안지오텐신 II를 이용한 고혈압성 심근 섬유증의 마우스 모델 구축을 위한 프로토콜

Summary

삼투압 펌프 를 통한 안지오텐신 II(Ang II)의 지속적인 주입은 고혈압성 심근 섬유증의 동물 모델을 구성하는 고전적인 방법 중 하나입니다. 이 프로토콜은 이 모델을 구성하는 프로세스를 체계적으로 최적화하고 삼투압 펌프 이식, 위치 지정 및 Ang II 농도 설정의 핵심 사항을 정교화했습니다.

Abstract

삼투압 펌프 를 통한 안지오텐신 II(Ang II)의 지속적인 주입은 고혈압성 심근 섬유증의 동물 모델을 확립하는 데 널리 활용되는 접근 방식입니다. 그럼에도 불구하고 이 기술은 Ang II의 불안정성, 부정확한 펌프 배치, 표준화된 절차의 부족 등 현재 보고서에서 특정 한계를 나타냅니다. 설립 방법론에 대한 현재 보고서는 상대적으로 제한적입니다. 이 프로토콜은 Ang II 용액의 표준화된 준비, 용량 보정, 삼투압 펌프의 정확한 피하 이식 및 모델 평가 지표에 대한 정량적 표준을 포함하여 마우스에서 Ang II 삼투압 펌프 유발 고혈압 심근 섬유증 모델의 확립을 체계적으로 최적화했습니다. 실험 결과는 Ang II 삼투압 펌프가 생존율이 높은 마우스에서 고혈압성 심근 섬유증을 유발하는 것으로 나타났습니다. 수축기 혈압(SBP) 수치는 피하 이식 7일 후 160mmHg로 안정화되었습니다. 모델 마우스는 좌심실 박출률이 유의하게 감소하고 좌심실의 확장기말 치수가 증가했습니다. 가짜 수술군에 비해 고혈압성 심근 간질 조직 및 혈관주위 부위 내 콜라겐 침착이 증가하였다. 본 연구는 작은 표본 크기(n=6)를 기반으로 삼투압 펌프와 병용한 Ang II를 이용한 고혈압성 심근 섬유증의 마우스 모델 구축 가능성을 예비적으로 검증하고 정량적 표현형 검증 시스템을 구축하였다.

Introduction

고혈압의 주요 병리학적 결과인 심근 섬유증(MF)은 손상되거나 압박된 심근 내에 과도한 콜라겐 섬유 침착을 특징으로 합니다. 이는 고혈압 매개 표적 장기 손상의 가장 중요한 형태 중 하나를 나타내며 진행성 심장 기능 장애에 기여합니다 ^1,2. 적절한 동물 모델을 확립하는 것은 고혈압성 심근 섬유증에 대한 기계론적 연구를 발전시키고 새로운 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다. 레닌-안지오텐신 시스템의 중심 이펙터인 안지오텐신 II(Ang II)는 고혈압 발병기전에서 중추적인 역할을 합니다³. 따라서 Ang II 기반 유도는 마우스에서 고혈압 모델을 확립하는 데 널리 사용되는 접근 방식이 되었습니다.

고혈압 동물 모델을 구성하는 현재 방법에는 주로 외과적 유도, 약리학적 유도 및 형질전환 자발적 모델이 포함됩니다. 외과적 유도는 일반적으로 신장 동맥 수축, 상행 대동맥 수축 또는 대동맥궁 수축과 같은 기술을 사용하여 혈류 저항을 인위적으로 증가시켜 혈압 상승을 유도합니다⁴. 이러한 방법은 스트레스 부하 관련 심장 리모델링 과정을 연구하는 데 적합한 고혈압 상태를 신속하게 확립할 수 있지만 수많은 수술 후 합병증이 있는 복잡한 절차를 포함합니다. 약리학적 유도는 일반적으로 실험 동물의 혈압을 상승시키기 위해 복강내 주사 또는 경구 투여를 활용합니다⁵. 이 기술은 비교적 간단하지만 모델 안정성은 약물 용량, 투여 빈도 및 동물 스트레스 반응으로 인한 간섭에 여전히 취약합니다. 안정적인 고혈압 표현형을 나타내는 자발성 고혈압 쥐 및 BPH/2J 고혈압 마우스와 같은 형질전환 모델은 유전성 고혈압 연구에 널리 사용됩니다. 그러나 이들의 단일 병원성 메커니즘은 다인자 유발 임상 고혈압을 시뮬레이션하는 능력을 제한합니다.

