EasyFiji: 피지에서 사용자 친화적인 형광 이미지 처리를 위한 그래픽 인터페이스

Summary

EasyFiji는 피지(ImageJ)용 그래픽 사용자 인터페이스 플러그인으로, 생명과학자들이 자주 사용하는 형광 이미지 시각화 및 처리 도구들의 엄선된 모음을 제공합니다.

Abstract

피지(Fiji는 단순히 ImageJ)는 바이오이미지 분석 커뮤니티에서 널리 사용되는 광범위하고 확장 가능한 오픈소스 이미지 처리 패키지입니다. 하지만 비계산 생명과학자들의 경우, 피지의 다양한 기능을 수동으로 조작하려면 깊이 있는 메뉴 시스템을 배우고 탐색해야 합니다. 게다가 일부 명령어의 기본 동작은 형광 이미지 표시 및 처리에 이상적이지 않습니다. 형광 현미경 이미지를 다루는 생명과학자들의 효율성을 높이기 위해, 우리는 피지용 엄선된 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 플러그인인 EasyFiji를 개발했습니다. 각 EasyFiji 명령은 툴팁이 강화된 버튼과 슬라이더를 통해 실행되며, 형광 이미지에 필요한 채널별 실행을 항상 보여줍니다. 픽셀 강도를 변경하는 명령어도 원클릭으로 실행 불가능하여 보다 상호작용적인 처리가 가능하며, 자동으로 기록 후 텍스트로 저장되어 기록할 수 있습니다. 이미지 정보 패널에는 이미지 해석에 중요한 설정들이 표시됩니다. 새로운 이미지 렌더링 및 표백 보정 기능도 제공됩니다. 이 플러그인은 GitHub와 피지 업데이트 사이트에서 무료로 이용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 EasyFiji의 인터페이스를 사용하여 형광 현미경 이미지의 시각화 및 처리를 위한 절차를 설명합니다.

Introduction

피지(Fiji Is Just ImageJ)는 바이오이미지^{분석 커뮤니티에서} 널리 사용되는 광범위하고 확장 가능한 오픈소스 이미지 처리 패키지입니다. 피지의 방대한 범용 알고리즘 코드베이스와 매크로 언어 및 플러그인 인터페이스는 계산 분석가들이 거의 모든 이미지 처리 또는 분석 문제에 대해 편리하게 활용할 수 있습니다. 하지만 계산 경험이 적은 생명과학 사용자에게는 FIJI의 >1,100개의 명령어가 깊이 층층이 쌓인 드롭다운 메뉴 시스템에 분산되어 있어 탐색과 활용이 매우 복잡할 수 있습니다. 피지의 수동 사용을 단순화하기 위한 여러 접근법이 취해졌습니다. 피지의 검색창은 메뉴 탐색의 대안으로, 사용자가 필요한 알고리즘 이름을 알아야 할 경우에만 훌륭한 도움말 문서에 접근할 수 있습니다. 피지의 툴바 버튼은 사용자 정의 명령어에 빠르게 접근할 수 있도록 맞춤 설정할 수 있지만, 이 과정은 매크로 코드를 작성하고 어떤 명령어가 가장 유용할지 미리 예측해야 합니다. ActionBar 플러그인은 버튼 배열을 사용자 정비 및 조직 가능한 독립형 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 창으로 제공하지만,^{버튼을 효과적으로 채}우려면 코딩과 경험이 필요합니다. 이러한 솔루션들은 이미지 처리 경험이 적은 생명과학자들의 요구를 충족시키지 못합니다.

