뇌 전이 모델링: 입체정위 피질 내 주사를 통한 전이 정식 집락화 및 조직학적 성장 패턴 분석

요약

입체정위 두개내 주입 기법은 종양 세포를 마우스 피질에 정밀하고 국소적으로 이식할 수 있게 하여 뇌의 전이 정착 연구에 강력한 모델이 됩니다.

초록

뇌 전이는 진행성 고형종양의 흔하고 치명적인 합병증으로, 예후가 좋지 않고, 신경학적 기능이 저하되며, 삶의 질 저하와 자주 연관되어 있습니다. 중추신경계(CNS) 기능 부전과 신경학적 사망의 발생률은 빠르게 증가하고 있지만, 2차 전파, 재정착, 조직학적 성장 패턴(HGP)이 잠재적 대체 지표로 기여하는 등 뇌 전이의 최종 단계를 결정하는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.

표준화된 입체 정위 피질 내 주입 모델은 종양 세포 또는 기질 또는 면역 성분을 포함한 혼합 집단을 마우스 대뇌 피질에 정확하고 재현 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 전임상 조직 아카이브 구축을 지원하여, 전이성 성장, HGP 특이적 성장 역학, 신경학적 부전에 기여하는 병태생리학적 기전 등 CNS 집락화의 필수 측면을 탐구할 수 있는 견고한 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이 모델은 재현 가능한 임상적 관련성 있는 맥락에서 약리학적 검사를 지원합니다.

초기 전이 단계 연구에 최적화되어 있지만 뇌 정착 속도가 변동적이고 종종 낮은 전신 주입법(예: 꼬리 정맥 또는 심장내주사법)과 달리, 입체정관 모델은 일관되고 뇌 특이적인 전이 성장을 보장하며 중추신경계 전이의 후기 단계 조사를 가능하게 합니다. 오가노이드나 뇌 절편 배양과 같은 체외 시스템과 비교할 때, 생체 내 입체정정 모델은 혈관 형성, 전신 신호전달, 그리고 뇌 면역 지형의 전체 복잡성을 보존하여 종양 진행과 치료 반응에 대한 장기 연구를 지원합니다.

재현 가능하고 임상적으로 적합한 플랫폼을 제공함으로써, 우리 모델은 예후 표지자를 식별하고 치료 전략을 탐구하며 후기 뇌 전이의 메커니즘을 이해하는 분야의 능력을 발전시킵니다.

서론

뇌 전이는 고형암 환자에서 흔하고 치명적인 합병증으로, 예후가 좋지 않고, 신경학적 저하가 심하며, 삶의 질 저하와 자주 연관되어 있습니다 ^1,2,3. 특히 폐암, 유방암, 흑^색종 4,5,6,7 등 중추신경계 부전과 신경학적 사망이 점점 더 빈번한 결과가 되고 있습니다. 뇌 전이와 관련하여 중추신경계 기능 장애는 국소 덩크효과, 종양 주위 부종, 두개내 출혈, 수막 퍼짐 등 다양한 기전에서 발생할 수 있으며, 이들은 독립적으로 또는 시너지 작용하여 궁극적으로 신경학적 사망을 초래할 수 있습니다⁸.

임상적 중요성에도 불구하고, 중추신경계 기능 부전과 전이의 최종 진행 단계에 대한 병태생리학적 기전은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 대체 확산, 2차 확산, 재정착과 같은 과정은 전문 조사의 중심이 드물^다. 임상 및 전임상 연구 모두 뇌전이 수, 크기, 전체 생존(OS)과 같은 평가 지표로 분석을 제한하는 경우가 많아, 중요한 기전적 통찰과 신경학적 쇠퇴 및 사망의 진정한 원인을 간과합니다.

이 맥락에서 저희와 다른 연구자들은 임상 결과^{9, 10, 11}과 상관관계가 있는 뇌 전이에서 뚜렷한 조직학적 성장 패턴(HGPs)을 확인했습니다. 세 가지 주요 HGP가 기술되었습니다: i) 비침윤성으로, 반응성 성상세포 가장자리로 둘러싸인 잘 구분된 종양 경계가 특징; ii) 상피 침윤, 즉 종양 세포 군집이 인접한 뇌 실질에 성상세포 봉인 없이 침투하는 경우; 그리고 iii) 확산성 침윤성으로, 단일 종양 세포나 작은 군집이 광범위하게 침투하여 광범위한 아스트롤글리오시스를 유발하는 특징입니다^10,12.

임상적으로 침윤성 HGP는 비침윤성 패턴에 비해 유의하게 더 나쁜 예후와 관련이 있습니다^{9, 10, 11}. 더불어, HGPs는 종양 성장 역학과 신경학적 사망으로 이어지는 메커니즘의 핵심 측면을 반영하는 것으로 보입니다. 비침윤성 전이는 일반적으로 단일 병변으로 확장되어 뇌의 주요 구조를 제한하는 반면, 침윤성 병변은 중추신경계 내에서 2차 확산(기존 병변에서 시작, 원발 종양에서 시작하지 않음)하여 광범위한 손상과 완전한 장기 파괴에 기여합니다(미공개 데이터). 침윤성 병변은 또한 수막을 다시 정착시켜 수막 전이를 촉진하고^{병과 과정을} 더욱 복잡하게 만들 수 ^{있습니다.} 임상적 관련성에도 불구하고, 뇌 전이의 HGPs와 중추신경계 최종 정착 단계(동일 장기의 2차 전파 및 재정착 포함)는 적절한 실험 모델이 부족해 아직 연구가 부족하다.

