돼지 장 조직에서 crypt와 중간엽 기질 세포를 최적화하여 순차적으로 분리하는 방법

Summary

본 연구는 돼지 공주조직에서 장 납골 및 장 중엽 기질세포(iMSCs)를 순차적으로 분리하는 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 재현 가능하고 생리학적으로 중요한 상피-기질 공동 배양 모델을 개발하여 장 항상성과 재생 중 세포 간 교차 대화를 연구하는 데 적합한 2D 장내 단층과 iMSC를 생성합니다.

Abstract

장 상피는 기저의 장 간엽 기질 세포(iMSCs)와 밀접하게 상호작용하여 발달, 항상성, 재생을 조절합니다. 그러나 돼지 조직에서 상피 및 기질 분획을 순차적으로 분리하는 표준화된 방법은 제한적입니다. 이 프로토콜은 같은 새끼 돼지 구간에서 crypt와 iMSC를 분리하는 최적화된 단계별 과정을 설명합니다. 이 방법은 에틸렌디아미네테트라아세트산/디티오트레이톨(EDTA/DTT) 기반 해리 완충제를 사용하여 크립트를 방출한 후, 콜라게나제/분산 소화로 세포외 기질을 분리하여 iMSC를 분리합니다. 이 방법은 분리된 셀 내 공간적 변동을 최소화합니다. 분리된 크립트는 성공적으로 배양되어 콜라겐 하이드로겔 코팅판 위에 전형적인 확장형 2차원(2D) 장내 단층층을 형성하였습니다. 배양된 iMSC는 배양 플라스크에 부착하여 면역염색을 통해 확인된 혈소판유래 성장인자 수용체 알파(PDGFRα)와 분화 81군집(CD81)과 같은 기질 표지를 발현하였습니다. 전반적으로 이 최적화된 분리 프로토콜은 동일한 돼지 공주체 마디에서 상피세포와 기질 세포를 모두 산출하여, 장내 오가노이드와 iMSC 공동 배양 시스템을 포함한 향후 연구를 통해 돼지의 상피-기질 상호작용을 조절하는 메커니즘을 밝히는 재현 가능한 기반을 마련합니다. 이는 인간 생리학 복제와 동물과학 발전에 있어 번역적으로 중요한 모델입니다.

Introduction

장 상피는 점막 손상 후 장의 항상성을 유지하고 재생을 촉진하기 위해 지속적인 자기 갱신과 분화를 겪는 역동적인 조직입니다 ^1,2. 장 상피세포는 장내 줄기세포(ISCs)에서 유래하며, 다양한 미세 환경 인 자 ^3,4,5,6,7,8과 상호작용합니다. 상피하 구획은 주로 고유층과 근막막(muscularis mucosa)으로, 서로 다른 계통의 다양한 세포군으로 구성되어 있습니다⁹. 이들 세포군 중에서, 장간엽 기질 세포(iMSCs)는 섬유아세포와 근섬유아세포를 포함하며, ISC 줄기의 형성, 증식, 분화를 조절하여 상피 항상^{성과 재생을} 조절하는 영양 및 성장 인자를 ^{생성합니다.}

이러한 세포 상호작용을 연구하기 위해 최근 연구들은 장 상피세포와 iMSC 교차 반응을 유발하는 가능한 작용 기전을 밝히는 새로운 접근법을 개발했습니다. 오가노이드와 기질 또는 면역 세포를 결합한 공배양 시스템은 발생, 재생, 약물 스크리닝 및 질병 모델링 중 상피-상피하 세포 상호작용에 대한 이해를 진전시켰습니다 12,13,14,15,16,17. 그러나 대부분의 오가노이드 공동 배양 연구는 쥐 조직을 사용했는데, 이는 인간 생리와 질병 표현형을 효과적으로 모방하지 못해 임상적 번역 중요성이 제한적^이다.

대부분의 쥐 장 분리 프로토콜에서는 상피세포와 기질 세포를 별도의 조직 구간에서 채취하는데, 이로 인해 샘플이 약간 다른 특성을 반영하여 실험 간 재현성에 영향을 줄 수 있습니다^19,20. 현재 동일한 조직 샘플에서 돼지 장 납골당과 iMSC를 분리하는 표준화된 최적화 프로토콜은 없습니다. 더불어, 적합한 인간 장 샘플 확보에 실질적인 한계가 있어, 많은 연구자들이 상피-중간엽 세포 교차 반응을 평가하기 위해 서로 다른 장기(예: 피부 섬유아세포가 있는 인장)의 불일치 세포 유형에 의존하게 만들었으며, 이는 데이터 해석을 혼란시킬 수 있습니다 21,22,23.