사용자 인터페이스 문제 외에도, 형광 현미경 이미지를 다루는 많은 생명과학자들은 채널별 표시 및 처리 절차를 필요로 합니다. 하지만 일반적으로 사용되는 일부 피지 명령어는 기본적으로 채널 인식이 아닙니다. 예를 들어, 사용자는 의사 색상 채널을 동일하게 눈에 띄게 렌더링하거나, 채널 간 비슷한 강도의 영역을 특별히 강조하거나, 형태학적 신호의 회색 대비를 유지하면서 형광을 표시하고자 할 수 있습니다. 이러한 사용 사례 각각에서 피지의 RGB 합성 렌더링 기법은 지각 수준에서 원하는 정보를 가립니다. 다중 채널 이미지를 처리할 때, 네이티브 피지 이미지 필터(예: Process | 필터)는 활성 2D 비트 평면만 처리하거나, 이미지 창 내 모든 비트 평면(즉, 클래스 ImageStack에서 정의한 '스택')을 처리합니다. 첫 번째 동작은 주어진 채널에 대해 z-또는 t-차원에서 처리되지 못하며, 두 번째 동작은 거의 항상 부적절한데, 각 채널이 고유한 염색 패턴과 신호 대 잡음비를 포함하고 있어 채널별 처리 매개변수를 사용해야 하기 때문입니다. 원주민 피지의 표백제 교정 명령어 (이미지 | 조정 | 표백 보정)은 다중 채널 형광 이미지에 적용할 때 잘못 작동하는데, 이는 채널 데이터가 교차하는 전체 이미지스택 전체를 보정하기 때문이며, 각 채널 내 z차원 또는 t차원 전체를 개별적으로 보정하지 않기 때문입니다.

형광 현미경 이미지를 다루는 생명과학자들을 위해 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 피지용 큐레이션되고 가이드가 제공되는 그래픽 사용자 인터페이스 플러그인인 EasyFiji를 개발했습니다. EasyFiji는 채널 인식 렌더링과 처리를 가능하게 하는 주제별로 구성된 명령어 모음입니다. 네 개의 표 패널인 디스플레이, 프로세스, 저장, 이미지 정보에는 명령 실행을 위한 툴팁 강화 버튼과 슬라이더가 주제별로 관련되어 있습니다. 기타 편의로는 인터랙티브 처리를 위한 실행 취소 기능, 픽셀 수정 동작과 이미지를 자동으로 저장할 수 있는 간단한 평문 액션 레코더, 이미지 해석에 중요한 획득 설정의 서식 표시가 있습니다. EasyFiji는 새로운 이미지 렌더링 및 표백 보정 도구도 제공합니다. EasyFiji는 정량적 이미지 분석이나 배치 처리 기능을 지원하지 않으며, 이러한 절차는 전문가 바이오이미지 분석가의 도움 하에만 수행되어야 합니다. EasyFiji는 설계상 간결하지만, 모든 피지 원어 명령어는 항상 피지 원주민 메뉴 시스템을 통해 사용할 수 있습니다. 우리는 EasyFiji의 청중 대상 디자인⁴ 가 생명과학자들 사이에서 피지 사용을 증가시킬 것이라고 믿습니다. 여기서는 EasyFiji의 형광 현미경 이미지에 대한 설계, 구현 및 적용을 소개합니다. 이 플러그인은 피지 업데이트 사이트(https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ 및 https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin)를 통해 쉽게 설치할 수 있으며, 오픈소스 코드는 GitHub에서 다운로드할 수 있습니다; 플러그인과 소스 코드는 무료로 제공됩니다(https://github.com/stjude/EasyFiji).

Protocol

이 프로토콜은 EasyFiji를 설치하고 사용하는 방법을 설명합니다.

1. EasyFiji를 설치하려면...

1. 운영체제에 적합한 최신 버전의 피지(>1.54g)를 다운로드하여 사용자가 읽기/쓰기 권한이 있는 폴더에 설치하세요(피지 다운로드 사이트 링크는 재료표 참조).
2. 피지를 실행하고 도움말 | 업데이트... 메뉴 바에 있어.
3. 업데이트기 창에서 '업데이트 사이트 관리'를 클릭하세요. 목록에서 EasyFiji를 선택한 후 '지원 및 종료'를 클릭하세요. EasyFiji는 자동으로 설치되며, 앞으로의 EasyFiji 버전과 함께 피지는 자동으로 업데이트됩니다.
4. 피지를 다시 시작하세요. 피지 플러그인 메뉴에서 EasyFiji를 선택하세요.
   참고: EasyFiji는 많은 구버전 Fiji와 완전히 호환되며, 주로 ImageJ와 호환됩니다. 자세한 호환성 및 의존성 정보는 EasyFiji GitHub 위키 페이지(https://github.com/stjude/EasyFiji)와 EasyFiji ImageJ.net 위키 페이지(https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start)에서 확인할 수 있습니다. 피드백은 GitHub 페이지나 Image.sc 포럼(https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617)의 EasyFiji 스레드를 통해 제공하실 수 있습니다(이 자료들에 대한 링크는 Table of Materials 를 참고하세요).