최근에는 피하 삼투압 펌프를 통한 지속적인 Ang II 주입을 기반으로 하는 고혈압 모델이 인기를 얻었습니다. 이 방법은 Ang II의 일정한 속도로 지속 방출을 가능하게 하여 장기간에 걸쳐 안정적인 혈중 농도를 유지하여 병리학적 과정을 밀접하게 모방하고 마우스 고혈압성 심근 섬유증을 복제합니다 ^6,7,8. 그럼에도 불구하고 특히 프로토콜의 표준화 및 일관되지 않은 섬유화 결과와 관련하여 중요한 한계가 남아 있으며, 이는 펌프 이식 기술 및 동물 특이적 반응과 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다⁹. 이러한 격차를 해결하기 위해 이 연구는 Ang II 삼투압 펌프 기반 모델을 개선하고 주요 단계를 표준화하며 시각화된 프로토콜을 제공합니다. 이러한 개선은 재현성과 실용적인 적용 가능성을 향상시켜 고혈압성 심근 섬유증에 대한 향후 연구에 귀중한 참고 자료를 제공합니다.

Protocol

모든 실험 절차는 국립보건원의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 실험 프로토콜은 사우스웨스트 의과대학 동물연구위원회(승인번호 SWMU2020317)의 승인을 받았습니다.

1. Ang II 용액 준비 및 삼투압 펌프 충전

1. 연령 관련 교란 요인을 제어하기 위해 발달 균일성을 위해 8주 된 동물을 선택하여 무게가 20 ± 1g인 12마리의 SPF 등급 수컷 C57BL/6J 마우스( 재료 표 참조)를 선택합니다. 마우스를 간단한 무작위화 방법을 사용하여 가짜 수술 그룹과 모델 그룹으로 나누고 각 그룹에 6마리의 마우스를 배치합니다.
2. 마우스의 초기 체중을 측정하고 Ang II의 용량( 재료 표 참조)을 1.46 mg/kg/d로 결정합니다.
   참고: 예비 실험에 따르면 1.46mg/kg/d가 Ang II의 최적 용량입니다. 이 용량은 수축기 혈압을 약 160mmHg로 안정적으로 유지하여 병적 심근 섬유증을 효과적으로 유도하는 동시에 4주간의 연구 기간 동안 동물의 생존을 보장합니다.
3. 4°C로 예식된 0.9% 멸균 식염수 2.45mL를 Ang II 동결건조 분말 10mg에 첨가합니다. 용액을 완전히 혼합하고 즉시 사용할 수 있도록 얼음 위에 보관하십시오.
4. 주사기를 사용하여 Ang II 용액을 끌어온 다음 200μL(3.91mmol/L 농도)를 6개의 삼투압 펌프( 재료 표 참조) 챔버 각각에 순차적으로 주입하여 얼음 위에서 절차를 수행합니다.
5. 펌프를 37°C 멸균 식염수에 48시간 동안 담가 삼투압 드라이브를 활성화합니다.
   참고: 가짜 수술 그룹의 삼투압 펌프에 동일한 양의 식염수를 채웁니다. Ang II는 감광성이므로 절차는 전체적으로 완전한 빛 보호 하에 수행되어야 합니다.