최근 발표된 인간 장 생검 프로토콜은 남은 상피 고갈된 조직에서 성장하여 납골 지하 구간을 분리하고 섬유아세포를 얻었으나, 돼지에서는 이에 비례하는 표준화된 접근법이 부족하다²⁴. 돼지는 해부학적, 생리학적으로 인간과 유사하기 때문에 번역 연구에 적합한 동물 모델로 사용된다 2,18,25,26,27,28,29. 따라서 이 방법은 장의 생리적, 해부학적, 형태학적 구조를 바탕으로 동일한 돼지 주유관 마디에서 장 지하 지하와 iMSC를 회수하는 순차적 분리 프로토콜을 제시^합니다. 이 절차는 향후 돼지 장 공동 배양 연구에 적합한 크립트와 iMSC를 분리하는 재현 가능한 틀을 제공합니다.

Protocol

메릴랜드 대학교 칼리지파크 캠퍼스 돼지 시설에 보관된 21일 된 새끼 돼지의 근위 공주에서 5cm 크기의 조각이 해부되었습니다. 새끼 돼지를 희생하는 데 사용된 절차(R-6월 22일)는 대학의 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 동물 관리 및 사용 정책 지침을 따랐습니다. 분리 단계에 앞서 프로토콜 개요는 그림 1에 제시되어 있으며, 돼지 장 납골 및 iMSCs의 순차적 분리에 사용되는 시약 및 장비 목록은 재료표에 제공되어 있습니다.

1. 사전 분리 준비 단계

1. 5cm 조직 구간당 30mL의 세척 완충제를 50mL 원뿔형 튜브에 준비합니다.
2. 채취한 조직 샘플 수에 따라 부피를 조절하세요.
   참고: 워시 버퍼 조성은 표 1을 확인하세요. 모든 조직 준비와 세포 분리 단계는 작업대에서 이루어집니다.