2. EasyFiji 디스플레이 패널 사용

참고: 그림 1A에 나타난 것처럼, 디스플레이 패널은 색상 스와치 버튼, 직관적인 대비 조정 조절 컨트롤, 그리고 지각적으로 보정된 다중 채널 이미지 렌더링을 위한 새로운 옵션을 이용한 형광 채널 의사 색채를 지원합니다. 3D/4D 이미지 투사 및 재절단을 위한 피지 원주민 명령도 포함되어 있습니다. 표 1은 EasyFiji 사령부와 토착 피지 사령부 간의 교류를 문서화합니다.

1. 채널의 색상 또는 가시성을 설정하세요(디스플레이 패널, 채널 색상 섹션).
   1. 이미지 창의 채널 슬라이더를 사용해 원하는 채널을 선택하세요.
   2. 색상 스와치 버튼을 눌러 새로운 색상 조회 테이블(LUT)을 할당하세요.
   3. 검은색 스와치 버튼을 눌러 채널 표시를 끄세요.
   4. AllChs 버튼을 눌러 모든 채널을 한꺼번에 표시하세요.
   5. EachCh 버튼을 눌러 이미지 창에서 채널 슬라이더를 스크롤하여 순차적으로 각 채널을 표시하세요.
2. 이미지 내나 이미지 사이에서 채널 대비를 설정하세요(디스플레이 패널, 채널 대비 섹션).
   1. 채널의 디스플레이 범위(대비)를 변경하려면 이미지 창 하단의 채널 슬라이더를 사용해 채널을 선택하세요.
   2. 디스플레이 게인 슬라이더 를 움직여 화면에서 가장 밝은 값으로 표시할 이미지 픽셀 강도(오른쪽에 표시된 값)를 지정합니다.
      참고: 이 동작을 '디스플레이 게인'이라고 부르는데, 이는 채널이 선형적으로 밝아지게 하기 때문이며, 이는 이미지 획득 중 검출기의 게인을 변경하는 효과와 유사합니다.
   3. 디스플레이 게인 리셋 버튼을 누르면 채널의 최대 가능한 픽셀 세기(비트 깊이에 따라 결정됨)를 화면에서 가장 밝은 값으로 표시합니다.
   4. 디스플레이 오프셋 슬라이더 를 이동시켜 화면 내 가장 어두운 값으로 표시할 이미지 픽셀 강도(오른쪽에 표시된 값)를 지정합니다.
      참고: 이 동작을 설명하기 위해 디스플레이 오프셋이라는 용어를 사용했는데, 이는 이미지 획득 시 검출기에 오프셋을 설정하는 효과와 유사하기 때문입니다.
   5. 디스플레이 오프셋 리셋 버튼을 눌러 이미지 픽셀 강도를 0에서 화면에서 가장 어두운 값으로 설정하세요.
   6. AutoCh 버튼을 누르면 디스플레이 게인과 오프셋을 자동으로 조정할 수 있습니다.
   7. AutoAll 버튼을 누르면 모든 채널의 디스플레이 게인과 오프셋을 자동으로 조정할 수 있습니다.
   8. Propagate 버튼을 눌러 활성 이미지에서 동일한 채널 수를 가진 다른 모든 열린 이미지로 디스플레이 게인과 오프셋 설정을 전송하세요.
3. 멀티채널 디스플레이(디스플레이 패널, 채널 뷰 섹션)를 만드세요.
   1. 두 개의 형광 채널을 컬러 이미지로 렌더링하려면 FF 접두 사 버튼(형광과 형광 조합)을 사용하세요. 형광 채널과 형태학적 그레이스케일 채널을 컬러 이미지로 함께 렌더링하려면 FG 접두 사 버튼(그레이스케일의 형광)을 사용합니다. 렌더링은 새로운 이미지 창에서 생성됩니다.
      참고: 채널 뷰를 만들기 전에 먼저 각 채널의 디스플레이 게인과 오프셋을 조정하여 관심 신호가 디스플레이의 다이내믹 레인지를 가로지르도록 하고(섹션 2.2), 그 후 처리 탭의 게인 및 오프셋 적용 버튼을 사용해 이 게인과 오프셋 을 적용하세요(섹션 3.2.3). 게인과 오프셋을 조정하고 적용하지 않으면 렌더링이 최적이 아닙니다.
   2. FFColoc 버튼을 누르면 두 개의 형광 채널에서 노란색 픽셀로 강조되는 컬러 렌더링을 생성하며, 두 채널 모두 강도가 비슷한 25% 이내입니다.
