방법 논문

조영제 강화 초음파와 전단파 탄성술을 이용한 유방암 바이오마커 평가

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⸱

DOI:

10.3791/69452

⸱

2026년 6월 23일

 , 
1Department of Ultrasound, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 2Department of General Surgery, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 유방암 환자에서 Ki-67, HER2, ER을 포함한 생물학적 예후 인자를 평가하기 위해 조영제 강화 초음파와 전단파 탄성술을 결합하여 적용한 사례를 보여줍니다.

초록

이 프로토콜의 목적은 전단파 탄성검사(SWE)와 조영구 강화 초음파(CEUS)에서 도출된 정량적 매개변수와 유방암의 생물학적 예후 표지 간의 관계를 평가하는 것이었습니다. 연구에는 유방암 환자 68명과 건강한 대조군 68명이 포함되었습니다. 모든 환자는 SWE 및 CEUS 영상 검사를 받았으며, 유방암군의 수술 표본은 면역조직화학을 이용해 에스트로겐 수용체(ER), 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2), Ki-67의 발현을 평가하였습니다.

결과는 유방암 조직이 정상 유방 조직과 유의미하게 다른 탄력성 및 관류 특성을 보임을 보여주었습니다. 구체적으로, 암 그룹은 E평균 값이 낮고 E최대, E최소 강도, 최고 증도, 평균 통과 시간(MTT) 값이 더 높았습니다. 상관관계 분석 결과, Ki-67 발현은 E평균,E 최대치, 피크, MTT와 양의 상관관계를 보였으며, ER은 피크 강도를 제외한 모든 지표와 음의 상관관계를 보였다. HER2 발현은 모든 측정된 영상 매개변수와 양의 상관관계를 보였습니다. 이러한 발견은 SWE와 CEUS가 유방암의 분자 특성화 및 임상 평가를 지원하는 비침습적이고 상호 보완적인 통찰을 제공할 수 있음을 시사합니다.

서론

유방암은 전 세계 여성에게 가장 흔한 암 중 하나로 평가되며, 발생률은 꾸준히 증가하고 있습니다. 최근 역학 연구에 따르면 유방암은 자궁경부암 다음으로 발생률이 높으며, 여성 전체에서 암 관련 사망률의 주요 원인으로 남아 있습니다 2,3. 유방암의 발병 기전은 유전적 특성, 내분비 영향, 환경 노출 등 여러 상호작용 요인에 의해 작용합니다. 정밀 의학의 발전과 함께 영상 표현형과 유방암 관리에서 분자 특징 간의 관계를 이해하려는 관심이 커지고 있습니다.

이 연구의 목적은 전단파 탄성검사(SWE)와 조영제증강 초음파(CEUS)가 에스트로겐 수용체(ER), 인간 표피성장인자 수용체 2(HER2), Ki-67 등 유방암의 주요 분자 표지자를 특성화하는 비침습적 영상 바이오마커로 활용될 수 있는지 조사하는 것이었습니다. 이 연구는 영상 검사가 치료 결정을 안내하고 예후에 중요한 역할을 하며, 생검의 보조 또는 대체 수단으로서 영상 검사가 상관관계가 있는지 여부를 확인하고자 했습니다. 이 상관관계를 검증하는 것은 첨단 영상 기술을 통해 분자 수준에서 유방암을 평가할 수 있는 접근성 있고 재현 가능한 방법을 제공할 수 있습니다.

임상 증상은 일반적으로 통증 없는 유방 종괴가 발견되는 것으로 시작되며,이는 약 80%의 여성에게 나타납니다. 질병이 진행됨에 따라 추가 징후로는 유두 분비물, 쿠퍼 인대의 견인으로 인한 피부 움푹 들어간 부분, 림프 폐색으로 인한 포 드 오랑주, 그리고 진행된 경우에는 유두 후퇴와 함께 진지염, 소포, 궤양 등 피부 변화가 동반되는 증상이 있을 수있습니다.

현재 유방암 진단에 사용되는 영상 기법에는 초음파, 유방촬영술, 자기공명영상(MRI), 그리고 핵의학 기법 8,9,10이 있습니다. 이 중 초음파는 비침습적이고, 환자를 방사선에 노출시키지 않으며, 지방 조직과 밀집된 분비선 조직을 구분하는 데 높은 재현성과 해상도를 제공하기 때문에 가장 널리 사용됩니다. SWE는 전단파 속도에서 유도된 영의 탄성계수를 기반으로 한 정량적 강성 측정을 제공하여 전통적인 초음파를향상시킵니다. 이 방법은 음향 방사선을 이용해 전단파를 유도함으로써 운영자 의존도를 줄여 재현성을 향상시킵니다12. CEUS는 종양 혈관 및 관류 패턴을 시각화하여 병변 발견 및 특성화에 기여하고, 양성 및 악성 종양의 구분에 도움을 줍니다13.