2. 장 조직 준비 단계

1. 절제된 장 조직을 50mL 원뿔관 내 세척 완충제에 넣습니다.
   참고: 절제된 조직은 사용 전 1시간 동안 냉세척 버퍼에 보관할 수 있습니다.
2. 21G 주사기로 3× 냉각된 세척 버퍼로 조직을 세척하여 루미날 내용물을 제거합니다.
3. 조직을 멸균된 폴리스티렌 폼 표면에 올려놓고 혈청에서 장간막과 지방 조직을 조심스럽게 제거하세요.
4. 수술용 칼날을 사용해 조직을 종방향으로 해리하여 내강을 열어줍니다(그림 2A).
5. 부분적으로 세척된 해부 조직을 신선한 세척 버퍼에 옮기고 두 번 또는 완충제가 맑아질 때까지 세척합니다.
6. 조직을 100mm 페트리 접시의 세척 버퍼에 넣고, 새 수술용 칼날로 10-15mm 조각으로 잘라냅니다(그림 2B,C). 이 단계는 소화 완충제에 노출되는 표면적을 증가시킵니다.
7. 다진 조직을 새로운 50mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
8. 세척 버퍼로 부드럽게 세척한 후 다진 조직이 중력에 의해 약 30초간 가라앉도록 합니다(그림 2D).
9. 상정액을 부드럽게 흡인하고, 원뿔형 튜브 안의 조직 조각을 덮을 수 있을 만큼만 완충 공간을 남겨둡니다.
10. 상피 해리 단계
    1. 미리 예열된 상피 해리 완충제 30mL를 추가하고(표 2), 약 9× g의 정적 비드 욕조 또는 흔들리는 물에서 37°C에서 20-30분간 배양합니다.
    2. 15분마다 관을 부드럽게 흔들어 상피막에서 crypt가 방출되도록 하세요.
    3. 조직이 가라앉도록 기다린 후 혈청학적 피펫으로 상원액을 부드럽게 흡인하며, 원뿔관 안에 침착된 조직을 덮을 수 있을 만큼의 완충제만 남겨둡니다.
    4. 침전된 조직에 신선한 세척 버퍼 30mL를 넣고 세게 흔들어 융모, 지하 부위, 이물질을 제거한다(그림 3A). 조직 잔여물을 가라앉히게 한 후, 부유된 크립트 구간이 포함된 세척 완충 상원액을 100 μm 세포 체를 통해 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 부드럽게 데캔트합니다.
       1. 잔여 조직에 신선한 세척 완충제를 추가하고 3번(3×) 디캔팅하는 과정을 반복합니다. 크립트를 담은 10 μL 세척 버퍼를 100mm 페트리 접시에 피펫 넣고 입체 현미경으로 크립트 밀도를 검사합니다.
          참고: 모든 세척 후에는 크립트가 포함된 모든 워시 버퍼를 유지하세요.
    5. 세 번째 세척 후에는 지하 무덤을 포함한 세척 완충기가 최소한으로 깨끗해집니다(그림 3B).
       참고: 조직 잔여물은 세포외기질(ECM)과 함께 원뿔관 내에 보관하여 이후 iMSC 분리 처리를 위해 보관하십시오.
    6. 지하 부탁액을 150 × g 에서 실온에서 2분간 원심분리하여 지하 조각을 펠릿으로 뿌리세요.
    7. 지하 덩굴 펠릿을 흡입한 후 상피 배양 배양액에 재현탁하세요.
    8. 다시 150 × g 에서 2분간 원심분리하여 지하 조각 펠릿을 수집합니다.
    9. 상피 배양 배지를 추가하여 크립트를 재현탁하고 1,000 μL 피펫 팁을 사용해 5× 피펫을 사용합니다.
    10. 약 100개의 재현탁된 크립트를 미리 준비된 콜라겐 타입 1 하이드로겔 코팅 6웰 플레이트에 씨앗 채워 크립트를 2차원(2D) 엔테로이드 단층으로 배양하고 확장시킨다.
        참고: 표 3의 콜라겐 하이드로겔 코팅 플레이트 준비를 확인하세요. 최종 콜라겐 1형 농도는 1.0 mg/mL여야 합니다. 효모나 곰팡이 오염을 막기 위해 지나치게 밀도가 높은 지하실이나 잔해 조각을 도금하는 것을 피하세요. 세척 완충제와 배양 배지에 항생제-항진균제(anti-anti-anti)가 있으면 보호가 가능합니다.
    11. 세포를 역위상 차이 현미경으로 관찰한 후, 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
    12. 씨앗 후 12시간 이내에 배양지를 교체하여 떠다니는 이물질을 제거하고 박테리아 오염을 줄이세요.
    13. 장류체는 상피 배양 배양지를 사용해 배양하고(표 4), 약 8일째까지 매일로 매번 매료품을 교체하며, 확장된 2D 단층체가 서브컬처링을 위해 ≥85% 합류율에 도달할 때까지 사용한다.
11. 세포외 기질 해리 단계
    참고: 원뿔관 내 세포외기질 성분이 포함된 남은 조직 조각으로 분리 과정을 계속하세요(그림 3C 및 그림 4A).
    참고: 상피 해리 완충제 내 EDTA가 콜라겐제 활성을 억제할 수 있지만, 이전 세 가지 세척 단계에서는 모든 EDTA와 DTT가 제거됩니다. 따라서 이후 과정에서 콜라겐제 활성에 영향을 받지 않아야 합니다.
    1. 남은 조직을 다시 작은 조각으로 잘게 만든 후 고유층 선반의 iMSC를 분리합니다.
    2. 조직에 세포외 소화 완충제 25mL(표 5)를 추가하고, 37°C에서 정적 비드 욕조에서 15-20분간 배양합니다(그림 4B).
    3. 부화 후에는 세게 흔들기 마련.
       참고: 상정액은 흐려지고 떠다니는 조직 조각이 줄어듭니다. 상액 10 μL을 거꾸로 현미경으로 피펫하여 상액 내 iMSC의 밀도를 검사합니다. 관찰된 iMSC 밀도가 낮으면 비드배스에서 추가로 15분간 조직을 배양하세요.
    4. 상정액을 부드럽게 옮겨 100 μm 세포 체를 통과해 새로운 원뿔형 튜브로 옮겨 이물질을 최소화합니다.
    5. 세포 현탁액을 280 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리하여 iMSC를 펠릿으로 만듭니다.
    6. 상정액을 흡인하고 iMSC를 중간엽 배양 배지에 재현탁합니다( 표 6의 iMSC 배양 배지 참조).
    7. 재현탁된 iMSC를 280× g 에서 5분간 원심분리하여 해리 버퍼를 씻어내세요.
    8. iMSC를 흡입 후 간엽 배양 배양액에 재현탁합니다.
    9. iMSC를 T75 배양 플라스크에 약 5× 10⁵ 세포씩 배제합니다.
       참고: 중간엽 세포는 최적의 성장을 위해 중간 또는 높은 씨앗 밀도가 필요하므로 플레이트된 세포가 플라스크 표면적의 약 60%를 차지하도록 해야 합니다.
    10. 도금 후 12시간 이내에 배양 배지를 교체하여 과도한 이물질을 제거하고 박테리아 오염을 방지하세요.
    11. 씨앗 후 2일째에 역상차비현미경으로 섬유아세포 유사 세포를 관찰합니다.
        참고: 중간엽 배양 배지는 이틀에 한 번씩 교체하세요. iMSC는 약 85% 합류율에 도달하여 4일째까지 하층 배양 준비가 완료될 것입니다.