      참고: 채널 간 강도가 다른 픽셀은 회색 스케일로 렌더링됩니다. 노란 색 픽셀은 각 채널에서 관심 신호가 디스플레이의 동적 범위를 확장할 때 상관 기반 공동위치화⁵ 를 시사합니다.
      주의: FFColoc 렌더링은 데이터 탐색 또는 설명 목적으로만 작성되었습니다. 전문가의 도움을 받아 엄밀한 정량화를 대체할 수 있는 것은 아닙니다.
   3. FFMerge 버튼을 누르면 두 개의 형광 채널에서 색상 렌더링을 생성하며, 각 채널의 신호가 동일하게 인지됩니다.
      참고: 각 픽셀에서 밝기는 더 높은 강도의 신호에 따라 설정되며, 색조는 채널 간 강도의 비율에 따라 결정됩니다(Taylor 등⁶이 설명한 개념에 따릅니다). 토론 섹션도 참고하세요.
   4. FGMerge 버튼을 누르면 형광 채널과 회색 채널의 색채를 모두 그대로 유지하고 그레이스케일 채널의 대비를 유지하여 색 표현을 생성합니다.
      참고: 그레이스케일 채널은 일반적으로 DIC, 위상 차이, 전자현미경과 같은 형태학적 정보를 포함하는 비형광 모달리스입니다.
   5. 몽타주 버튼을 눌러 채널을 개별 이미지로 분리하고, 자동으로 화면 전체에 타일링하며, 시각화를 동기화할 수 있습니다.
   6. SyncWins 버튼을 눌러 같은 유형의 여러 이미지를 시각화할 수 있습니다.
4. 3D z-또는 t-스택의 2D 뷰를 생성하세요(디스플레이 패널, 스택 뷰 섹션).
   참고: 각 렌더링은 새로운 이미지 창에 표시됩니다.
   1. MIP 버튼을 누르면 최대 강도 투영을 생성하세요.
      참고: 결과 2D 이미지의 각 위치에서의 강도는 3D 이미지 내 3^차원 에서 가장 강한 픽셀의 강도에 해당합니다. 이 절차는 노이즈를 강조할 수 있으므로, MIP를 만들기 전에 스택을 부드럽게 하는 것이 유용할 수 있습니다( 처리 탭 참조).
   2. SIP 버튼을 눌러 합 강도 예측을 생성하세요.
      참고: 결과 2D 이미지의 각 위치에서의 강도는 3D 이미지 내 3^차원 강도의 합에 해당합니다. 이 절차는 전체 강도를 보존하여 단일 슬라이스보다 잡음이 적은 이미지를 만듭니다.
   3. Ortho 버튼을 누르면 현재 커서 위치에서 만나는 3D 스택의 세 개의 직교 평면(예: xy, xz, yz)을 인터랙티브하게 렌더링합니다.
   4. Kymo 버튼을 눌러 kymograph를 생성하세요.
      참고: 키모그래프는 수직(y-) 축이 스택의 3차원(보통 t-)에 해당하고, 수평(x-) 축이 입력 스택에서 사용자가 그린 선상의 위치에 해당하는 2D 이미지입니다. 3^차원 이 시간일 때, 키모그래프를 사용해 운동을 설명하거나 정량화합니다.
      이 버튼은 Fiji에 기본으로 포함된 KymographBuilder^{플러그인 7} 에 의존하지만, ImageJ를 사용할 경우 별도로 다운로드해야 합니다.
5. 기타 옵션 설정(디스플레이 패널).
   1. 피지 내에서 활성 이미지 창을 복제하려면 Dup 버튼을 누르세요. 새로운 이미지 창이 나타납니다.
      참고: 피지의 Rectangle ROI 도구를 사용해 이미지에 관심 영역(ROI)을 그리면, Dup 버튼 이 ROI 경계로 크롭됩니다. 중복된 이미지의 차원성을 재구성하기 위해 채널, z-, t- 범위를 지정하세요.
   2. ToClip 버튼을 눌러 현재 화면에 표시되는 활성 이미지를 시스템 클립보드에 복사하세요. 이미지를 다른 애플리케이션에 붙여넣으려면(슬라이드를 준비하거나 사진을 편집할 때), 다른 애플리케이션을 활성화한 후 붙여넣기(Windows에서는 Ctrl+V, Mac에서는 Cmd+V)를 선택하세요.
   3. |--음---| 버튼을 눌러 이미지에 스케일 바를 오버레이로 표시합니다. |--음--| 버튼을 켜서 스케일 바를 제거하세요.