이 격차를 해소하기 위해, 우리는 실험 쥐의 대뇌 피질에 종양 세포 또는 종양 세포와 하나 이상의 비종양 세포 유형을 포함해 세포 혼합물을 정밀하고 재현 가능하게 이식할 수 있는 입체 정각 두개내 주입 모델을 제시합니다. 이 모델은 전신 전이 모델의 주요 한계를 극복하고, 중추신경계 집락화의 필수적 측면을 조사할 수 있는 견고한 기반을 제공합니다. 예를 들어, 집락화 과정의 종양-면역 세포 상호작용¹⁴, 사전 처리 세포 혼합물의 영향¹⁵, 전이성 성장¹⁶, HGP 특이적 성장 역학 및 신경학적 실패에 기여하는 병태생리학적 기전(미공개 데이터) 등이 포함됩니다. 또한 이 모델은 재현 가능하고 임상적으로 관련된 맥락에서 약리학적 검사를 지원합니다^14,15.

이 프로토콜은 뇌전이에서 HGP를 연구하기 위해 입체정위 주입 모델을 구현하기 위한 상세한 방법론적 틀을 제공합니다. 또한 후기 중추신경계 집락 생물학의 체계적 연구를 위한 구조화된 전임상 샘플 아카이브와 디지털 조직 라이브러리 개발을 지원합니다. 우리의 목표는 예후 및 잠재적 예측 바이오마커의 식별을 가능하게 하고, 개선된 치료 전략 개발에 기여하며, 뇌 실질과 면역계의 급성 및 만성 반응 예측 능력을 향상시키는 것입니다. 이 접근법을 통해 중추신경계 정착과 전이 진행에 대한 체계적인 연구를 위한 표준화된 플랫폼을 제공하고자 합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 기술된 모든 동물 시술은 기관 지침에 따라 수행되었으며 하부 프랑켄 정부(허가 번호: RUF-55.2.2-2532-2-1678)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 뇌의 전이 정착 모델로서 10-12주 된 동생 생쥐에서 종양 세포를 입체피질 내 주입하는 모델로 설계되었습니다. 프로토콜에 변경 사항이 있으면 지정된 동물 복지 담당자와 상의해야 합니다.