2. 삼투압 펌프 이식 및 모델 ⁶ 구축

1. 동물 준비 및 마취
   1. 물에 무료로 접근할 수 있는 상태에서 4시간 동안 마우스를 금식시키십시오. 그런 다음 각 마우스의 무게를 측정하고 적절한 마취 용량(80mg/kg 펜토바르비탈 나트륨)을 계산합니다¹⁰.
   2. 계산된 용량의 펜토바르비탈 나트륨의 복강내 주사 를 통해 마우스를 마취합니다.
      알림: 펜토바르비탈을 취급하려면 규정 준수, 연기 후드 작동, 보호 장비 착용, 분리 폐기를 위한 잔류 액체 라벨 부착이 필요합니다.
2. 면도기나 제모 크림을 사용하여 꼬리 기저부에서 등쪽 중앙 부위까지 이어지는 부위의 등쪽 피부에서 털을 제거합니다.
3. 면도한 부위를 70% 에탄올로 3회 철저히 소독합니다¹¹.
4. 메스를 사용하여 소독 부위 내에 0.5cm의 피하 절개를 합니다.
5. 절개를 통해 겸자를 사용하여 피하 조직을 목 뒤쪽으로 뭉툭하게 분리하여 주머니를 만듭니다.
6. 카테터 끝이 마우스 머리를 향하도록 펌프 본체의 방향을 지정합니다. 그런 다음 지혈 겸자로 팁을 고정하고 펌프를 해당 방향으로 피하 삽입합니다.
7. 펌프 이식 후 중단된 6-0 흡수성 봉합사로 피하 조직을 봉합하고 수술용 봉합사로 피부 절개 부위를 봉합합니다. 그런 다음 마취에서 완전히 회복될 때까지 예열된 37°C 열 매트에 마우스를 놓습니다(약 5-10분).
8. 준비된 Ang II 용액을 삼투압 펌프 를 통해 미리 정해진 용량(1.46mg/kg/d)으로 28일 동안 지속적으로 주입합니다.
9. 28일의 주입 기간이 끝나면 모든 실험 데이터를 수집합니다. 그런 다음, 이전 마취에 대해 수행된 것과 동일한 방법, 즉 단계 2.1.1-2.1.2에 설명된 절차에 따라 마우스를 마취하고 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킵니다.

3. 혈압 측정

1. 장비( 재료 표 참조) 예열: 마우스 꼬리 혈관의 혈관 확장을 보장하기 위해 가열 플랫폼을 37-38°C로 설정합니다.
2. 마우스를 부드럽게 잡고 구속 홀더에 놓고 꼬리가 뒤쪽 구멍을 통해 자유롭게 튀어나오도록 합니다. 그런 다음 알코올을 적신 면봉으로 노출된 꼬리를 철저히 청소합니다.
3. 꼬리 밑부분에 팽창식 커프를 놓습니다. 맥박 센서를 중하부 꼬리 부분의 커프에서 약 5-10mm 떨어진 곳에 배치합니다.
4. 장치를 활성화하고 맥박 파형이 안정화될 때까지 기다렸다가 계속 진행하십시오.
5. 측정 주기를 시작합니다. 시스템은 혈류를 차단하기 위해 커프를 200mmHg를 초과하는 압력으로 자동으로 팽창시킨 다음 초당 2-3mmHg로 천천히 수축시킵니다. 센서는 흐름이 재개될 때 맥파가 다시 나타나는 것을 감지하여 수축기 혈압을 결정합니다.
6. 모델링 후 7일 간격으로 수축기 혈압(SBP)을 측정하여 총 5회 측정합니다. 모든 시점에서 각 마우스에 대해 3개의 순차적 판독값을 기록하여 연속 측정 사이에 2분의 휴식 시간을 허용합니다.
7. 측정 후 마우스를 음식과 물과 함께 케이지로 되돌립니다. 교차 오염을 방지하기 위해 홀더와 테일 슬리브를 청소하십시오.

4. 심장 기능 측정

1. 모델링 28일째에 모든 실험 마우스를 펜토바르비탈나트륨(80mg/kg 펜토바르비탈 나트륨)으로 마취합니다.
2. 일정한 온도 플랫폼에 마우스를 누운 자세로 놓습니다.
3. 초음파 시스템을 사용하여 경흉부 심초음파를 수행합니다( 재료 표 참조). 마우스의 팔다리를 플랫폼의 전극에 연결하여 심전도(ECG) 신호를 모니터링합니다.
4. M-모드 초음파 를 통해 유방 근육 수준에서 단축 영상을 획득하여 심장을 시각화하고 심장 기능을 분석합니다. 마우스당 3개의 이미지를 캡처하고 좌심실 내부 확장기 치수(LVIDd), 좌심실 내부 직경 수축기(LVID), 좌심실 단축율(LVFS) 및 좌심실 박출률(LVEF)의 후속 분석을 위해 데이터를 평균화합니다.
   알림: 흉강을 압박하지 않고 흉벽과 프로브 접촉을 유지하십시오. 심실 중격에 수직인 M 모드 샘플링 라인을 확인합니다. 평균값을 얻기 위해 ≥ 3개의 심장 주기 동안 연속 측정을 수행합니다.