3. EasyFiji 프로세스 패널 사용

참고: 그림 1B에서 볼 수 있듯이, 프로세스 패널 채널 기능 섹션은 슬라이더 기반 이미지 처리 명령과 툴팁을 제공하여 이미지 표시를 향상시킬 수 있습니다. 마지막 실행 취소 버튼을 사용하면 상호작용 처리가 가능합니다. 이미지 치수 는 '치수 수정 ' 버튼을 통해 변경할 수 있습니다. 액션 테이블 은 이미지 픽셀 강도 값을 변경하는 평문 처리 명령을 로그로 기록하는 데 사용됩니다. 로그는 같은 제목의 이미지와 함께 자동으로 저장될 수 있습니다( 저장 패널 참조).

1. 이미지의 공간적 특징을 변경하세요(프로세스 패널, 채널 기능 수정 섹션).
   참고: 모든 명령은 활성 채널에만 적용되며, 결과는 원본 이미지 창에 자동으로 표시됩니다. 새로운 이미지 창이 생성되지 않습니다.
   1. Smooth 슬라이더를 움직여 가우시안 블러를 적용하면 픽셀 간 정규 분포의 변동(~샷 노이즈와 리드 노이즈)이 줄어듭니다.
      1. ~나이퀴스트 샘플링 이미지(70-150 nm xy 픽셀 크기)의 경우, 슬라이더 값은 1.0에서 2.0 사이로 시작하세요.
      2. 주어진 픽셀 크기에 대해 이미지의 신호 대 잡음비(SNR)가 감소함에 따라 슬라이더 값을 증가시킵니다.
      3. SNR이 주어졌을 때, 픽셀 크기가 줄어들수록 슬라이더 값을 증가시킵니다.
      4. 이미지 스택의 경우, 나이퀴스트 샘플링 데이터에 적합하게, z-반지름이 자동으로 xy 반경의 3분의 1로 설정되는 3D 스무딩을 적용합니다.
         참고: 슬라이더 값은 픽셀 단위로 측정된 가우시안 핵의 표준편차에 해당합니다.
   2. 디노이즈 슬라이더를 움직여 중간 필터를 적용하면 극단적인 이상치(카메라 뜨거운 픽셀이나 PMT 열 방출)를 제거할 수 있습니다.
      참고: 슬라이더 값은 박스 커널의 반경(픽셀 단위)에 해당합니다. 0.5에서 1.0 사이의 값이 좋은 출발점입니다.
   3. 샤프닝 슬라이더를 움직여 2D 선명하지 않은 마스크를 적용하면, 초점이 맞지 않는 빛으로 인한 흐림이나 흐림을 줄일 수 있습니다. 선명한 것은 노이즈를 강조하기도 합니다.
      참고: 슬라이더 값은 흐림 스케일을 정의하는 데 사용되는 가우시안 핵의 표준편차(픽셀 단위)에 해당합니다. ~나이퀴스트 샘플링 이미지(70-150 nm xy 픽셀 크기)의 경우, 슬라이더 값이 2.0에서 4.0 사이의 것이 좋은 출발점입니다. 가중치 매개변수는 0.6으로 고정되어 있습니다.
2. 이미지 픽셀 강도 변경(과정 패널, 채널 강도 수정 섹션).
   참고: 모든 명령은 활성 채널에만 적용되며, 결과는 이미지 창에 자동으로 표시됩니다. 새로운 이미지 창이 생성되지 않습니다.
   1. Sub.Bkgd. 슬라이더를 이동시켜 '롤링 볼' 알고리즘을 적용하면 배경(즉, 공간적으로 점진적인 강도 변화)을 제거합니다.
      참고: 슬라이더 값은 구르는 공의 반경(픽셀 단위)이므로, 큰 값은 전체 배경을 덜 뺏게 됩니다. 가치는 이미지 내용에 따라 다르지만, 일반적으로 보존할 특징의 크기(픽셀 단위)보다 ≥배 더 커야 합니다. 10에서 20 사이의 값이 좋은 출발점인 경우가 많습니다.
   2. 감마 슬라이더를 움직여 약한 신호와 밝은 신호가 섞인 시각화를 향상시키세요. 예를 들어, 큰 구조와 혼합될 때 미세한 구조를 강조하는 데 필요할 수 있습니다.
      참고: 정규화 후 각 픽셀의 값은 슬라이더 값에 의해 주어지는 거듭제곱(지수)으로 올라갑니다. 값은 이미지 내용에 따라 다르지만, 0.6에서 0.8 사이의 수치가 좋은 출발점인 경우가 많습니다.
      주의: 감마가 적용된 이미지는 강도 정량화에 사용할 수 없습니다.
   3. Apply Gain and Offset: ToCh 버튼 또는 ToAll 버튼을 눌러 디스플레이 패널의 디스플레이 게인 및 오프셋 슬라이더로 지정된 이미지 표시 범위를 이미지 비트 깊이가 제공하는 전체 강도 범위에 매핑합니다.
      참고: 이 과정은 조회 테이블 적용(LUT)이라고도 합니다. 디스플레이 패널에서 채널 뷰를 생성하기 전에 디스플레이 게인과 오프셋을 이렇게 적용해야 합니다.