1. 수술 전 절차

1. 동물의 고산 적응
   참고: 쥐는 실험 절차 시작 최소 7일 전에 고대에 적응해야 합니다.
   1. 실험동물을 표준 실험실 조건(22± 2°C, 상대습도 50-60%, 12시간 빛/어둠 주기 하에 그룹으로 키우며, 음식과 물을 자유 롭 게 이용할 수 있습니다.
   2. 복지를 증진하고 스트레스를 줄이기 위해 둥지 재료, 은신처, 갉아먹는 블록 등 환경 풍요를 제공합니다.
   3. 적응 기간 동안 동물을 하루 한 번(세션당 3-5분) 만져서 인간 접촉에 익숙해지도록 하세요. 또한, 침습적 개입 없이 다가오는 수술의 주요 측면을 시뮬레이션하는 모의 시술(체중 측정과 마취 장비 노출 포함)을 수행하세요. 이 세션들은 동물들이 절차적 환경에 익숙해지고 스트레스 관련 변동성을 최소화하는 것을 목표로 합니다.
2. 신체 검진(수술 전 건강 검진)
   참고: 종양 세포 주입 전에 모든 동물은 연구와 관련 없는 기존 이상을 배제하기 위해 철저한 신체 및 신경학적 검사를 받아야 합니다. 결핍이나 이상을 보이는 동물은 연구에서 제외해야 합니다. 신체 검진은 주사 전날에 시행할 수 있습니다.
   1. 털 상태, 자세, 호흡, 걸음, 체중, 전반적인 행동 등 전반적인 건강 상태를 평가하는 신체 검사를 실시합니다.
   2. 행잉 와이어 테스트를 사용하여 신경 기능을 평가하여 그립 강도와 협응력을 평가합니다. 행잉 와이어 테스트를 수행하려면 두 지지대 사이에 직경 약 2mm의 수평 와이어를 매달고, 탈출 플랫폼은 패딩 표면 위 약 30cm 위에 위치시킵니다. 마우스를 와이어 중앙에 두고 앞발로 와이어를 잡게 하세요. 마우스를 놓고 바로 타이밍을 맞추기 시작하세요. 마우스가 플랫폼 중 하나에 도달하거나 떨어지면 시험을 종료하세요. 마우스가 60초 이내에 플랫폼에 도달하면 성공한 것으로 간주합니다; 이 시간 내에 낙하하거나 플랫폼에 도달하지 못하면 실패로 기록하세요.
3. 워크스테이션 준비
   1. 수술 당일(0일차)에는 아래에 설명된 대로 네 개의 전용 워크스테이션을 설치하여 효율적인 작업 흐름을 보장하고 시술 내내 멸균 기술을 유지하세요.
      참고: 멸균 수술용 재료(언더레이, 거즈 압박, 봉합사 등)와 오토클레이드 수술기구(메스, 겸자, 가위, 주걱 등)를 사용하세요.
      1. 워크스테이션 #1 - 수술 전 동물 준비: 이 워크스테이션을 사용해 쥐의 체중을 재고, 마취액을 준비한 후 마취를 투여합니다. 체중계, 마취된 쥐용 1mL 주사기, 그리고 눈 연고가 있는 두 개의 침구가 있는 우리, 마취 용액이 담긴 1mL 주사기, 그리고 눈 연고를 준비하세요.
      2. 워크스테이션 #2 - 수술 전후 세팅: 이 워크스테이션을 사용해 두피 절개, 두개골 봉합, 상처 봉합을 수행합니다. 깨끗한 표면에 메스, 0.9% NaCl이 들어간 10mL 주사기, 뼈 왁스, 주걱, 봉합 재료, 겸자와 가위, 면봉, 소독제(70% 에탄올), 진통제가 든 1mL 주사기, 온열 패드 또는 유사한 온열 플랫폼을 준비하세요.
      3. 워크스테이션 #3 - 종양 세포 준비: 이 워크스테이션을 사용해 접종 전에 종양 세포 용액을 준비하세요. 10 μL 해밀턴 주사기와 세포 외 기질(ECM) 배지에 세포를 현탁하는 에펜도르프 튜브가 담긴 아이스박스, 세포 재현탁용 100 μL 팁이 달린 피펫, 그리고 증류수, 70% 에탄올, 0.9% NaCl을 포함한 종양 세포 접종 후 해밀턴 주사기를 세척할 수 있는 세 개의 용기가 포함된 깨끗한 표면을 준비합니다.
      4. 워크스테이션 #4 - 입체 주입: 이 워크스테이션을 사용해 대뇌 피질에 입체 진위 종양 세포 주입을 수행합니다. 작은 동물을 위한 입체 정성 프레임, 정밀 치과 드릴, 대형 겸자, 면봉이 포함된 깨끗한 표면을 준비하세요.
4. 종양 세포 현탁액 준비
   참고: 종양 세포 현탁액 준비를 위한 모든 절차는 인증된 생물학적 안전 캐비닛(클래스 II 후드)에서 적절한 개인 보호 장비(PPE, 예비 가운, 장갑, 안구 보호구)를 사용하여 진행되어야 하며, 이는 멸균성을 보장하고 인원을 생물학적 위험 노출로부터 보호합니다.
   1. 1mL의 트립신 1x EDTA를 사용해 세포를 트립신화합니다.
      참고: 종양 세포는 기하급수적 성장 단계에서 사용하는 것이 권장됩니다.
   2. 적절한 계수 방법(예: 혈구계 또는 자동 세포 계수기)을 사용하여 정확한 세포 수를 측정하세요.
   3. 동물당 3 μL ECM 배지에 1 x 10^{3개의 세포} 를 포함하는 세포 현탁액을 준비합니다. ECM과 표준 배양지를 2:1 비율로 혼합하여 10% FCS 및 기타 보조제를 포함해 사용하세요. 동물 수에 따라 현탁 부피와 세포 수를 확대하세요(예: 10마리의 쥐를 위해 30 μL ECM 배지에 10개 ׳ 개 세포를 준비).
      참고: 각 세포주별로 주입 세포 수는 신중히 조절해야 합니다.
   4. 세포 현탁액은 주사 전까지 최대 2시간 동안 얼음 위에 보관하세요.

