저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

Summary

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

Abstract

선천성 면역의 중요한 백혈구인 호중구는 전통적으로 균질한 세포 집단으로 간주되어 왔습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 증거에 따르면 호중구는 여러 하위 집단에 존재합니다. 그러한 하위 집단 중 하나는 저밀도 호중구(LDN)입니다. LDN은 건강한 사람의 혈액에서 소량으로 발견되지만 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 질환, 암 및 감염과 같은 질병에서는 그 수가 크게 증가합니다. 이러한 경우 LDN은 질병의 발병기에 참여할 수 있습니다. LDN을 분리하는 유일한 방법은 말초 혈액의 밀도-구배 원심분리를 통해서입니다. 그러나 원심분리 후 LDN은 단핵 세포와 공동 정제됩니다. 따라서 이 호중구 하위 집단을 연구하는 것은 어렵습니다. LDN을 단핵 세포에서 분리하는 표준 방법론은 없습니다. 일반적으로 LDN은 유세포 분석기에서 세포 분류에 의해 분리됩니다. 그러나 이 방법은 추가 기능 연구를 위해 충분한 순수 세포를 얻기 위해 긴 분류 시간(시간)이 필요합니다. 이는 세포의 생존력과 기능에 심각한 영향을 미칩니다. 여기에서는 단시간에 많은 수의 순수하고 생존 가능한 LDN을 얻을 수 있는 실용적인 방법을 제안합니다. 밀도 구배 원심분리 후, 단핵 세포 분획을 항-CD66b 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 < 30분 안에 자기 컬럼을 통해 분리합니다. 정제된 LDN(CD66b⁺ 세포)은 CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b 및 CD98에 대한 단클론 항체로 표지되고 확인을 위해 유세포 분석법으로 분석됩니다. 정제된 LDN은 활성 산소종을 생성하고 호중구 세포외 트랩을 형성하는 능력으로 표시되는 바와 같이 완전히 기능합니다. 이 새로운 정제 방법은 단기간에 고순도(90% 이상)와 생존율(96% 이상)을 가진 LDN을 생성합니다. 이 방법은 생화학적 또는 기타 오믹스 분석을 통해 다양한 질병에서 LDN 기능을 평가하기 위해 많은 수의 순수 LDN을 얻기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

Introduction

인간^혈액에서 우세한 백혈구인 호중구1는 선천성 면역 체계의 주요 참여자입니다. 그들은 염증이나 감염이 있는 조직에 대량으로 도착합니다². 그곳에서 호중구는 식균작용 ^3,4, 탈과립 ^5,6 및 호중구 세포외 트랩(^NET)의 형성과 같은 여러 이펙터 기능을 활성화합니다7. 또한 호중구는 적응 면역 반응에도 참여합니다⁸. 호중구에 대한 고전적인 견해는 호중구를 미리 결정된 반응을 갖는 골수에서 생성되는 균질한 세포로 간주합니다 ^9,10. 그러나 최근 연구에 따르면 호중구는 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 여러 표현형 및 기능 상태를 갖는 이질적인 세포입니다 11,12,13,14,15.

Protocol

이 프로토콜의 모든 절차는 Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México(UNAM)의 인간 연구 생명윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 호중구 분리

1. 정맥 천자를 통해 건강한 성인 지원자로부터 약 10mL의 혈액을 채취합니다. 항응고제로 헤파린 10U/mL를 첨가합니다.
   주의 : 바늘을 생물학적 위험 바늘 폐기 용기에 폐기하십시오. 주사기 및 혈액과 접촉하는 기타 물질은 폐기 전에 가방에 넣고 고압멸균해야 합니다.
2. 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 PBS에 2mL의 6% 덱스트란 T500을 첨가합니다. 그런 다음 튜브 측면으로 배출하여 10mL의 혈액을 추가합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 혈액과 덱스트란을 혼합합니다.
3. 적혈구가 침전되는 동안 튜브를 45분 동안 그대로 둡니다. 백혈구가 풍부한 혈장은 적혈구층 위에 나타납니다.
4. 다른 15mL 원심분리기 튜브에 5mL의 밀도 구배 배지를 추가합니다. 적혈구를 건드....

