서로 다른 포유류 뇌에서의 정량적 세포 계수 연구를 위한 비교적 접근법

요약

현대 신경과학은 실험실 설치류와 인간을 포함한 여러 종 간의 차이를 탐구해야 합니다. 하지만 큰 뇌를 가진 포유류가 관련될 때는 기술적 어려움이 발생합니다. 이 접근법은 매우 다양한 포유류 내 신경 집단의 종간 변이를 다루며, 진화적 패턴을 밝히기 위해 지도화할 수 있는 유사한 결과를 도출합니다.

초록

대부분의 신경생물학적 연구는 실험실 설치류를 대상으로 수행됩니다. 포유류 뇌 간에 많은 유사점이 있음에도 불구하고, 중요한 차이점들도 존재하여 번역 시 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 특히 신경 발생 등 뇌 가소성에서 뚜렷한 종간 차이가 발견되었습니다. 진화적 상충으로 인해 다양한 신경 발생 과정이 널리 퍼질 수 있으며, 이는 뇌 구조와 포유류 간 변이를 나타내고, 쥐와 인간과 같은 서로 다른 종에서 가소성 가능성을 변화시킵니다. 서로 매우 다른 종을 비교하는 것은 여러 문제를 제기합니다: 큰 뇌가 관련될 때 비교 연구는 기술적 어려움에 직면하고; 서로 다른 실험실에서 이질적인 실험 접근법을 사용하는 것은 결과 비교를 제한할 수 있습니다; 이질성은 포유류 간 신경발달 과정의 서로 다른 시간 경과와 관련이 있을 수 있으며, 이에 따라 비교에 변수가 추가됩니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 뇌 크기, 회회, 사회생태적 지위, 연령 등 다양한 포유류 내 2층 피질 미성숙 뉴런 집단의 종간 변이를 연구하는 접근법이 확립되었습니다. 완전히 표준화할 수 없는 변수들에도 불구하고, 뇌 수집의 이질성 감소와 공통 해부학적 구조를 해당 뇌 수준에서 세포 세기를 수행하는 기준점으로 설정하는 방법을 제안합니다. 얻어진 데이터(예: 세포 밀도)는 계통 계통수에 매핑되어 진화 패턴을 드러내고, 신경해부학적 특징(예: 뇌 크기, 피질 표면적)과의 공분산을 분석할 수 있습니다. 이 접근법은 계통발생 그룹 간 피질 미성숙 뉴런 수의 눈에 띄는 변이와 뇌 크기에 따른 공변이를 밝혀냈습니다. 이 방법은 같은 종 내에서 다양한 발달 단계별 차이를 정량화하는 데도 사용될 수 있으며, 다른 다양한 포유류와 생물학적 과정에도 확장되어 성체 뇌의 다양한 세포 집단을 보다 정확하게 정량화하여 가소성을 뒷받침할 수 있는 유사한 결과를 도출할 수 있습니다.

서론

신경과학 연구는 주로 근친교배된 쥐와 쥐를 이용해 결과를 인간에게 전달합니다. 분자, 세포, 심지어 해부학적으로도 많은 유사점이 있지만, 중요한 종 간 차이점도 존재하여 전임상 데이터 해석에 오해를 불러일으킬 수 있습니다 ^1,2. 비교 연구가 필요하지만, 큰 뇌가 관련될 때는 기술적, 실용적인 어려움으로 인해 연구가 제약을 받습니다(예: 쥐에서 평균 0.5g에서 인간의 1300g까지; 그림 1A). 더불어, 서로 다른 실험실의 이질적인 실험 접근법은 결과 비교, 특히 정량적 분석에서 제한적일 수 있으며, 때로는 논란을 불러일으킬 수 있습니다. 이는 뇌 구조적 가소성의 경우이며, 특히 신경 발생 과정 ^3,4,5를 참조하며, 발달 신경가소성과 뇌 수리를 이해하는 데 관심 있는 주제입니다 ^6,7.

뇌 가소성 분야의 최근 발견들은 진화 과정에서 다양한 유형의 신경 발생 과정의 발생, 속도, 해부학적 위치에 상당한 차이가 나타났음을 강하게 시사합니다⁸. 예를 들어, 실험실 설치류에 비해 성체 대뇌 포유류에서 줄기세포 유발 신경 발생이 명백히 감소하는 현상 이 있습니다 ^5,9,10은 생태학적 압력에 따른 뇌 영역과 기능의 확장과 관련된 것으로 보^{이며, 이는} 생태학적^{압력에 따른} 적응과 다른 신경발달 시간 경로^11,12. 신경 생성 속도는 쥐와 인간 사이에 현저히 차이가 있어 번역¹³의 문제가 제기된다.