2. 수술 중 절차

1. 마우스 마취
   1. 정밀 저울로 각 마우스의 무게를 재고, 체중에 따라 필요한 마취제 양을 계산하세요.
   2. 계산된 마취량을 복강 내 투여.
      참고: 전체 시술(약 2시간)을 포함하는 마취 요법을 사용하세요. 예를 들어: 케타민 10%(염산염 케타민, 100 mg/mL; 체중 100 mg/kg)와 도미토르(메데토미딘 염산염, 1 mg/mL; 체중 0.25 mg/kg)를 병용하는 경우, 또는 이에 상응하는 프로토콜.
   3. 마취 깊이가 충분히 확인되면, 체온 조절을 돕기 위해 미리 데워진 온열 패드(37-38 °C로 유지)에 마우스를 올려놓고, 각막이 건조해지지 않도록 눈 연고를 발라줍니다.
      참고: 뒷발을 겸자로 부드럽게 꼬집어 충분한 마취 깊이를 확인하세요. 금단 반사가 관찰되지 않는 경우에만 수술을 진행하세요.
2. 두피 준비 및 절개
   1. 수술 전 절개 부위에 국소 마취를 제공하기 위해 리도카인을 투여하세요. 1% 리도카인 용액(5 mg/mL)을 사용하고, 계획된 절개선을 따라 약 0.05-0.1 mL를 피하에 주입하세요. 두피 절개를 진행하기 전에 마취제가 효과를 낼 때까지 최소 2-3분을 두세요.
   2. 요오드 기반 용액으로 두피를 철저히 소독하세요.
   3. 피부를 팽팽하게 늘린 후 멸균 메스로 두개골을 따라 약 3-4mm 중앙선 절개를 하세요.
   4. 같은 메스를 사용해 골막을 부드럽게 긁어내어 두개골 표면을 드러내세요.
3. 입체정위 프레임 설정, 좌표 식별 및 두개골 절개
   1. 귀 막대를 이용해 마우스의 머리를 입체정위 프레임에 고정하세요.
   2. 입체정정팔을 사용해 브레그마(관상봉합사와 시상두개봉합사의 교차점을 찾아내고, 정위팔을 전방 2mm, 오른쪽으로 1mm 외측으로 이동시켜, 그림 1B 에 표시된 전두엽 피질 목표 주입 부위로 이동시키고 수술용 마커로 표시합니다.
      참고: 주사 부위에 혈관이 있을 경우, 출혈을 방지하기 위해 최대 0.5mm까지 위치를 조정할 수 있습니다.
   3. 정밀 치과 드릴로 두개골을 조심스럽게 뚫으세요. 경막을 뚫지 않도록 주의하세요.
   4. 살균된 겸자로 부드럽게 탐색하여 돌파 여부를 확인하세요.
4. 종양 세포 주입
   참고: 이 단계에서는 ECM이 실온에서 굳기 시작해 주입의 정확성과 일관성에 영향을 줄 수 있으므로 신속히 작업하세요.
   1. 종양 세포 현탁액을 피펫으로 위아래로 재현수하여 고르게 분포되도록 하세요.
      참고: 공기 방울 형성을 막기 위해 소용돌이 현상을 피하세요.
   2. 셀 현탁액 3 μL을 10 μL 해밀턴 주사기에 주입한 후 적절한 홀더를 사용해 입체 정위 프레임에 넣습니다.
   3. 주사기 바늘을 버 홀 위에 조심스럽게 위치시키세요.
      참고: 주사 시 재현성을 높이기 위해 바늘의 베벨이 왼쪽을 향하도록 하세요.
   4. 바늘을 뇌 조직 깊숙이 수직으로 3.5mm 깊이로 삽입합니다. 이 깊이에 도달하면 주사 중과 후에 세포 현탁 역류를 방지하기 위해 바늘을 0.5 mm 천천히 빼세요.
   5. 종양 세포 3μL을 1분 동안 천천히 주입하세요. 전체 부피를 투여한 후에는 바늘을 2분 더 고정시켜 세포와 ECM이 안정될 시간을 주어 역류 위험을 최소화하세요.
   6. 조심스럽게 주사기를 빼고 마우스를 입체 정위 프레임에서 분리하세요.
5. 봉합 및 마취 회복
   1. 멸균된 0.9% NaCl 용액으로 두개골을 부드럽게 헹구세요.
   2. 골왁스로 버 홀을 건조하고 밀봉하세요.
   3. 두피 절개 부위를 3에서 4개의 봉합사로 봉합하며, 각 봉합사는 상처 가장자리 가까이에 세 개의 단단한 매듭을 세워 제대로 치유되도록 합니다.
   4. 지정된 식별 번호에 맞는 귀 펀치 패턴으로 쥐의 귀를 표시하세요.
   5. 회복 중 각막 건조를 방지하기 위해 필요하면 눈 연고를 다시 발라주세요. 즉시 쥐를 37-38°C에서 미리 데워진 온열 패드로 돌려보내 체온 조절을 지원하고 마취 회복을 원활하게 하세요.
      참고: 회복 기간 동안 깨어 있는 동물과 회복 중인 동물 간의 상호작용으로 인한 부상을 방지하기 위해 쥐를 개별적으로 키우는 것이 권장됩니다.
   6. 해밀턴 주사기는 바늘과 배럴을 세 차례 차례로 세척하여 철저히 세척하고 소독합니다: 먼저 증류수로, 그 다음 70% 에탄올로, 마지막으로 멸균된 0.9% NaCl 용액으로.
   7. 세척 후에는 해밀턴 주사기를 얼음에 보관해 다음 사용 시까지 보관하세요.