3. 면역세포화학 분석법

1. 96웰 플레이트에서 중간엽 배양 배양지를 사용해 2-3일간 웰당 약 5,000개의 iMSC를 배양하여 세포가 약 80% 합율에 도달할 때까지 배양합니다.
2. 배지를 부드럽게 흡인한 후, 배양된 iMSC를 100 μL 1× PBS/웰로 상온³¹에서 두 번 세척합니다. 면역염색 키트에 대한 모든 참고 자료는 재료표에 제공되어 있습니다.
3. 각 웰당 4% 파라포름알데히드(PFA) 100 μL를 첨가하여 배양된 iMSC를 고정하고, 실온의 정적 작업대에서 30분간 배큐합니다.
4. 고정된 배양된 iMSC를 0.1% Tween-20/PBS(PBST) 100 μL 용액으로 각각 5분간 두 번 세척한 후, 0.5% Triton X-100/PBS 100 μL 100 μL로 30분간 투과시킵니다.
5. 각 웰당 5% 소혈청 알부민(BSA)/PBST 100 μL을 첨가하여 고정 세포에 비특이적 결합을 차단합니다.
   참고: 실온에서 1시간 동안 두고, 100 μL PBST와 함께 각각 5분씩 두 번 세척하세요.
6. 각 웰에 희석된 1차 항체 100 μL(1:250; 즉, 1 μL 1 μL 1 × 250 μL 항체 희석제)을 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 배양합니다. 주요 항체는 PDGFRα와 CD81입니다.
   참고: 1차 항체 없이 항체 희석제만 첨가하여 음성 대조군 웰을 포함하세요.
7. 둘째 날에는 1차 항체를 100 μL PBST로 각각 5분씩 두 번 씻어내세요.
8. 2차 항체를 1× PBS에 희석하여 다음 비율로 사용한다: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL), DAPI (1 μL:800 μL).
9. 희석된 2차 항체로 세포를 상온에서 1시간 동안 카운터 염색합니다.
10. 세포를 1× PBS로 각각 5분씩 두 번 세척하세요.
11. 웰당 100μL 마운팅 매개체를 추가하고, 플레이트를 덮은 뒤 알루미늄 호일로 감싼 후 형광 영상 검사 후 최대 6개월간 4°C에서 보관합니다.

4. RNA 분리 및 qPCR 분석법

1. 산성 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 분리 기법을 사용해 T75 플라스크에서 배양한 iMSCs에서 총 mRNA를 추출합니다.
   참고: 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하세요.
2. 전체 mRNA를 cDNA로 역전사하여 선정된 Sus scrofa 유전자 프라이머 GAPDH(앞쪽: ATCCTGGGCTACACTGAGAC; 역방향: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG)의 증폭 플롯을 검증하는 템플릿으로 사용한다.

Results

상피 해리 과정에서 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)은 칼슘 이온을 킬레이트하여 칼슘 의존성 세포 간 유착을 방해하고, 디티오트레이톨(DTT)은 뮤신 당단백질 내 이황화 결합을 절단하여 점액 해리를 촉진합니다. 따라서 킬레이팅 화합물(EDTA)과 환원제(DTT)의 결합 사용은 세포외기질(ECM) 구조를 파괴하지 않으면서 상피막에서 크립트를 효과적으로 방출할 수 있게 합니다 ^2,32(그림 3). 크립트는 최소한의 ECM 교란으로 상피층에서 성공적으로 방출되었습니다(그림 3B,C). 장 상피 배양지에서 배양했을 때, 분리된 크립트는 콜라겐 코팅된 하이드로겔 표면에 장내 단층으로 부착되어 확장되었으며, 배지는 격일마다 교체되었습니다(그림 5A

