 재현탁합니다.
7. 유세포 분석으로 분석할 때까지 세포를 빛으로부터 보호된 4°C로 유지하십시오. 유세포 분석으로 세포를 분석하여 샘플당 10,000개의 이벤트를 캡처합니다.

5. 호중구 세포외 트랩(NET)의 시각화

1. 커버슬립을 12웰 플레이트의 웰에 놓고 10μg/mL 폴리-L-라이신으로 덮습니다. 플레이트를 4°C에서 밤새 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
2. 폴리-L-라이신을 제거하고 커버슬립을 PBS로 세척하고 플레이트를 실온에서 5분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 커버슬립을 PBS로 두 번 더 세척합니다.
3. PBS를 제거하고 플레이트를 층류 후드 안에 2시간 동안 놓아 커버슬립을 건조시킵니다.
4. LDN을 5% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 1 x 10⁶ 세포/mL로 재현탁합니다. 세포 현탁액 350μL(3.5 x 10⁵ 세포)를 취하여 커버슬립이 포함된 12웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
5. 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 보관합니다. PBS로 희석된 5μM PMA 3.5μL를 각 웰에 추가합니다(PMA의 최종 농도는 50nM).
6. 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 보관합니다. PBS에 350μL의 8% 파라포름알데히드를 첨가하고 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 보관합니다.
7. 앞서 설명한 바와 같이 시험관 스탠드 위에 투명 필름을 놓아(⁴⁹) 튜브 구멍에 우물이 형성되도록 한다.
8. 커버슬립을 세척하거나 얼룩지기 위해 각 웰을 채우고 큰 방울을 형성합니다. 커버슬립을 제거하고 물 한 방울 위에 거꾸로 5분 동안 놓습니다. 같은 방법으로 커버슬립을 물로 세 번 더 씻으십시오.
9. 커버슬립을 차단 완충액(PBS의 5% BSA) 한 방울 위에 거꾸로 놓고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
10. 커버슬립을 블로킹 완충액에 상응하는 1차 항체(예: 항-엘라스타제 또는 항-시트룰린)의 한 방울로 옮기고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
11. 커버슬립을 PBS의 0.01% Tween-20에 2회 세척합니다. 커버슬립을 150nM DAPI를 포함하는 차단 완충액에 있는 해당 2차 항체 한 방울로 옮기고 빛으로부터 보호된 실온에서 60분 동안 배양합니다.
12. 커버슬립을 PBS의 0.01% Tween-20에 2회 세척합니다. 유리 슬라이드에 퇴색 방지 마운팅 매체 한 방울을 놓고 커버슬립을 거꾸로 놓습니다.
13. 매니큐어로 둘레의 커버슬립을 밀봉하십시오. 장착된 슬라이드는 빛으로부터 보호된 4°C에서 보관하십시오. 형광 현미경을 사용하여 NET을 시각화합니다.

6. 호중구 세포외 트랩(NET) 검출

1. 5% FBS로 RPMI-1640 배지에 희석한 500 nM Sytox Green에 5 x 10⁵ 세포/mL로 세포를 재현탁합니다.
2. 세포 현탁액 100μL(5 x 10⁴ 세포)를 채취하여 96웰 조직 배양 플레이트의 웰에 넣습니다.
3. 플레이트를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 20분 동안 보관합니다. RPMI-1640 배지에서 희석된 300nM PMA 20μL를 각 웰에 추가합니다(PMA의 최종 농도는 50nM).
4. 플레이트를 예열된 마이크로플레이트 리더로 옮깁니다. 플레이트를 35°C에서 4시간 동안 배양하고 5분마다 플레이트 바닥에서 형광 측정을 수행합니다(485nm 여기 및 528nm 방출 필터 사용).

Results

건강한 개인의 저밀도 호중구(LDN)는 PBMC의 약 5%를 차지합니다(그림 2A). 여기에 설명된 프로토콜은 일반적으로 순수한(> 90%) LDN을 제공합니다. 세포는 또한 높은 생존율(> 95%로 효율적으로 회수됩니다(수율 약 98%); 그림 2B). 비교를 위해, LDN은 또한 앞서 기술한 바와 같이 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제되었다²². 간단히 말해서, PBMC는 항-CD16b 항체로 표지되었고 형광 활성화 세포 분류기에서 분류되었습니다. LDN을 3시간 동안 분류하고 열 비활성화 FBS에서 회수했습니다(그림 2). 자기적으로(MACS) 정제된 LDN은 호중구와 유사한 막 분자(마커)를 나타내는 성숙한 세포입니다. 호중구는 막 마커 CD10, C...