3. 수술 후 절차

1. 수술 후 진통
   1. 마취 상태인 동안 피하 진통제를 투여하여 즉각적인 수술 후 통증 완화를 보장합니다.
      참고: 이 시술에 적합한 진통제를 사용해야 합니다. 예를 들어, 체중 10mg/kg에서 카프로펜을 복용하는 경우입니다.
   2. 쥐가 완전히 깨어서 정상적인 운동 기능을 회복하면, 깨끗한 우리와 새 깔개로 옮기세요. 동물의 정상적인 행동과 호흡 패턴을 잠시 관찰하세요.
   3. 완전 회복 후에는 최소 24시간 동안 마시는 물(예: 메타미졸, 체중당 200 mg/kg)을 통해 진통을 제공하세요.
      참고: 물 섭취를 유도하려면 식수에 0.5% 자당으로 감금하세요. 음료 병은 알루미늄 호일로 감싸 용액을 빛으로부터 보호하고 매일 교체하세요. 각 병에 진통제 섭취량을 추적할 수 있도록 라벨을 붙이세요. 진통제 를 마시 지 않거나 통증 징후가 관찰되면, 완전한 회복 때까지 12시간마다 카프로펜(체중당 10 mg)을 피하 투여하세요.
2. 마우스 모니터링
   1. 수술 후 첫 48시간 동안 모든 쥐를 24시간마다 면밀히 관찰하며 운동 기능과 행동을 평가하세요. 3일째부터는 최소 3일마다 체중 측정을 포함해 쥐를 모니터링하세요.
   2. 고통이나 비정상적인 행동(예: 운동 기능 저하, 이상한 행동)이 관찰되면 앞서 설명한 매달린 와이어 검사를 실시하세요. 만약 쥐가 검사를 통과하면 계속 모니터링하고 격일로 검사를 반복하세요.
   3. 미리 정의된 인도적 기준 중 하나를 충족하면 즉시 안락사(3.4절 참조): 초기 체중 대비 체중 20% 감소(0일차), 매달린 와이어 테스트 통과 실패, 또는 최대 48시간 지속되는 중간 정도 고통 지속 시 >.
3. 치료 (선택 사항)
   1. 수술 후 완전한 회복 후에는 실험 설계에 따라 치료 요법을 시작할 수 있습니다. 이 경우 연구 프로토콜에서 치료 시작 시기를 명확히 정의하고, 치료 개입의 예상 효과와 잠재적 부작용을 반영하도록 모니터링 계획을 조정하십시오.
      참고: 동물이 정상적인 행동, 안정된 체중, 수술 후 불편함 징후가 없을 때까지 치료를 시작해서는 안 됩니다.
4. 안락사와 조직 채취
   참고: 쥐는 특정 연구 목표에 따라 미리 정해진 인도적 기준 또는 지정된 실험 시점에 즉시 안락사되어야 합니다.
   1. 적절한 방법으로 쥐를 마취하세요(2.1.2 단계 참조).
   2. 흉강을 열고 얼음처럼 차갑게 멸균된 0.9% NaCl 10-20 mL를 사용한 심장경관류를 시행하고, 이어서 얼음처럼 차갑게 4% 파라포름알데히드(PFA)를 10-20 mL 투여합니다.
      참고: 후속 적용(예: RNA 분리 또는 FACS)에 신선한 조직이 필요한 경우, PFA 관류 단계를 생략하십시오.
   3. 뇌와 관심 있는 다른 장기들을 수집하세요.
      참고: 이 기관들은 액체 질소에 급동하거나, FFPE 처리를 위해 포르말린에 고정하거나, 직접 후속 분석에 사용할 수 있습니다.
5. 구조화된 사후 분석
   참고: 전이성 성장을 확인하고 관련 조직병리학적 특징을 특성화하기 위해, 뇌 조직의 사후 분석은 원래(신선하게 냉동된) 샘플과 고정(FFPE) 샘플 모두를 사용하여 수행해야 합니다.
   1. 조직 해리
      1. 주입 부위 수준에서 뇌를 해부하는데, 이는 그림 1C에 제시된 도식에 따른 것입니다.
      2. 앞부분은 신선한 냉동(FF) 가공을 위해 남겨두세요. 이 부분을 주입된 반구(i.)와 주입되지 않은 반구(n.i.)로 나누세요.
      3. 포르말린 고정 및 파라핀 임베딩(FFPE)을 위해 중앙 부분을 보존하세요.
      4. 소뇌와 뇌간을 포함한 후방 부분은 버리세요.
   2. 샘플 처리
      1. 앞부분을 액체 질소에 급동한 후 -80 °C에서 재사용될 때까지 보관합니다.
      2. 중앙 부분을 4% PFA 5-7mL에 48시간 고정한 후 FFPE 처리를 합니다.
         참고: PFA 고정은 유해 연기에 노출되지 않도록 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 화학 훈기 후드에서 반드시 시행해야 합니다.
   3. 전이 부하 정량화 (FF 샘플)
      1. 뇌 조직에 최적화된 적절한 추출 키트나 프로토콜을 사용하여 총 RNA를 분리합니다.
         참고: RNA 분리는 유해 시약에 대한 오염과 노출을 방지하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용한 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다.
      2. Ck8과 같은 종양 세포 특이적 마커를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)을 수행합니다.
         참고: 추가 표적(예: 면역 또는 기질 세포 표지자)은 적절한 유전자 표지를 선택하여 평가할 수 있습니다. RNA 시퀀싱(RNA-seq)은 전사체 전체 분석의 대안으로 사용될 수 있습니다.
      3. 관심 유전자(GOI, 예: Ck8)를 하우스키핑 유전자(HK)로 정규화하여 상대적 종양 부담을 계산합니다.
   4. 조직학적 분석(FFPE 샘플)
      1. 포르말린 고정 조직을 파라핀에 박습니다.
      2. 미세척기 절단기를 사용해 샘플을 3 μm 두께의 절편으로 나눕니다.
         참고: 미세토름 사용은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 갖춘 훈련된 인력이 수행해야 하며, 절단하지 않을 때는 칼날 가드를 사용하고, 날을 날카로운 용기에 보관하여 안전을 보장합니다.
      3. Ck8(종양 세포), Cd3(T 세포), Iba1(미세아교세포/대식세포), Gfap(성상교세포) 등 관련 항체를 사용하여 표준 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색 및 면역조직화학(IHC)을 수행합니다.
         참고: H&E 및 IHC 시술은 안전을 보장하고 화학물질 노출을 방지하기 위해 반드시 환기가 잘 되는 장소나 훈풍 후드에서 이루어져야 합니다.
      4. 고해상도 슬라이드 스캐너를 사용해 모든 착색된 슬라이드를 디지털 스캔하여 디지털 조직 라이브러리를 구축합니다.
      5. 발표된 프로토콜^10,12에 따라 뇌 전이의 조직학적 성장 패턴(HGP)을 평가합니다.