반면, 성숙이 멈춘 뉴런(소위 미성숙 또는 휴면 뉴런 14,15,16,17,18,19)으로 나타나는 새로운 형태의 "분열 없는 신경 발생"은 작은 뇌에서 큰 뇌 종으로 증가할 것으로 가설화되었다 ^20,21. 흥미롭게도, 줄기세포 독립적 미성숙 뉴런 집단은 대뇌 피질(회뇌 종에서 고차 인지 부위)에 위치하며, 주로 후각과 공간 탐색과 연관된 전형적 신경 발생 부위와는 멀리 떨어져 있다. 이들은 유뇌 종에서 여전히 중요한 역할을 한다 ^7,8. 뇌 구조와 포유류 종 간의 이러한 차이는 단순한 비교적 관심을 넘어, 쥐와 인간의 가소성 가능성을 변화시켜 번역에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 이유로, 실험실 설치류와 영장류를 중심으로 매우 다양한 포유류 간 계통발생학적 변이가 얼마나 차이를 나타내는지 '비교 가능한 방식'으로 평가하는 것이 매우 중요합니다.

최근 확립된 접근법이 마련되어 뇌 크기, 회회, 사회생태학적 지적 지적^{22, 24, 25}등 포유류에서 2층 피질 미성숙 뉴런(cIN) 집단의 종간 변이를 연구하는 데 기술되었습니다. 이 방법은 세 가지 원칙에 기반합니다: i) 여러 (다양한) 포유류 종을 동일한 절차를 병행하여 처리하는 것을 고려하는 것; ii) 서로 매우 다른 뇌에서 완전히 표준화할 수 없는 변수(고정 절차, 사후 간격, 연령)를 최소화하고, 연구 대상 세포 집단의 널리 공유된 특징을 내부 양성 대조군으로 사용하여 면역세포화학용 항체의 종 특이성을 해결하기 위함; iii) 서로 다른 종의 대응하는 뇌 레벨에 대한 세포 세기를 수행하는 기준점으로 대응하는 해부학적 구조를 확립하는 것(그림 1B, 그림 2). 잘 확립된 이중 코르틴(DCX^{15, 17, 26})과 식별된 세포를 세어 얻은 데이터(예: 세포 밀도)는 계통 계통수에 매핑하여 진화 패턴을 밝히고, 뇌 크기, 회회, 피질 표면적 등 다양한 매개변수와의 공분산성을 분석할 수 있습니다.

그림 1: 피질 맨틀 내 cIN의 분포와 양을 평가하기 위한 매우 다른 포유류 뇌 처리 과정. (A) 서로 다른 종과 목에 속하는 포유류는 뇌 크기와 회동 및 피질 확장 정도가 크게 다르게 특징지어집니다. 브레인 아이콘은 BioRender 라이선스로 재현되었습니다. (B) 크기와 피질 맨틀 연장이 매우 다른 뇌에서 절단된 대표적인 톨루이딘 블루 염색 관상 절편. 조직학적으로 염색된 연속 단면(냉동관 절단, 관상, 두께 40 μm)이 각 동물 종의 주요 신경해부학적 구조를 식별하는 데 사용됩니다( 그림 3 참조); 뇌 크기와 피질 경계의 놀라운 차이를 주목하세요. 패널 A의 동물 아이콘은 La Rosa 등의 허가를 받아 재현^{되었습니다.} 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

마지막으로, 모든 플라스틱 과정은 일반적으로^나이가 들수록 점진적으로 감소하므로^, 비교 신경가소성에서 또 다른 문제는 이러한 감소의 서로 다른 시간 경과를 평가하는 것입니다. 이는 포유류 간 신경발달 과정의 다른 시간 경과와 관련이 있을 수 있습니다 12,29,30. 사실, 빠르게 성숙하는 종(쥐)과 느리게 성숙하는 종(영장류)의 존재는 가장 일반적인 모델 시스템인 실험실 쥐가 생의학 분야의 문제 해결에 한계가 있는 또 다른 이유입니다. 여기서 설명한 방법은 각 종의 수명 동안 다양한 연령대의 세포 집단을 고려하고, 그 결과 종 간 추세를 비교하는 데에도 유용할 수 있습니다. cIN 밀도의 계통학적 변이와 그 연령대에 따른 지속 차이가 소뇌 포유류와 대뇌 포유류 간에 발견되었다^22,28.