   4. 광표백, 수차, 빛 산란 등으로 인해 발생할 수 있는 3D 이미지의 z-또는 t-차원 전반에 걸친 인공 강도 변화를 보정하기 위해 강도 보정 버튼을 사용하세요.
      참고: 이 동작은 활성 채널에만 적용됩니다. 동일한 데이터셋에 국소 및 전역 보정을 순차적으로 적용할 수 있습니다. 기본 방법에 대한 자세한 설명은 결과 섹션을 참조하세요.
   5. 전체 z(z) 또는 t(t) 차원에서 발생하는 점진적인 신호 세기 손실을 보정하면서도 대부분의 생물학적 강도 변화는 유지할 수 있습니다. 두 가지 선택지가 있습니다:
      1. GlobalL 버튼을 눌러 초기 슬라이스가 어둡거나 검은색일 수 있는 z-스택을 보정하면, 첫 프레임부터 마지막 프레임까지의 총 강도 손실이 경미합니다(<50%). 알고리즘은 강도 손실을 선형 추세로 모델링한 후, 각 단면에 보정 계수를 적용하여 적합선의 기울기가 0이 되도록 합니다.
      2. GlobalP 버튼을 눌러 첫 프레임이 가장 밝고 첫 프레임에서 마지막 프레임까지 전체 강도 손실이 상당한(50%-95%) 시계열을 수정하세요. 이 알고리즘은 강도 손실을 2^차 다항식 추세로 모델링한 후, 각 단면에 보정 계수를 적용하여 적합 곡선을 기울기가 0인 직선으로 변환합니다.
   6. 로컬 버튼을 눌러 국소적이고 급격한 신호 세기 변화를 수정하되, 점진적인 변화는 유지하세요.
      참고: 이러한 변화는 더 큰 z-스택 내 몇몇 평면의 표백이나 여기 전력 변동(깜빡임)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 알고리즘은 생물학적으로 중요한 강도 변화를 4차 다항식으로 모델링한 후, 각 프레임의 중앙값 강도가 적합된 곡선의 값과 같도록 보정 계수를 적용합니다.
   7. Equalize 버튼을 눌러 각 프레임의 중간 신호 세기를 동일하게 만들면, 피지의 '단순 비율' 표백제 보정 방법과 유사합니다.
      주의: 평등은 다른 모든 방법이 실패할 때 시각화 목적으로 유용할 수 있지만, 생물학적으로 중요한 중간 강도 변동을 지우기 때문에 강도 정량화와 함께 사용할 수 없습니다.
3. 이미지의 차원을 변경하세요 (프로세스 패널, 치수 수정 섹션).
   참고: 이 명령들은 이미지 창의 모든 채널에 적용되며, 실행 취소 버튼으로는 되돌릴 수 없습니다.
   1. Rotate 버튼을 눌러 이미지를 회전시키세요. 예를 들어, 배아나 조직의 해부학적 축을 페이지나 화면에 맞추기 위해 필요한 부분이 있습니다.
   2. 크 롭 버튼을 눌러 이미지의 xy 크기를 줄이세요. 자동으로 선택되는 직사각형 ROI 도구를 찾아보고, 자르기 작업에 사용할 ROI를 이미지에 그리라는 프롬프트를 관찰하세요.
   3. Subset 버튼을 눌러 입력 이미지의 비-xy 차원 중 일부에서 새로운 이미지 스택을 생성합니다.
      참고: 이는 채널을 제거하거나 z나 t에서 슬라이스를 잘라내는 데 사용됩니다.
4. 이미지에 적용된 처리 명령을 기록하세요 (프로세스 패널, 작업 기록 섹션).
   참고: 액션 레코더의 목적은 액션을 평문 로그로 자동으로 기록하고, 적용된 액션과 함께 이미지를 저장하는 데 있습니다. 이 액션은 픽셀 강도 값을 변경합니다. 이 로그는 사용자가 필기하거나 피지 매크로 기록 항목을 해독하지 않아도 되도록 편리함을 제공합니다. 픽셀 강도를 변경하지 않는 명령어는 로그에 남지 않습니다.
   1. 명령 녹음을 시작하려면 Rec 버튼을 누르세요.
      참고: 녹음 중일 때 버튼 면이 'ON'으로 표시됩니다. 실행된 명령과 관련 매개변수는 액션 테이블에 나타납니다. '되돌리는' 명령은 테이블에서 제거됩니다.
   2. 행동 테이블을 비우려면 Clr 버튼을 누르세요.
   3. Save 버튼을 눌러 액션 테이블을 텍스트 파일로 저장하세요. 여러 이미지에 적용된 행동이 기록된 경우, 텍스트 파일이 저장될 때 해당 행동들은 이미지 제목에 따라 그룹화됩니다.
      참고: 또는 아래 4절의 저장 패널을 통해 이미지를 저장하세요. ' Save Actions ' 박스를 체크하면 이미지에 적용된 모든 액션이 이미지의 이름과 파일 경로를 사용해 텍스트 파일로 자동으로 저장됩니다.