결과

입체정관 주입 프로토콜(그림 1)은 과학적 질문에 따라 야생형 또는 유전자 변형 균주를 포함한 공동 생체 및 이종 이식 마우스 모델 모두에 적용할 수 있습니다. 뇌에서 성장할 수 있는 적합한 세포주를 사용할 수 있습니다. 뇌를 정착시킬 수 있는 쥐 종양 세포주의 예로는 유방 종양 세포 4T1과 410.4, 대장암 세포 CMT93, 흑색종 세포주 B16-F10이 있으나 이에 국한되지 않습니다. 종양 세포가 뇌에서 전이하는 데 걸리는 시간은 세포주마다 다르며, 며칠에서 몇 주까지 다양하며, 투과율도 변동성이 있습니다. 우리는 ~70% 투과율을 가진 모델을 권장하며, 이는 최대 실험 기간 20주 이내에 최소 10마리 중 7마리가 전이가 발생한다는 의미입니다(그림 2A). 각 세포주는 개별적으로 최적화되어야 하며, 주입된 세포 수는 신중하게 조절되어야 합니다.

예를 들어, 우리는 두 가지 밀접하게 관련된 유방암 뇌전이 모델인 410.4와 그 파생 4T1을 비교했습니다. 유전적 유사성에도 불구하고^이 세포주들은 뇌에서 전이성 행동과 성장 패턴에서 현저히 다른 모습을 보인다¹⁶. 두 기관 모두 유사한 전이 부담을 달성하지만(그림 2B), 각각 고유한 시간 경과(그림 2C)와 명확히 구별되는 HGPs(그림 2D)를 보입니다. 서로 다른 세포주 간 집락화 효율을 체계적으로 평가하고 비교하기 위해, 우리는 주입된 세포 수, 중간 생존 시간, 집락화 성공률을 통합한 수학 공식인 콜로니제이션 지수를 개발했습니다(그림 2E-G).

처음 입위 주사를 시행하거나 새로운 세포주를 시험할 때는 성장 패턴을 신중히 평가하고 동물, 수술, 실험자 간의 결과를 비교하여 재현성을 보장하는 것이 필수적입니다. 중요한 단계 중 하나는 종양 세포 주입으로, 이 과정에서 세포 현탁액이 누출될 수 있습니다. 이로 인해 종양 위치를 오해할 수 있으며, 특히 종양 세포가 두개골 및/또는 수막에 시딩되는 것이 원인이 되어, 진정한 뇌내내 정착과 이차 수막 전이를 나타내지 않는 위양성 수막 전이가 발생할 수 있습니다. 이러한 시나리오들은 그림 3에 나와 있습니다.