프로토콜

모든 동물 시술은 관련 국가 및 기관 규정을 준수했습니다. 생쥐 조직은 이탈리아 오르바사노에 위치한 신경과학 연구소 Cavalieri Ottolenghi(NICO)에서 이탈리아 보건부(RRID: MGI:3696370)의 승인을 받아 Serena Bovetti와 Charles River Laboratories의 지원을 받았습니다. 1986년 동물(과학적 절차)법 부록 1에 따라 영국 런던 퀸 메리 대학교에서 박수 직후 나체 두더지쥐 조직이 수집되었습니다. 토끼 실험은 유럽공동체 이사회 지침 86/609/EU와 이탈리아 법률(DL.vo 116/92)을 따랐으며, 이탈리아 보건부의 승인(승인 66/99-A)을 받았습니다. 양과 말의 뇌는 86/609/EEC 지침에 따라 상업용 도축장에서 사후 채취되었으며, 지속적인 수의 감독 하에 이루어졌습니다. 개 뇌는 사후 리옹의 마샬바이오 연구소에서 필요한 승인과 함께 공급되었으며; 고양이 뇌는 파도바 대학교에서 주인 동의 하에 정기 진단 부검 중 사후 채취되었습니다. 모든 절차는 EU와 이탈리아 법률을 따랐습니다. 침팬지 샘플은 국제의학과학기구협의회(CIOMS)의 국제 지침 원칙과 국립보건원-실험동물복지국(NIH-OLAW) 허가 A5761-01에 따라 취급되었습니다(각 동물 종과 실험에 대한 자세한 내용은 보충표 1 및 참고문헌 ^22,25 참조).

1. 뇌 수집

1. 뇌를 직접 수집하거나 다른 기관과 조직 은행에서 수집하되, 반구 전체만 고려하세요. 기관과 함께 동물 종의 뇌를 추출하는 최선의 절차를 마련하였으며, 반구 손상을 줄이고 최소 사후 주기(PMI, 아래 주석 참조)와 추출 후 고정액에 신속히 담그되도록 합니다.
   참고: 관심 대상 항체의 민감도에 따라 PMI를 주의해야 합니다. 더블코르틴(DCX)의 분해에 대한 높은 민감성을 고려하여, PMI 범위가 0-1시간인 샘플을 채취하는데(침팬지는 최대 14시간의 PMI를 가지지만, 이는 염색 품질에 영향을 주지 않았습니다, 보충표 1).
2. 동물의 수명이 매우 다양하기 때문에, 연구에 고려된 다양한 포유류 중에서 수집할 연령대를 미리 정하여 비교 가능한 데이터를 얻어야 합니다.
   1. 이 연구 설계와 비교 연령 그룹을 설정하기 위해, 동물 역사와 다양성에 관한 두 데이터베이스의 정보를 분석합니다: AnAge는 동물의 노화와 생애사를 엄선한 데이터베이스이고, 다른 하나는 동물 자연사, 분포, 분류, 보전 생물학을 다루는 온라인 데이터베이스인 Animal Diversity Web입니다.
   2. 동물의 수명을 네 단계(하나는 사춘기 전, 세 단계는 사춘기 후 단계, 즉 '성체')로 나누는 것은, 미국 수의의학회(AVMA)가 개들의 생애 단계를 분류한³¹에서 시작하여 생애를 강아지, 주니어, 성견, 성숙, 노인, 노인의 여섯 단계로 나누는 것에서 시작한다.
   3. 노년기와 노인기, 성인기와 성숙기로 압축하여 이 용어를 적용하라: 사춘기 전, 청년, 중년, 그리고 노년/²²세.

2. 뇌 조직 고정 및 처리

참고: 고정 절차는 뇌 크기와 일부 동물 종에 대한 윤리적 문제(대부분의 큰 뇌를 가진 영장류나 말은 관류가 불가능하며, 추출 후 고정액에 담가 고정해야 함)에 따라 다를 수 있습니다.

1. 뇌를 고정액(4% 파라포름알데히드 또는 10% 포르말린 권장)에 완전히 담가세요.
   참고: 고정 시간은 뇌 크기에 따라 다릅니다(예: 개 뇌는 3주, 말 뇌는 3개월, 보조표 1). 관심 항원의 완전성을 유지하기 위해 고정액에 과도하거나 짧은 시간을 두지 마세요.
2. 원하는 뇌 반구를 자(직선 절단)와 찌르는 칼로 1-1.5cm 두께의 균등한 조각으로 자릅니다.
3. 뇌 조각을 인산염 완충제(PB) 0.1 M(증류수에 녹인 인산나트륨 28.49 g와 인산나트륨 단염기 7.8 g 단염기성 7.8 g 녹임수)에 담근 후 셰이커에서 24시간 동안 부드럽게 저어줍니다. 필요하면(아래 주석 참조), 용액을 버리고 다음 날에는 PB 0.1 M, pH 7.4의 신선한 용액으로 교체합니다.
   참고: PB 0.1 M의 세척량과 세척 횟수는 뇌 크기에 따라 다릅니다(예: 쥐 뇌는 30분, 말 뇌는 3일). 뇌가 완전히 PB 0.1M에 잠기고, 포르말린, 혈액, 조직 노폐물이 더 이상 존재하지 않도록 세척을 멈추게 하세요.
4. 슬라이스를 점진적으로 증가하는 자당 용액(10%, 20%, 최대 30%)에 담가 PB 0.1 M, pH 7.4에 담근 후 셰이커에서 부드럽게 저어 냉동 보호합니다.
   참고: 자당 용액의 양은 뇌 크기에 따라 다릅니다. 뇌가 완전히 자당 용액에 잠기고 완전히 가라앉은 후에 자당 농도를 높이는 것이 중요합니다.