4. EasyFiji 저장 패널 사용

참고: 그림 1C에 나타난 것처럼, 저장 패널은 비전문가가 원하는 사용 사례에 맞는 올바른 이미지 파일 형식을 선택할 수 있도록 설계되었습니다. Save Actions 체크박스 가 체크되면, Action Table에 나열된 이미지에 적용된 모든 처리 작업이 동일한 파일명과 경로를 사용해 이미지와 함께 자동으로 저장되지만, *.txt 확장자가 적용됩니다. 여러 이미지가 열려 있고 병렬로 처리된 경우, 모든 이미지에 대한 모든 작업이 액션 테이블에 표시됩니다. 하지만 저장되는 이미지에 적용된 동작만 해당 이미지와 함께 저장됩니다. 저장된 텍스트 파일은 파일 시스템에는 나타나지만 피지에서는 열리지 않습니다. 원한다면, 피지에서 파일 아이콘을 피지 툴바에 드래그하여 텍스트 파일을 열 수 있습니다.

1. 이미지 저장 (저장 패널, 저장 방법 섹션).
   1. 원본 데이터 버튼을 눌러 이미지를 *.tif 파일로 저장하면, 정확한 픽셀 값, 채널 구조, 일부 메타데이터가 보존됩니다. 이미지를 더 수치화하거나 분석하는 것이 목표일 때 이 옵션을 사용하세요.
   2. Save for Presentation 버튼을 눌러 jpeg 압축을 통해 현재 표시된 이미지를 이메일이나 슬라이드 프레젠테이션에 사용할 수 있도록 저장하세요.
      주의: 이 옵션은 수치 생성이나 정량적 분석에 절대 사용해서는 안 됩니다.
   3. 품질 레벨 슬라이더를 움직여 jpeg 압축 수준을 설정하세요.
      참고: 값이 클수록 픽셀 강도와 특징(그리고 파일 크기)의 보존이 더 좋아지지만, 모든 특징이 보존되는 것은 아닙니다.
   4. Save for Figure 버튼을 눌러 현재 표시되는 PNG 형식으로 저장하면, 다른 그래픽 프로그램(예: Photoshop, Illustrator, Publisher, GIMP)과 호환됩니다. 이미지는 화면에 표시되는 대로 저장되지만, 채널과 메타데이터는 보존되지 않습니다.
      주의: 이 옵션은 절대 수치화에 사용해서는 안 됩니다.
   5. '동영상으로 저장' 버튼을 누르면 이미지 스택을 슬라이스를 순차적으로(z, t) 재생하는 동영상 무비로 저장합니다.
      참고: Windows 기반 운영체제에서 mov 파일을 재생하려면 오픈 소스 VLC 미디어 플레이어가 필요합니다.