5. 마손 염색

1. 심장 샘플링 및 고정
   1. 펜토바르비탈나트륨(80mg/kg 펜토바르비탈 나트륨)으로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 흉강에 약 1.5cm의 세로 절개를 하고 주요 심장 혈관을 결찰한 후 견인 손상을 방지하기 위해 심장을 빠르게 절제합니다¹².
   2. 절제된 심장을 예식된 PBS로 즉시 헹구어 혈액을 제거하고 깨끗한 여과지를 사용하여 과도한 수분을 부드럽게 닦아냅니다. 그 후, 유두근을 따라 가로 절편을 수행하여 3mm 두께의 조직 절편을 얻습니다.
   3. 고정을 위해 심장 샘플을 48% 파라포름알데히드에 48시간 이상 담그고 최소 조직 대 고정액 부피 비율을 1:10으로 보장합니다.
2. 4% 파라포름알데히드 고정액에서 심장 조직을 제거합니다. 그런 다음, 흄 후드 아래에서, 수술용 칼로 4μm 두께로 조직을 얇게 슬라이스하고, 슬라이스를 탈수 카세트⁽¹³⁾로 옮긴다.
3. 조직 절편을 탈수기에 넣고 다음 단계를 수행합니다: 70% 에탄올, 80% 에탄올, 95% 에탄올을 각각 1시간 동안 수행합니다. 100% 에탄올 I 및 II를 각각 45분 동안; 자일렌 I 및 II를 각각 30분 동안 투여합니다.
4. 조직을 파라핀에 매립한 다음 미리 냉각된 -20°C 냉각판에서 블록을 응고시킵니다.
5. 파라핀 마이크로톰을 사용하여 파라핀 포매 조직 블록에서 4μm 두께의 세로 절편을 얻습니다. 그런 다음 절편을 다음 용액에 각각 5분 동안 순차적으로 담가 탈파라핀화하고 재수화합니다: 자일렌 I, 자일렌 II, 무수 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올, 마지막으로 증류수.
6. 준비된 Weigert의 철 헤마트실린 염색 용액에 조직을 8분 동안 담급니다. 그런 다음 증류수로 반복적으로 헹구어 과도한 얼룩 용액을 제거합니다. 산성 에탄올 분화 용액에서 5초 동안 분화한 후 Masson의 청색 용액에서 5분 동안 청색합니다. 마지막으로 증류수로 헹굽니다¹⁴.
7. 조직을 완전하고 균일하게 덮도록 슬라이드당 약 200-300μL를 도포하여 10분 동안 카민 레드로 절편을 염색합니다. 그런 다음 0.2% 빙초산으로 절편을 1분 동안 헹굽니다.
8. 약 5분 동안 또는 근육 섬유가 붉어질 때까지 인산몰리브드산 용액으로 절편을 치료합니다. 그런 다음 조직을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 아닐린 블루 용액으로 절편을 5분 동안 염색합니다(일반적으로 슬라이드당 200-300μL). 마지막으로 0.2% 빙초산 용액¹⁵로 절편을 헹구십시오.
9. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 절편을 탈수합니다. 각각 1-2분씩 세 번 침지를 사용하여 자일렌으로 조직을 제거합니다.
10. 소량의 중성 수지를 바르고 커버슬립으로 덮어 섹션을 장착합니다.
11. 현미경( 재료 표 참조) 검사: 40×, 20× 및 10× 배율로 Masson 염색 조직을 관찰합니다. 대표적인 이미지를 보존하기 위해 각 슬라이드를 촬영합니다.
    알림: 기관 안전 프로토콜에 따라 모든 폐기물을 폐기하십시오. 부식 방지 배럴에 산성 분화 용액과 빙초산을 수집하고 고농도 폐기물을 pH 6-8로 중화하고 알칼리성 용액과 혼합하지 마십시오. 에탄올은 방폭 배럴에 담아 화기에서 멀리 떨어진 서늘한 곳에 보관하십시오. 자일렌을 갈색 배럴에 담고 보호 장비를 착용한 후 흄 후드에서 작동하며 산(물질)을 에탄올과 혼합하지 마십시오. 동물 조직을 라벨이 붙은 용기에 넣고 밀봉한 다음 냉동 조건에서 보관합니다¹⁶. 마지막으로 모든 폐기물을 자격을 갖춘 전문 기관으로 이송하여 처리하십시오. 폐기물을 섞거나 아무렇지도 않게 버리는 것을 엄격히 금지합니다.