3. 전 반구 극저온 절단

1. 절단 시 문제를 피하기 위해 곡선 핀셋을 사용해 뇌 절삭에서 뇌 절삭을 제거하세요.
2. 슬라이스를 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 채운 임베딩 몰드에 넣습니다. 조각이 임베딩 몰드를 채우지 못하면, 뇌 조각보다 약간 큰 파라필름 조각을 자르고 중앙에 OCT 매체를 넣은 후 그 조각을 OCT 위에 올려놓습니다.
3. 액체 질소가 냉각된 이소펜탄 300mL에 담가 OCT 매체가 완전히 흰색이 될 때까지 냉동합니다. 뇌 절편은 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있으며, 절편 절단 전까지 보관할 수 있습니다.
4. 절개 전에 뇌 절제를 최소 5시간 동안 -20°C에서 유지하여 조직이 천천히 균일하게 냉동체와 같은 온도에 도달하도록 합니다.
5. 절면을 40μm 두께의 직렬 코로나 단면으로 절단하며, 실내 실내 온도 범위를 -20°C에서 -25°C로 유지합니다.
6. 12웰 플레이트에 자유 부유 절편을 수집하여 냉동 보호 용액(글리세롤 150 mL, 에틸렌글리콜 150 mL, 증류 150 mL, F 완충제 50 mL [인산염 일염성 이수화물 1.682g 및 증류수 용해 0.385 g 수산화나트륨, pH 7]) (큰 뇌의 경우 절편을 완전히 덮기 위해 1 mL/웰) -20 °C에서 염색할 때까지 보관합니다.
   참고: 전체 반구 절편은 뇌 크기에 따라 다릅니다. 더 큰 뇌(예: 침팬지, 말)는 냉동체에서 처리하기 위해 등쪽과 복쪽 두 개의 동등한 블록으로 나뉜어야 합니다. 이 경우 자유 부유 구간을 두 개의 6웰 플레이트에 수집할 수 있습니다. 대안으로는 슬라이딩 미세토움을 이용해 큰 뇌 종의 반구를 절개하는 방법이 있는데, 이를 통해 더 큰 크기의 블록을 만들 수 있습니다.

그림 2: 동일한 절차를 따르고 표준화할 수 없는 변수를 다루는 매우 다양한 뇌를 처리 하는 과정. 위에서 설명한 방법에서는 표준화가 가능한 모든 절차가 동일한 방식으로 수행됩니다(일반 고정, 반구 전체에서 같은 두께의 연속 관상절 절단, 일반 면역세포화학 절차, 세포 계수 등). BioRender(https://app.biorender.com/)로 만든 피규어입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 조직학적 염색

1. 연속 코로나 절개 항목을 선택하세요(12개 중 1개). 이 간격을 얻으려면 12웰 판에서 한 웰의 모든 구간을 선택하세요. 이 자료들을 활용해 반구 전체의 완전한 대표성을 얻고, 연구된 다양한 종들 사이에서 유사한 뇌 수준에 있는 코로나 단면을 선택하는 참고 자료로 삼으세요(5절 참조). 1% 젤라틴화 슬라이드에 장착하세요. 몇 시간 동안 말리세요.
2. 다음 용액(150 mL/용액)을 준비하세요: 에탄올 50%, 70%, 96%, 100%, 자일롤, 톨루이딘 블루.
3. 염색 프로토콜: 슬라이드를 에탄올 농도(50%-100%)에 1분씩, 각각 50%-70%에 1분씩, 96%-100%에서 각각 2분씩 넣은 후 자일롤 용액으로 1분간 옮깁니다.
4. 슬라이드를 반대 순서로 놓으세요: 자일롤 용액을 1분간 사용한 후 에탄올 용액 농도를 점차 줄여가며(100%-50%), 각각 1분씩 100%-96%, 각각 1분씩 70%-50%에 노출합니다.
5. 슬라이드를 150mL 증류된 수소₂₀도(2분)에 넣습니다.
6. 슬라이드를 톨루이딘 블루 스테인 용액에 넣어 5-10분간 보관하세요. 이 단계가 끝나면 얼룩진 부분이 짙은 파란색으로 나타납니다.
   참고: 조직학적 염색 용액에 보관되는 시간 구간은 종에 따라 다를 수 있습니다. 관심 종의 뇌 부위를 검사하여 최적의 염색 프로토콜을 설정하세요.
7. 슬라이드를 150mL 증류 H_2O에 1분간 세척합니다.
8. 분별 단계로 진행하여 슬라이드를 점점 더 높은 농도의 에탄올(70%-100%)에 70%에서 1분, 각각 2분씩 96%-100%에 배치한 후 자일롤 용액으로 1분 30초간 옮깁니다. 이 단계들 동안 구간은 짙은 파란색에서 하늘색으로 바뀝니다.
9. 마감 매체를 사용해 마지막 자일롤 단계에서 조각이 아직 젖어 있는지 확인하세요(마르면 자일롤 용액에 5초간 헹구세요). 그 후 며칠간 슬라이드를 말리세요.