그림 1: 마우스에서 입체정위 피질 내 종양 세포 주입의 전, 수술 중, 수술 후 절차. 절차의 도식적 개요. (A) 수술 전 단계에는 동물 적응, 건강 평가, 수술 부위 준비 및 종양 세포 현탁이 포함됩니다. (B) 수술 중 단계는 마취 유도, 두피 절개, 입체 정위 프레임 삽입, 정밀 두개술, 입체 정위 좌표를 이용한 대뇌 피질에 종양 세포 주입, 상처 봉합 및 마취 후 회복을 포함합니다. (C) 수술 후 단계는 진통제 투여, 수술 후 회복 상태를 평가하기 위한 정기 모니터링, 전반적인 건강 상태, 신경학적 증상 발달(행잉 와이어 검사)으로 구성되며, 이후 안락사 및 장기 적출이 이어집니다. 신선 냉동(FF) 조직에서 qPCR을 이용한 전이 부하를 평가하고 디지털 슬라이드 라이브러리에서 FFPE 샘플의 조직학적 성장 패턴을 평가하기 위한 구조화된 사후 분석도 포함되었습니다. 주요 시술 단계는 순서대로 설명되어 시기와 수술 워크플로우를 강조합니다. BioRender로 생성된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 4T1 및 410.4 유방암 세포의 입체정위 주사 후 뇌 전이 마우스 모델에서 전이 증식의 대표 결과. (A) ECM 주입 대조군 Balb/C 마우스에서 종양 성장이 없음을 보여주는 거시적 이미지(대조군)와 종양 세포-ECM 현탁 주사 마우스에서 눈에 띄는 전이 병변 존재를 보여줌 (Met). (B) ECM 주입 대조군 마우스(CTRL) 및 4T1 및 410.4 유방암 세포에서 유래한 뇌 전이 마우스에서의 전이 부담 정량화. 전이 부하를 qPCR로 평가하였으며, Gapdh와 Pgk1을 하우스키핑 유 전자(HK)로 사용하였습니다. 데이터는 개별 데이터 포인트가 포함된 평균값으로 제시됩니다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용한 후 Dunnett의 다중 비교 검정(n = 5; ****P < 0.0001)을 사용했습니다. (C) ECM 단독 입체식 주입 마우스(대조군, 검은색), 4T1(주황색) 또는 410.4(파란색) 종양 세포의 전체 생존율(OS)을 비교한 Kaplan-Meier 생존 곡선. 통계 분석은 로그랭크(Mantel-Cox) 검정(4T1 대 410.4; n = 10; ***P < 0.001)을 사용하여 수행되었습니다. (D) 4T1 및 410.4 세포에서 유래한 뇌 전이의 대표 조직학적 이미지로, 각각 코호트 및 가닥 유사 침윤 상피 HGPs를 포함한 성장 패턴의 차이를 보여줍니다. 조직 절편은 항세포케라틴 8항체로 염색하였다. (E) 집락화 지수(CI)를 이용한 집락화 효율성 비교 분석. CI 값은 4T1(주황색)과 410.4(파란색)로 표시됩니다. (F) CI 계산에 사용되는 공식. (G) 두 모델 모두 CI에 포함된 매개변수를 요약한 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 성공적이거나 최적이 아닌 입체 주사 결과의 대표적 예시. (A,C) 거시 영상은 다양한 부위에서 전이성 성장을 보여줍니다: (A) 종양 세포의 잘못된 주입과 누출로 인한 두개골과 수막의 종양 성장, (C) 적절한 피질 내 주사 후 성공적인 실질적 전이. (B, D) 해당 조직학적 절편은 (B) 수막 내 종양 성장과 이후 뇌 실질로의 침윤, (D) 확립된 실질전이로 인한 수막으로의 2차 전이 확인. 조직 절편은 항세포케라틴 8항체로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

입체정위 두개내 주입 기법은 실험 마우스의 대뇌 피질에 종양 세포나 세포 혼합물을 정확하고 국소적으로 전달할 수 있게 합니다. 구조화된 사후 분석과 결합할 때, 이 모델은 전이 증식, 2차 장기 내 전종, 사망 원인 등 뇌 전이의 후기 단계를 연구하는 데 특히 가치가 있습니다. 반면, 전신 주사 방법(예: 꼬리정맥 주사나 심장 내 주사)은 종양 세포 생존, 유출, 원리 장기의 씨앗 형성 등 전이 연쇄 초기 단계를 조사하는 데 더 적합합니다. 그러나 이러한 접근법은 뇌 특이적이지 않으며, 일반적으로 뇌 정착 비율이 낮고 일관성 없는 비율을 초래합니다 18,19,20.

전신 모델은 특히 어떤 뇌 영역이 영향을 받는지에 대해 생물학적 변이성이 높아 치료 연구가 어렵고 대규모 동물 집단이 필요합니다. 또한, 동물은 종종 두개외 전이가 발생하여 조기 임상시험 중단으로 이어질 수 있습니다¹⁹. 이러한 한계는 후기 뇌 전이 연구의 유용성을 크게 떨어뜨립니다. 더불어, 2차 전파와 재정착은 전신 모델로 조사하기 특히 어렵습니다. 1차 전이(원발 종양에서 기원)와 2차 전이(이미 확립된 전이에서 비롯된 2차 전이를 구분하는 것이 거의 불가능하기 때문입니다). 더욱이, 특히 거대 전이 성장과 뇌 전이의 HGP 평가를 위한 구조화된 사후 분석은 이러한 환경에서 제한적입니다.

환자 유래 오가노이드(PDO)나 유기형 뇌 절단(co)배양 ^21,22,23,24와 같은 체외 시스템과 비교할 때, 입체 주입은 몇 가지 중요한 장점을 제공합니다. 외부 생체 모델은 뇌 구조의 일부 측면을 보존하고 환자나 기증자의 상주 및 침투 면역 세포를 포함할 수 있지만, 혈관 형성, 전신 신호 전달, 그리고 특히 T 세포나 기타 혈액 또는 골수 유래 면역 세포의 추가 침투 등 생체 내 종양 미세환경의 복잡성을 완전히 갖추지 못합니다²³. 이러한 한계는 단기 연구나 약물 스크리닝이나 기본적인 세포-뇌 상호작용 검사와 같은 단순화된 환경에서의 적용을 제한합니다. 반면, 입체정관적 접근법은 살아있는 온전한 유기체 내에서 종양 진행, 면역 반응, 치료 개입에 대한 장기 연구를 지원합니다. 중요하게도, 신경학적 증상을 인도적 평가 지표로 평가하면 거대 전이 발병의 임상적으로 중요한 측정이 가능해집니다. 이로 인해 모델은 인간 질병 경과를 더욱 반영하게 되며, 이는 특히 중개 연구에서 매우 유용합니다. 동물 사용을 포함하며 3R(대체, 환원, 정제) 준수를 통해 윤리적 고려사항을 제기하지만, 현재 이 모델은 체외 대안으로 완전히 대체할 수 없습니다. 뇌 전이의 생리학적 맥락을 완전히 재현할 수 있는 능력은 전이 역학과 중추신경계 특이적 병태생리학에 대한 이해를 발전시키는 데 필수적입니다.