6. 통계 분석

1. 모든 수치 데이터를 수집하고 GraphPad Prism 9.0을 사용하여 분석합니다.
2. 독립 표본 t-검정을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
3. 통계적 유의성을 매우 유의한 경우 **P < 0.01, 유의한 경우 *P < 0.05로 설정합니다.

Results

12마리의 쥐가 삼투압 펌프를 피하에 이식하여 생존했습니다. 모델 그룹은 모두 고혈압을 발병시켰습니다(n = 6). 이식 후 7일 후, 모델 그룹의 평균 SBP는 160mmHg를 초과했습니다(그림 1A). 14일, 21일, 28일에 모델 그룹의 SBP는 지속적으로 160mmHg 이상을 유지했습니다. 대조적으로, 가짜 수술군은 실험 내내 현저한 상승 없이 정상적인 SBP 수치(약 90-110mmHg)를 유지했습니다.

삼투압 펌프 이식 후 28일 후, 심초음파 검사에서 가짜 수술군에 비해 모델군은 심실벽 얇아짐, 후벽의 보상적 비후, 전벽 운동 감소를 나타냈다(그림 1B). LVEF 및 LVFS의 유의한 감소가 관찰된 반면(P < 0.01), LVIDd 및 LVID는 유의한 증가(P < 0.01)를 보였습니다(그림 1C-...

Discussion

이 프로토콜은 삼투압 펌프를 사용하여 고혈압성 심근 섬유증을 유도하기 위해 Ang II의 연속 주입과 관련된 주요 단계를 최적화하고 삼투압 펌프의 이식 위치 및 Ang II 농도 설정과 같은 중요한 측면을 자세히 설명했습니다. 모델 2004 펌프는 4주 동안 선택되었으며 Ang II 용량은 최소 배치 간 변동성을 설명하여 공칭 주입 속도를 기반으로 계산되었습니다. 이 모델의 효능은 SBP 모니터링, 심장 컬러 도플러 초음파 및 Masson 염색을 통해 확인되었습니다. 이 프로토콜에서는 8주 령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 실험 대상자의 발달 단계에서 균일성을 보장함으로써 실험 결과에 대한 연령의 교란 효과를 최소화했습니다¹⁹.

Ang II 탑재 삼투압 펌프 이식 후 7일째에 모델군의 마우스는 SBP가 유의하게 증가했으며, 이후 160mmHg를 유지하여 3주 연속 이...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
앙 2세	시그마-올드리치 코퍼레이션	시그마, A9525
동물 마취기	선전 보상생명과학 유한회사	R530
동물 인공호흡기	선전 보상생명과학 유한회사	R415
그래프패드 프리즈앤 nbsp;	그래프패드 소프트웨어 주식회사	버전 9.0
지능형 비침습적 혈압 측정기	닛폰 소프트 드래곤 주식회사	소프트론, BP-98A
광학 현미경	이징통 광학기술(상하이) 유한회사	올림푸스, SZ61TR
매슨 삼색 염색 용액 및 키트	베이징 소레이바오 테크놀로지 유한회사	솔라르비오, G1340
마우스	청두 도시 익스퍼리멘탈 동물 주식회사	C57BL/6J
삼투압 펌프	알자 코퍼레이션	알제트, 모델 2004
초음파 영상 시스템	후지필름 비주얼소닉스 코퍼레이션, 캐나다	후지필름, 베보 3100