5. 뇌 수위 선택 및 면역조직화학적 염색

1. 4절에서 얻은 조직학적으로 염색된 절편을 참고하여 특정 신경해부학적 특징에 따라 뇌 수치를 식별합니다: Level 1(L1) - 측심실 앞쪽 개구부에서 L2까지; 2단계(L2) - 내부 캡슐 앞쪽 시작부에서 L3까지; 3단계(L3) - 편도체 앞쪽 시작부에서 L4까지; 4단계(L4) - 측심실의 후방 폐쇄에서 L2와 동등한 확장(두께 40 μm 연쇄 단편 수와 동일함)까지; 그림 3).
   참고: 위에 나열된 신경해부학 참고문헌은 크기와 회회가 매우 다른 뇌에 속하는 대뇌 피질을 비교할 수 있도록 하기 위한 목적입니다. 관심 있는 뇌 부위에 따라 기준으로 사용하는 해부학적 특징은 달라질 수 있습니다.
2. 각 뇌 레벨에서 균등하게 간격을 둔 세 개의 관상 절위를 선택하세요.
   참고: 다음 단계에서 사용하는 각 완충제의 부피는 뇌 크기에 따라 다릅니다(예: 마우스 절제는 0.5 mL/웰, 말 절제는 1.5 mL/웰). 자유 부유 구간이 각 완충기로 완전히 덮여 있는지 확인하세요.
3. PBS 0.01 M, pH 7.4에서 세 번씩 세척 구역을 5분씩 사용한다.
4. 내인성 과산화효소 차단액(0.6% H₂O₂, 1% Triton X-100, 0.01 M PBS, pH 7.4; 20분)에서 절편을 인큐베이팅하거나, 항원 추출을 90°C에서 5분간 수행하라(10 mM 구연산 10 mM 항산을 증류수에 0.05% Tween 20, pH 6.0을 첨가함).
   참고: 고정 절차/시간, 관심 항원에 따라 최적의 염색을 위해 항원 채취가 필요할 수 있습니다(완충제, 온도, pH, 배양 시간은 관심 항원에 따라 다를 수 있습니다).
5. 다시 PBS 0.01 M, pH 7.4에서 세척 구간을 3회 5분 세척합니다.
6. 차단 용액(1-5% 소 혈청 알부민(BSA), 정상 혈청, 1-1.5% Triton X-100 0.01 M PBS, pH 7.4; RT 90분 삽입)에서 인큐베이트 절단.
7. 1차 항체 용액(1-5% BSA, 2-3% 정상 혈청, 1-1.5% Triton X-100, 1차 항체 0.01 M PBS, pH 7.4; 48시간 4시간 4°C 부드럽게 저어준 상태로 인큐베이팅).
   참고: 관심 항원에 대한 항체는 뇌 영역과 종에 따라 염색 품질 측면에서 차이를 보일 수 있습니다²⁶. 연구에 고려된 다양한 종에 최적의 도구를 선택하기 위해 서로 다른 제조사의 항체 세트를 비교하여 샘플 간 변동성을 줄여야 합니다.
8. 5.3단계에서 설명한 세척 단계를 반복하세요.
9. 2차 비오틴화 항체 용액(1-5% BSA, 2-3% 정상 혈청, 1-1.5% Triton X-100, 2차 비오티닐화 항체를 0.01 M PBS, pH 7.4; RT 2시간 투여)으로 절편을 인큐베이팅합니다.
   참고: 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체 방법은 뉴로루시다의 세포 세기에 사용됩니다(6절 참조). 이는 밀도가 높고 오래 지속되는 침전물을 제공하여 셀 수 있을 때 절단 두께를 통해 초점을 맞출 수 있게 합니다. 면역형광 및 공초점 분석은 세포를 추가로 특성화하기 위해 이중 또는 삼중 면역염색을 수행하는 데도 사용될 수 있습니다(프로토콜은 참고문헌 22,25,32 참조).
10. 사용 가능한 키트를 사용해 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체를 준비하세요.
    참고: 복합체 형성을 위해 Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5(복합체 형성에 안정적인 pH를 제공함)에서 최소 1시간 전부터 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체 용액을 준비하여 복합체 형성을 허용하십시오.
11. PBS 0.01 M, pH 7.4에서 두 번 세척 절단(2회 5분 세척), Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5 (5분) 한 번 세척 절단.
    참고: 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체가 Tris-HCl 0.05M과 함께 용액에 있기 때문에, Tris-HCl 0.05 M으로 헹구면 조직이 용액에 익숙해질 수 있습니다.
12. 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체에서 절편을 인큐베이팅합니다(RT 1시간 동안).
13. Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5 (3회 5분 세척).
14. 훈훈 후드 아래에서 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색액(H₂O₂, Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5의 DAB)에 절면을 인큐베이팅하여 최적의 염색이 이루어질 때까지 진행합니다. 이 단계에서 단면은 투명에서 갈색/버건디 레드로 변합니다.
    참고: 최적의 염색 시간은 분석한 종에 따라 다릅니다(예: DCX의 경우 쥐 절단은 2-5분, 말 절단은 20-30분). 과도한 염색을 방지하기 위해 2분마다 착색된 구역을 확인하세요.
15. PBS 0.01 M, pH 7.4 (3회 5분 세척).
16. 슬라이드에 섹션을 장착하고, 마른 후에는 마운팅 매체를 사용한 커버슬립으로 덮고 며칠간 슬라이드를 말리세요.