분자 면역조직화학 표지자의 유용성은 유방암 예후 결정과 치료 지침에 매우 중요합니다14. ER, 프로게스테론 수용체(PR), Ki-67, HER2는 임상 의사결정에서 확립된 역할을 하는 주요 표지자입니다15. 이전 연구들은 초음파 영상 특성이 이러한 분자 표지자의 발현을 반영할 수 있음을 시사하며, 영상 표현형이 종양 생물학의 근본적인 특성을 반영한다는 생각을 뒷받침합니다 16,17,18. 이 연구는 CEUS와 SWE 영상 매개변수 및 다양한 생물학적 예후 지표 간의 상관관계를 평가하는 적절한 프로토콜을 적용하는 것을 목표로 했으며, 이는 방사선유전체학 분야의 발전에 기여하는 데 기여했습니다.

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프로토콜

연구는 헬싱키 선언과 임상 연구를 위한 기관 지침에 따라 완료되었습니다. 이 연구 프로토콜은 진저우 의과대학 제3부속병원 기관윤리심사위원회에 제출되어 승인되었습니다.

등록 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았으며, 향후 출판을 위해 익명화된 임상, 영상, 병리학적 정보를 활용할 수 있는 허가도 받았습니다. 이 연구 전반에 걸쳐 환자 비밀 유지가 항상 유지되었습니다.

환자 참여를 위한 모집 및 평가 과정도 2021년 중국항암협회 지침에 따라 진행되었습니다.

1. 환자 선발 및 준비

  1. 유방암 확진, 적절한 초음파 영상 품질, 완전한 임상 데이터를 가진 환자를 포함하세요.
  2. 최근 유방 수술, 유방 확대, 유선염, 재발성 유방암, 흉터 인근 병변, 심혈관 또는 간신장 질환, 임신, 또는 병리 검사가 영상 촬영 30일 이상 전에 이루어진 경우는 제외합니다.
  3. 영상 촬영 전에 각 참가자의 나이, 체중, 임상 병력을 기록하세요.
  4. 환자를 두 팔을 머리 위로 들어 올리고 등을 대고 눕히세요.
  5. 최적의 음향 투통과와 이미지 선명도를 위해 유방에 커플링 젤을 넉넉히 발라.

2. 전단파 탄성검사(SWE) 검사

참고: 초음파 시스템과 프로브에 대해서는 재료표 를 참조하세요.

  1. 병변을 찾고 특성화하기 위해 일상적인 B-모드 초음파로 시작하세요.
  2. SWE 모드를 활성화하고 외부 압력 없이 병변 바로 위 피부에 수직으로 프로브를 위치시킵니다.
  3. 샘플링 프레임을 병변과 주변 조직의 적절한 경계를 완전히 포함하도록 조정하세요.
  4. 시스템의 품질 관리 지도를 모니터링하여 충분한 전단파 전파를 확보하세요.
  5. 영상이 안정화된 후에는 환자에게 3-5초 동안 숨을 참으라고 지시합니다.
  6. 이 시간 동안 프로브를 안정적으로 잡아 이미지를 안정시키세요.
  7. 색상으로 구분된 탄성술 이미지를 저장하고 시스템의 정량적 분석 도구를 사용해 병변을 윤곽 표시하세요.
  8. 병변의 최대(Emax), 최소(Emin), 평균(Emean) 탄성 계수 값을 기록합니다.
  9. 각 측정값을 세 번 반복하고 평균을 계산하세요.
  10. 측정의 일관성과 재현성을 보장하기 위해 전단파 탄성도 획득 및 품질 관리를 위한 국제 지침을 준수하세요.

3. 조영 증강 초음파(CEUS) 평가

  1. 병변의 최대 단면적을 보여주는 최적의 영상면을 식별합니다.
  2. 제조사의 지침에 따라 조영제를 재구성합니다: 5 mL의 식염수를 추가하고 2.4 mL를 주사기에 빼내세요.
  3. 적절한 캐뉼라를 사용하여 주위정맥 전부에 정맥 접근을 확립합니다.
  4. 초음파 시스템을 마이크로버블 시각화를 위해 기계적 지수로 대 비 영상 모드로 설정하세요.
  5. 조영제 2.4 mL를 신속 볼루스로 투여한 후 5 mL 식염수 플러시를 투여합니다.
  6. 즉시 연속 디지털 녹화를 시작하여 세척 및 세척 단계를 포착하세요.
  7. 완전한 향상 역학을 문서화하기 위해 최소 3분간 녹화하세요.
  8. 최고점 강화를 확인하고 병변 주변에 약 3-4mm 간격으로 네 개의 측정점(상부, 하부, 내측, 측측)을 배치합니다.
  9. 정량화 소프트웨어를 사용해 시간-강도 곡선을 분석하세요.
  10. 정량화 분석에서 피크 강도와 평균 통과 시간(MTT) 지표를 생성하세요.
  11. 일관성과 재현성을 보장하기 위해 이전 임상 연구에서 확립된 검증된 조영제증강(CEUS) 획득 및 정량분석 방법론을 따릅니다15.
  12. CEUS 영상과 정량적 분석을 사용하여 표준 유방 영상을 보완하여 혈관과 관류를 평가합니다.