Results

건강한 개인의 저밀도 호중구(LDN)는 PBMC의 약 5%를 차지합니다(그림 2A). 여기에 설명된 프로토콜은 일반적으로 순수한(> 90%) LDN을 제공합니다. 세포는 또한 높은 생존율(> 95%로 효율적으로 회수됩니다(수율 약 98%); 그림 2B). 비교를 위해, LDN은 또한 앞서 기술한 바와 같이 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제되었다²². 간단히 말해서, PBMC는 항-CD16b 항체로 표지되었고 형광 활성화 세포 분류기에서 분류되었습니다. LDN을 3시간 동안 분류하고 열 비활성화 FBS에서 회수했습니다(그림 2). 자기적으로(MACS) 정제된 LDN은 호중구와 유사한 막 분자(마커)를 나타내는 .......

Discussion

일반적으로 호중구는 균질한 세포로 생각되었습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 호중구는 서로 다른 활성화 상태 및/또는 여러 표현형을 가진 세포로 존재할 수 있습니다. 따라서 다양한 호중구 하위 집단이 존재할 수 있습니다 13,14,15. 호중구 하위 집단 중 하나인 저밀도 호중구(LDN)는 특별한 내재적 특성과 여러 질병에서 증가하기 때문에 큰 관심을 끌었습니다 16,17,18. LDN은 PBMC²²와 함께 혈액에서 분리됩니다. 따라서 그것들을 연구하는 것은 기술적으로 복잡합니다. 다양한 병리에.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
그리고 nbsp; 항시트룰린 토끼 다클론 항체	AbCam	AB100932	1/50 희석
96웰 조직 배양 플레이트	코스타; 코닝, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 항인간 CD11b 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	301317	0.25 & mu; g/mL
Alexa Fluor 647 항인간 CD66b 마우스 IgM 항체	바이오레전드	305109	0.05 & mu; g/mL
항생쥐 IgG (H+L) 염소 항체, Alexa Fluor 488	인비트로젠 - 써모피셔 사이언티브	A-11001	1/50 희석
항호중구 엘라스타제 마우스 단클론 IgG1 항체	산타크루즈 바이오테크놀로지	SC-55549	10 & 마이크로; g/mL
항토끼 IgG (H+L) 당나귀 항체, Alexa Fluor 555	인비트로젠 - 써모피셔 사이언티브	A-31572	1/50 희석
APC 항인간 CD62L 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	304809	0.03 & mu; g/mL
APC/Cyanine7 항인간 CD14 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	367107	0.25 & mu; g/mL
Attune NxT 유세포계	써모 피셔 사이언티픽, Inc.	(파랑/빨강 레이저)
소 혈청 알부민(BSA) 분획 V	MP 생의학	810025
브릴리언트 바이올렛 510 항인간 CD33 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	366609	0.30 & mu; g/mL
다피	칼바이오케미/EMD 밀리포어	268298
덱턴 T500	파마코스모스 에어컨	5.51005E+11
디하이드로로다민-123	아나스펙 주식회사	AS-85711
FACS 셀 분류기	벡턴 딕킨슨	모델 FACSAria
태아 소 혈청(FBS)	깁코	16000-044
피콜-파케	머크 KG	GE 17-1440-03
FITC 항인간 CD98 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	315603	0.30 & mu; g/mL
플로우조 소프트웨어	벡턴 디킨슨	버전 10, 2019년
형광 역현미경	올림포스	모델 IX-70
헤파린	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
헤페스	시그마 올드리치	H7006
MACSprep 키메리즘 CD66b 마이크로비즈	밀텐이 바이오텍	130-111-552
마그넷	밀텐이 바이오텍	130-042-102
자기 분리 컬럼	밀텐이 바이오텍	130-042-201
마이크로 원심분리기	에펜도르프	모델 5415C
마이크로플레이트 리더	바이오텍 인스트루먼츠	모델 시너지 HT
파라포름알데히드	시그마 올드리치	158127
PE 항인간 CD10 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	312203	0.05 & mu; g/mL
PE 항인간 CD16b 마우스 IgG2a 항체	BD 파밍겐	550868	1/40 희석
PE/시아닌5 항인간 CD15 마우스 IgG1 항체	바이오레전드	323013	0.25 & mu; g/mL
포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)	시그마 올드리치	P8139
폴리-L-라이신	시그마 올드리치	P2658
냉장 원심분리기	에펜도르프	모델 5702R
RPMI-1640 조직 배양 배지	깁코	23400-021
시톡스 그린	분자 프로브스 주식회사	S-7020
트윈-20	시그마 올드리치	P2287
벡타쉴드	벡터 연구소	H-1000