그림 3: 대뇌 피질에서 미성숙 뉴런 분포와 양 연구를 위한 신경해부학적 뇌 수준 확립. 네 개의 대응하는 신경해부학적 구조(측심실 전방 시작 [레벨 1, L1]; 내막 앞쪽 시작 [L2]; 편도체 앞쪽 시작 [L3]); 측심실의 후방 폐쇄 [L4]; 이 방법은 고려된 모든 포유류에서 네 개의 대응하는 전후방 "뇌 수준"을 설정하는 것으로 간주되어 대뇌 피질 내 cIN 수를 "비교 가능한" 방식으로 연구했다. (A) 실험실 설치류(쥐, 왼쪽)와 영장류(침팬지, 오른쪽)에 대한 예시가 제시된다. 각 뇌 층의 3개 코로나 절면(총 12개 구역; 빨간 화살촉)이 각 관상 구역의 전체 II 계층 경계에 대한 세포 세기에 고려됩니다(참고: 모든 구역에는 신피질이 포함되어 있으나, 일부 구간만이 고피질을 포함합니다). 이 접근법은 크기가 매우 다양한 뇌의 대응 신경해부학적 수준에서 분석을 수행할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. (B) 매우 다양한 포유류 종의 조직학적으로 염색된 단면에서 첫 번째 수준(L1)을 식별하는 예시가 제시된다. BioRender로 만든 뇌와 동물 아이콘. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 세포 세기

1. 워크스테이션에서 Neurolucida 소프트웨어를 실행하고, 세포 계수 목적이 있는 슬라이드를 현미경 아래에 놓으세요.
   참고: DCX+ 세포 계수는 20배 대물렌즈를 사용했습니다.
2. 저배율(예: 4배)에서 소프트웨어의 Trace 메뉴에서 Freehand 윤곽선 도구를 사용해 피질 계층 II의 윤곽선을 그리면 길이 둘레(고피질과 신피질 모두)를 얻을 수 있습니다.
3. 화면 왼쪽에 있는 마커 툴바에서 셀 카운팅에 적합한 기호를 선택하세요. 이 분석을 위해, 각 관심 영역(고피질, 신피질)에서 두 개의 서로 다른 세포를 형태학적 특성(서로 다른 성숙 상태에 해당함: 1형, 작은 소마, 양극 형태, 소마 직경 범위 3-9 μm, 2형 소마와 복잡한 수상돌기 마보 형성, 소마 직경 범위 9-18 μm)에 따라 차별적으로 세는 것입니다.
   참고: 이 분석에서는 관심 영역별로 두 가지 다른 기호/셀 유형이 마 커 툴바에서 선택됩니다. 소마 직경을 여러 범위로 나누는 것은 명확한 형태가 없는 세포를 세밀하게 분류하는 데 매우 중요하며, 세포는 중간 성숙 상태일 수 있습니다. 과도한 수치를 방지하기 위해, 단면의 상부에서 절단된 셀은 분석에서 제외됩니다.
4. 계통 분석 데이터를 세 가지 영역, 즉 고피질, 신피질, 그리고 대뇌 피질(후자는 고생물피질과 신피질 데이터를 추가하여 얻음)에서 수집합니다.
5. 소프트웨어의 윤곽 측정 툴바에서 볼 수 있는 피질 2 주변 경계(mm)를 스프레드시트 파일에 수집하세요.
6. 같은 스프레드시트에서 각 뇌 영역과 뇌 레벨(3개 섹션/레벨, 총 12개 섹션/표본)에서 1형과 2형 세포 수(마 커 툴바에 표시됨)와 총 세포 수(1형과 2형 세포를 합산하여 얻음)를 수집합니다.
7. 이 데이터를 사용하여 각 영역의 각 구역별로 선형 셀 밀도(세포 수/mm)와 타입 1 및 타입 2 셀의 비율(타입 1/타입 2 셀 수를 총 셀 수로 나눈 후 100을 곱한 값)을 얻으세요.
8. 12개의 구간/표본의 밀도 중앙값을 스프레드시트의 중앙값 으로 계산하여 선형 셀 밀도를 그래픽으로 표현합니다. 중앙값을 중심 척도로 사용하세요. 그룹당 표본 수가 상대적으로 적고(그룹당 4마리), 일부 그룹은 비대칭 분포를 보이기도 합니다(중앙값은 극단값에 덜 영향을 받음).
9. 각 표본에서 1형과 2형 세포의 비율을 계산한 후(스프레드시트의 평균 함수를 사용), 4개 표본/종 간의 비율 평균값을 계산합니다. 그 후 선형 세포 밀도를 이용해 계통 분석을 수행하고(7절 참조), 각 관상 절면에서 집계된 총 세포를 이용해 미성숙 뉴런/반구의 총 수를 추정합니다.
10. Neurolucida 소프트웨어의 Freehand 윤곽 도구를 사용해 소마 직경을 주축에 수직으로 가로지르는 선을 그려보세요. 이 단계를 수행함으로써 각 종별 두 유형의 DCX 양성 세포(DCX+)의 직경 길이(각 뇌 영역에 25개의 세포/표본)를 무작위로 선택하여 1형과 2형 세포의 체마 직경 범위를 산출합니다.