Discussion

일반적으로 호중구는 균질한 세포로 생각되었습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 호중구는 서로 다른 활성화 상태 및/또는 여러 표현형을 가진 세포로 존재할 수 있습니다. 따라서 다양한 호중구 하위 집단이 존재할 수 있습니다 13,14,15. 호중구 하위 집단 중 하나인 저밀도 호중구(LDN)는 특별한 내재적 특성과 여러 질병에서 증가하기 때문에 큰 관심을 끌었습니다 16,17,18. LDN은 PBMC²²와 함께 혈액에서 분리됩니다. 따라서 그것들을 연구하는 것은 기술적으로 복잡합니다. 다양한 병리에...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
그리고 nbsp; 항시트룰린 토끼 다클론 항체	AbCam	AB100932	1/50 희석
96웰 조직 배양 플레이트	코스타; 코닝, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 항인간 CD11b 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	301317	0.25 & mu; g/mL
Alexa Fluor 647 항인간 CD66b 마우스 IgM 항체	바이오레전드	305109	0.05 & mu; g/mL
항생쥐 IgG (H+L) 염소 항체, Alexa Fluor 488	인비트로젠 - 써모피셔 사이언티브	A-11001	1/50 희석
항호중구 엘라스타제 마우스 단클론 IgG1 항체	산타크루즈 바이오테크놀로지	SC-55549	10 & 마이크로; g/mL
항토끼 IgG (H+L) 당나귀 항체, Alexa Fluor 555	인비트로젠 - 써모피셔 사이언티브	A-31572	1/50 희석
APC 항인간 CD62L 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	304809	0.03 & mu; g/mL
APC/Cyanine7 항인간 CD14 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	367107	0.25 & mu; g/mL
Attune NxT 유세포계	써모 피셔 사이언티픽, Inc.	(파랑/빨강 레이저)
소 혈청 알부민(BSA) 분획 V	MP 생의학	810025
브릴리언트 바이올렛 510 항인간 CD33 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	366609	0.30 & mu; g/mL
다피	칼바이오케미/EMD 밀리포어	268298
덱턴 T500	파마코스모스 에어컨	5.51005E+11
디하이드로로다민-123	아나스펙 주식회사	AS-85711
FACS 셀 분류기	벡턴 딕킨슨	모델 FACSAria
태아 소 혈청(FBS)	깁코	16000-044
피콜-파케	머크 KG	GE 17-1440-03
FITC 항인간 CD98 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	315603	0.30 & mu; g/mL
플로우조 소프트웨어	벡턴 디킨슨	버전 10, 2019년
형광 역현미경	올림포스	모델 IX-70
헤파린	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
헤페스	시그마 올드리치	H7006
MACSprep 키메리즘 CD66b 마이크로비즈	밀텐이 바이오텍	130-111-552
마그넷	밀텐이 바이오텍	130-042-102
자기 분리 컬럼	밀텐이 바이오텍	130-042-201
마이크로 원심분리기	에펜도르프	모델 5415C
마이크로플레이트 리더	바이오텍 인스트루먼츠	모델 시너지 HT
파라포름알데히드	시그마 올드리치	158127
PE 항인간 CD10 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	312203	0.05 & mu; g/mL
PE 항인간 CD16b 마우스 IgG2a 항체	BD 파밍겐	550868	1/40 희석
PE/시아닌5 항인간 CD15 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	323013	0.25 & mu; g/mL
포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)	시그마 올드리치	P8139
폴리-L-라이신	시그마 올드리치	P2658
냉장 원심분리기	에펜도르프	모델 5702R
RPMI-1640 조직 배양 배지	깁코	23400-021
시톡스 그린	분자 프로브스 주식회사	S-7020
트윈-20	시그마 올드리치	P2287
벡타쉴드	벡터 연구소	H-1000