수많은 장점에도 불구하고, 입체 주입 모델은 고려해야 할 몇 가지 한계가 있습니다. 주요 우려는 주사 시 종양 세포 현탁액이 누출될 수 있어 오해를 불러일으키는 성장 패턴을 초래할 수 있다는 점입니다. 특히, 종양 세포가 수막에 의도치 않게 부착되면 병원성 수막 전이가 발생할 수^있는데, 이는 이 세포주에서 자연스러운 전이 경로를 정확히 반영하지 않습니다. 데이터 신뢰성을 보장하기 위해 특정 종양 세포주의 성장 패턴은 동물, 수술 절차, 실험자 간에 일관되게 비교되어야 합니다. 종양 세포 누출을 최소화하기 위해, 젤 같은 질감과 체온에서 고화되는 능력이 유용한 도구인 세포외기질(ECM)을 사용할 것을 제안합니다. 하지만 ECM은 조기 응고를 방지하기 위해 주입 중 신속한 취급이 필요한 등 도전 과제도 존재합니다. 우리 프로토콜에서 또 다른 고려사항은 종양 세포를 ECM과 혈청 함유 배지의 혼합물에 주입한다는 점입니다. FBS는 뇌에서 일반적으로 제한된 영양소를 공급하여 종양 세포 착립을 촉진하지만, 염증을 촉진할 수도 있습니다. 이런 점이 걱정된다면, 혈청 없는 배지나 균형 잡힌 소금 용액(예: HBSS 또는 PBS)을 대안으로 사용할 수 있습니다.

또한, 입체정위 주사는 정맥 주사(i.v.) 주사와 같은 다른 방법보다 기술적으로 더 까다롭습니다. 재현성을 보장하기 위해 특별한 훈련이 필요하며, 수술은 훨씬 더 오래 걸려 동물당 15-30분이 소요되는 반면, 정맥주사 주사는 3-5분이 소요됩니다. 이 긴 기간은 세션당 처리할 수 있는 동물 수를 제한하여, 통계적 검정력을 달성하기 위해 대규모 코호트가 필요한 치료 연구에 도전이 될 수 있습니다. 그러나 이 한계는 주사를 며칠에 걸쳐 분산함으로써 효과적으로 해결할 수 있는데, 이는 실험의 유연성과 실현 가능성을 높일 뿐만 아니라 종양 세포 행동과 숙주 반응에서 보다 현실적인 개인 간 차이를 반영하는 귀중한 생물학적 변동성을 도입합니다.

마지막으로, 이 모델은 앞서 논의한 전이 연쇄 과정의 이전 단계를 우회한다는 점을 주목할 필요가 있습니다. 적절한 실험 모델은 연구 질문과 연구하는 전이의 구체적인 단계를 바탕으로 선택되어야 합니다. 후기 뇌 정착 연구를 위해서는 입체정위 피질 내 주사가 여전히 골드 스탠다드로 남아 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동물용 귀 펀치 플라이어	랩아트
Bepanthen® 눈과 코 연고	바이엘 바이탈 GmbH	1578675
본 왁스	B. 브라운	210434
면봉	하트만	143213
Cultrex 베이스먼트 멤브레인(ECM) 추출물	B& D	3432-005-01
소독제	B. 브라운	그리고 nbsp; 107190
드릴 비트	빌라니 컨설턴츠 GmbH	D #76
눈 가위	헤르멜	501
해밀턴 주사기 (10µ L 볼륨)	VWR	5491135
온열 패드와 nbsp;	인터가스로	258122
마우스 나세/투스 바 검사 (900/1430)	빌라니 컨설턴츠 GmbH	DKI 926-B
노이스 눈가위	헤르멜	545
파우어 60° 팁 논 놉토레 마우스 귀 봉	빌라니 컨설턴츠 GmbH	DKI 922
메스	PFM 메디컬 AG	17027
셈킨 표준 겸자	헤르멜	710
세랄론 폴리아미드 봉합사 (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	세라그-비에스너 GmbH	V0053491
스테레오택식 드릴 - 제이콥스 척 - 18000rpm	빌라니 컨설턴츠 GmbH	DKI 1471-200-CE-A
랫 어댑터 없는 입체 주체	빌라니 컨설턴츠 GmbH	DKI 963 % 920
5& 10µ l 해밀턴	빌라니 컨설턴츠 GmbH	DKI 1772-F1
TC 바늘홀더 메이요-히어 160mm	헤르멜	6425