7. 계통 발생 분석: 계통 나무 생성

1. 노트패드에 과학적 이름을 사용해 분석된 종 목록을 작성한 후 사이트에 업로드하세요 https://timetree.org/.
   참고: 과학적 명칭은 다음 사이트를 통해 확인할 수 있습니다: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
2. 얻은 트리 파일을 ' 뉴윅 파일 전송' 버튼을 클릭하여 내보내세요.

8. 계통발생 분석: 계통계수에서 데이터 통합 계산

1. 데이터시트의 각 열에는 분석된 모든 종과 상관관계가 있는 데이터(이 경우 전체 피질 DCX+ 세포 밀도, 신피질 DCX+ 세포 밀도, 고피질 DCX+ 세포 밀도)를 나열하세요. 종별로 여러 개체가 존재할 경우, 선택한 매개변수의 중앙 밀도 평균을 계산합니다.
2. 계통나무와 계통 데이터를 병합하려면 Mesquite Project 소프트웨어(https://www.mesquiteproject.org/)를 다운로드하세요.
   참고: 이 소프트웨어는 컴퓨터에 이미 자바가 있어야 합니다.
3. Timetree가 이전에 저장한 Newick 파일을 열어 ' 파일 열기'를 클릭하세요. 그 다음, Simple Newick/Phylip Treefile 옵션을 선택하세요. 파일을 텍스트로 처리하고 ".nex"로 저장하세요.
4. 새 페이지에서 Taxa&Trees 를 선택한 뒤, New Three Window를 선택한 후 'Source에서 나무와 함께'를 선택하세요. 팝업 창에서 저장된 트리를 선택한 후 확인 버튼을 누르세요. ' 가져오기 나무' 라는 새로운 탭이 표시됩니다.
5. 디스플레이 섹션에서 계통수(예: 글꼴, 크기, 길이에 비례한 가지)를 그래픽으로 수정하세요.
6. 메스키트에 새 탭을 추가하고, 추가 를 선택한 후 새 문자 행렬 을 선택한 후 문자 수를 선택합니다(이 연구에서는 숫자 = 3, 즉 세 개의 DCX+ 셀 밀도에 해당합니다). 문자를 연속적인 데이터로 취급하세요.
   참고: 특성은 계통계수와 상관관계가 있는 데이터를 나타냅니다.
7. 계통계수(pp. 6.4)와 상관관계가 될 데이터를 이 새로 생성된 탭에 복사하여 저장하세요.
8. 가져오기 트리 탭에서 Analysis: Tree와 Trace Character History를 선택하여 조상 상태 분석을 수행합니다.
9. 파일을 PDF로 저장하세요.

9. 계통 분석: 뇌 크기와 DCX+ 세포 밀도의 상관관계

1. 이전에 작성한 데이터시트에 각 종의 뇌 크기를 적은 열을 추가하세요.
2. DCX+ 세포 밀도와 뇌 크기의 자연 로그를 계산합니다.
3. 선호하는 통계 소프트웨어 패키지(https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html)를 실행하고 간단한 선형 회귀를 수행합니다
4. 결과 파일을 다운로드하여 잔차를 데이터 시트의 새 열로 저장하세요.
   참고: 잔차는 데이터 포인트가 회귀선에서 벗어난 정도를 나타냅니다.
5. 데이터시트에서 잔차 열과 종명이 포함된 열을 선택하세요. 그 다음, 삽입 지점으로 가서 잔차를 그래픽으로 표시할 히스토그램 그래프를 선택하세요.