Discussion

동일한 돼지 유주 마디에서 장 지하 납골과 iMSC를 분리하는 것은 조직 마디별 세포 및 기능적 특성을 보존하는 새로운 접근법을 제공합니다. 이는 장 조직이 이전 돼지 연구(2,36,37,38)에서 입증된 것처럼 지역적·공간적 동일성을 보이기 때문에 매우 중요합니다. 한 마디에서 분리된 지하 저장소와 먼 영역 또는 성장 배양에서 얻은 섬유아세포에 의존한 돼지나 기타 종에서의 기존 오가노이드 연구는 불일치 또는 생리학적으로 구별되는 미세 환경 지위를 초래할 위험이 있었다 24,28,33,35.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5만 EDTA	프로메가	PR-V4231
1 M HEPES 버퍼	서모피셔	15630080	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
1000 uL 피펫 팁	알칼리 사이언티픽 FT1000	104027-530
10배 PBS	인비트로젠	AM9624	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
1N 수산화나트륨	열학	SS266-1	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
HBSS 1회	서모피셔	14025092
1X PBS	하이클론	SH30256FS
4% 파라포름알데히드 (PFA)	서모피셔	AAJ61899AK
50 mL 원뿔관	서모피셔	12-565-271
6개의 웰 플레이트	피셔브랜드	FB012927
7.5% 중탄산나트륨 용액	코닝	MT25035CI	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
고급 DMEM/F12	깁코와 nbsp;	12634-010
알렉사 플루어 플러스 647	인비트로젠	A32728	2차 항체
Alexa 플러스 555 - A32732	인비트로젠	A32732	2차 항체
알루미늄 호일	레이놀즈	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
안티-앤티	깁코	15240096
B27	서모피셔	12587010
BSA	피셔브랜드	BP1600-100
CD81	프로틴인테크	66866-1-ig	1차 항체
세포 배양 등급 물	하이클론	SH30529FS	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
콜라겐, 1형	코닝	356236	콜라겐 하이드로겔 플레이트 준비를 위한
콜라겐제 IV	깁코	17104019
코닝 100mm 페트리 접시	코닝	07-202-011
크라이오스터 셀 냉동 보존 매체	줄기세포 기술	7930
세포용 크라이오비얼 및 nbsp;	피셔브랜드	1050026
다코 항체 희석제	다코/애질런트	부품 번호: S302283-2	1차 항체 희석제
다코 형광 장착 매체	다코/애질런트	부품 번호: S302380-2
다피	프로모셀/VWR	10180-470	DNA 염색
디스파즈 II	로슈	4942078001
DMEM, 고혈당	코닝	MT10013CV
DTT	시그마	646563
EGF	페프로텍	315-09
FBS (하와이)	아반토르	1300-500H
가스트린	아나스펙	AS-64149
젠타미신	MP 생의학	ICN1676045
글루타맥스	서모피셔	35050061
젠장	서모피셔	15630-080
역형광 마이크로스크로프	니콘	이클립스 Ti2	형광 영상
역위상 대비 현미경	니콘	이클립스 TS100	배양 세포 영상 촬영 및 nbsp;
iScript 고급 cDNA 합성 키트	바이오-래드	1725038	RT-PCR 키트
iTaq 유니버설 SYBR 그린 슈퍼믹스	바이오-래드	1725122	qPCR 키트
LWRN 조건부 미디어	ATCC	CRL-3276	LWRN 미디어는 ATCC 절차에 따라 자체 제작되었습니다
N-아세틸 시스테인	국회의원 약력	194603
나노드롭 2000 분광광도계	서모피셔	ND 2000
니코티나마이드	시그마	N0636-100G
바코드가 부착된 광학 384-웰 플레이트	응용 생명 시스템	4483285	qPCR 키트
PDGFRα	앱캠	AB230457	1차 항체
프로스타글란딘 E2 (PGE2)	케이맨 케미컬	14010
QuantStudio 5	응용 생물체계	A28570	qPCR 기기
SB202190	LC 연구소	S-1700
입체 현미경	니콘	SMZ745
T 75 플라스크	피셔브랜드	FB012937
트라이튼 X100	피셔브랜드	PI85111
트리졸 시약	인비트로젠	15596026
20대 초반, 100% 비이온 세제	바이오 라디	1706531
Y27632	에이펙스바이오	A3008-200