5. EasyFiji 이미지 정보 패널 사용

참고: 그림 1D에 나타난 것처럼, 이미지 정보 패널에는 이미지 해석에 중요한 벤더별 획득 설정이 표시되는 평문입니다. 현재 지원되는 공초점 이미지 형식의 목록은 표 2 를 참조하세요.

1. 채널 정보 버튼을 눌러 획득 설정을 불러오세요.
2. 채널별 획득 설정(레이저 출력, 레이저 파장, 방출 대역, 이득, 핀홀 크기 등)은 채널별 설정 채널 정보 섹션을 참조하세요.
3. 이미지 전체 설정(이스템 이름, 대물, 스캔 모드, 드웰 시간, 복셀 크기 등)은 시스템 구성 섹션을 참조하세요.

Results

다중 채널 형광 이미지의 의사 컬러 렌더링은 신호 간의 공간적 또는 강도 관계를 설명하는 데 사용할 수 있습니다; 하지만 피지 네이티브 버전은 지각 수준에서 색상과 밝기를 혼란스럽게 하는 RGB 합성 렌더링 기법만 제공합니다. 이 문제를 설명하기 위해 그림 2 는 N-Myc와 RNA 중합효소 II(RNAPolII)의 2채널 이미지를 사용합니다. 그림 2A에서는 각 채널이 별개의 그레이스케일로 표시되어 (혼란을 유발할 수 있는) 색 정보가 존재하지 않습니다. 그림 2B에서는 채널들이 피지 RGB 합성 렌더링으로 함께 표시되며, 모든 가능한 기본 및 보조 색상 조합을 사용합니다. 보시다시피, 서로 다른 색상의 렌더링은 지각 수준에서 매우 다른 정보를 전달합니다(아래에 정량화됨). 따라서 피지 RGB 합성 렌더링에서...

Discussion

피지는 이미지 분석가들 사이에서 널리 인기가 있는 오픈 소스 이미지 처리 및 분석 소프트웨어입니다. 하지만 복잡한 메뉴 인터페이스와 형광 이미지 표시 및 처리에 있어 때때로 직관적이지 않은 동작은 비계산 생명과학자들에게 도전 과제를 제공합니다. EasyFiji는 형광 이미지 작업 시 요구되는 채널별 행동을 지속적으로 보여주는 주제별로 정리되고 툴팁이 강화된 엄선된 버튼과 슬라이더 세트를 제공합니다. 모든 처리 명령은 실행 불가능하여 상호작용을 가능하게 하며, 자동으로 기록 후 이미지와 함께 일반 텍스트로 저장할 수 있습니다. 니콘과 자이스 포인트 스캐닝 공초점 카메라에 대한 이미지 해석에 중요한 획득 설정이 제시되어 있습니다. 피지 플러그인인 EasyFiji의 간결함은 결코 제한이 되지 않으며, 모든 피지 명령어는 항상 네이티브 피지 메뉴 시스템을 통해 접근할 수 있습니다. 간소화된 사용자 인터페이스 외에도, EasyFiji는 의도적으로 설계된 여러 멀티채널 렌더링 기...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub 사이트	오픈 소스		https://github.com/stjude/EasyFiji
이지피지 Image.sc 포럼	오픈 소스		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
이지피지 ImageJ.net 사이트	오픈 소스		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
피지 소프트웨어	오픈 소스		https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC 미디어 플레이어	오픈 소스		https://www.videolan.org/vlc/