10. 계통 발생 분석: 신피질 확장과 신피질 DCX+ 세포 밀도 상관관계

1. 이전에 작성한 데이터시트에 각 종의 신피질층 II 표면적 데이터를 포함하는 열을 추가하고, 자연 로그를 계산합니다.
2. 통계 소프트웨어에서는 로그 신피질층 II 표면적을 X 변수로, 로그 신피질 DCX+ 세포 밀도를 Y 변수로 사용하여 간단한 선형 회귀를 수행합니다.
3. 획득한 파일을 다운로드하여 잔차를 데이터 시트의 새 열에 저장하면, 9.5단계처럼 잔차 그래프를 만들 수 있습니다.

결과

연구된 모든 종의 대뇌 피질에 있는 DCX+ 세포는 일관되게 비분화된 신경세포 집단의 존재를 나타내는 일련의 특징을 공유합니다(그림 4A). 간단히 말해, 이들은 (i) 피질 계층 II를 따라 단층을 형성하도록 지형적으로 배열되어 있다; (ii) 미성숙 뉴런의 다양한 성숙 단계에 대해 설명된 형태학적 아형을 보여줄 것, (a) 작은 단극/양극성 세포가 많이 나타나고, 피라미드 뉴런을 연상시키는 복잡한 수상돌기를 가진 세포는 소수, (b) 대부분은 미성숙 PSA-NCAM과 DCX 마커를 공동 발현하지만 세포 분열과 관련된 Ki67 항원은 공동 발현하지 않음, 그리고 (c) 크고 복잡한 세포의 하위 집단도 NeuN을 발현하는데, 이는 이들이 성숙을 시작했음을 나타냅니다^22,25.

이러한 공통 특징 외에도, 여기서 설명한 방법...

토론

여기서 설명하는 방법은 뇌 크기와 신경해부학이 크게 다른 다양한 종들을 고려할 때 유사한 정량적 데이터를 제공합니다. 이는 다양한 포유류의 전체 뇌 내 세포 집단의 일관성을 평가하고, 출생 후 노화에 이르는 단일 종의 발달을 추적하는 데 활용될 수 있습니다. 이는 상대적으로 많은 수의 뇌(전체 반구)와 종이 관여하며, 동일한 실험실에서 샘플링 및 고정의 품질 기준을 따라 처리한 후 동일한 절차로 분석된다는 가정에서 시작한다³³ (그림 1, 2).

프로토콜의 중요한 단계는 뇌 크기와 윤리적/실용적 이유(예: 보호 포유류 종에서 허용되지 않는 절차)로 인해 완전히 표준화될 수 없는 변수들로 구성됩니다. 가장 흔한 것은 사후 간격(PMI)과 조직 고정으로, 이들에 대해서는 유사하지만 동일하지는 않은 조건에 도달할 수 있습니다. 우...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% 포르말린	시그마-올드리치	HT501128
2-메틸부탄	시그마-올드리치	320404	이소펜탄
3,3′-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 하이드레이트	시그마-올드리치	D5637
4% 파라포름알데히드	시그마-올드리치	441244
소 혈청 알부민	시그마-올드리치	A9647
구연산	시그마	C0759
조직학을 위한 DPX 마운트	시그마-올드리치	그리고 nbsp; 06522
에탄올	머크	1.00983
에틸렌글리콜	시그마-올드리치	102466
글리세롤	시그마-올드리치	G7893
과산화수소 용액	시그마-올드리치	H1009
킬릭 - O.C.T. 컴파운드	바이오옵티카	그리고 nbsp; 05-9801
메스키트 소프트웨어	메스키트 프로젝트	메스키트 버전 3.81 (빌드 955)
네오마운트	시그마-올드리치	1.09016
인산염 완충(PB)	나	나	맞춤 제작
인산염 완충 식염수 (PBS)	나	나	맞춤 제작
수산화나트륨	리델-드 하엔	6213
인산나트륨 이합금 이수화물	시그마-올드리치	71645
인산나트륨 단염성 이수화물	시그마-올드리치	71500
자당	시그마-올드리치	S9378
톨루이딘 블루	시그마-올드리치	89640
트리톤 X-100	시그마-올드리치	T8787
트윈 20세	시그마-올드리치	P9416
벡타스타인 엘리트 ABC-HRP 키트 페록시다제 (표준)	벡터 연구소	PK-6100
자일롤	시그마-올드리치	247642