4. 조직 채취 및 면역조직화학 분석

  1. 임상 기준에 따라 코어 바늘 생검 또는 외과적 절제술을 통해 조직 샘플을 채취하세요.
  2. 샘플을 10% 중성 완충 포르말린에 상온에서 6-24시간 고정합니다.
  3. 표준 조직병리학적 처리 프로토콜에 따라 탈수, 투명화 및 파라핀에 삽입.
  4. 미세토임을 이용해 파라핀이 박힌 조직 블록을 4 μm 조각으로 절단합니다.
  5. 양전하를 띤 유리 슬라이드에 섹션을 장착하세요.
  6. 슬라이드를 실온에서 자일렌(각각 2회 10분)에 탈파라핀화한 후, 등급 에탄올 시리즈(100%, 95%, 85%, 에탄올 70%, 각 단계당 5분)로 재수화한 후 증류수에서 세척합니다.
    참고: 모든 단계는 상온에서 교반 없이 수행되었습니다.
  7. 항원 추출은 시트레이트 버퍼(pH 6.0) 또는 EDTA 버퍼(pH 9.0)를 사용해 수행됩니다.
  8. 내인성 과산화효소 활성을 차단하기 위해 조직 절편을 3% 과산화수소 용액에 10분간 배양합니다.
  9. 1% BSA를 함유한 PBS에 희석된 ER, HER2, Ki-67에 대한 1차 항체를 적용합니다 (ER 1:100; HER2 1:200; 제조사 지침에 따라 4°C에서 교반 없이 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  10. 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체를 1% BSA(1:200)를 함유한 PBS에 희석한 상태로 가습 챔버에서 30분간 교반 없이 인큐베이팅합니다.
  11. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색원을 사용해 항체 결합을 시각화하고, 30초 동안 헤마톡실린으로 카운터 스테인을 합니다.
  12. 표준 기준을 사용하여 400× 배율 이하의 염색을 평가합니다: ER 양성>핵 염색 10%; ASCO/CAP 지침에 따라 평가된 HER2; 그리고 Ki-67은 양성 종양핵의 비율로 표현되었다.
  13. 표준화된 프로토콜을 사용하여 면역조직화학을 수행하며, 여기에는 열에 의한 항원 추출(시트레이트 버퍼, pH 6.0 또는 EDTA 버퍼, pH 9.0, 95-98 °C 20분), 3% 과산화수소로 실온에서 10분간 내인성 과산화효소 차단, 1차 항체와의 배양 후 고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체, 3,3′-디아미노벤지딘(DAB) 염색 검출, 헤마톡실린 카운터 염색, 등급 에탄올을 통한 탈수 등이 포함됩니다. 그리고 모든 샘플에 동일하게 적용되는 커버슬리핑(coverslipping)이 있으며, 이는 확립된 면역조직화학적 방법론21,22에 따라 적용되었습니다.

5. 통계 분석

  1. 연속 변수를 표준편차(SD)± 평균 단위로 표현합니다.
  2. 정상 상태 평가 후 암군과 대조군 간 SWE와 CEUS 매개변수를 비교하기 위해 독립적인 표본 t-검정을 사용하세요.
  3. 초음파 매개변수와 면역조직화학적 지표(ER, HER2, Ki-67) 간의 연관성을 평가하기 위해 스피어먼 상관분석을 수행하세요.
  4. 각 초음파 매개변수에 대해 암 상태를 분류 변수로 사용하여 수신자 작동 특성(ROC) 곡선을 생성합니다.
  5. 곡선 아래 면적(AUC) 값을 계산하고, 유덴 지수(J = 민감도 + 특이성 − 1)에 의해 결정된 최적 컷오프에서 감도와 특이도를 도출합니다.
  6. 양성 예측값(PPV)과 음성 예측값(NPV)을 계산합니다. 선택된 컷오프 값을 기준으로 합니다.
  7. 양측 P 값 0.05< 통계적으로 유의하다고 생각하자. 결과를 표와 수표로 제시하세요.

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결과

환자 특성

이 프로토콜을 68명의 유방암 환자와 68명의 건강한 대조군에서 시행한 결과, 그룹 간 탄성학 및 관류 지표에서 유의한 차이가 나타났습니다. 모든 유방암 사례는 평균 직경 20.78 ± 5.37 mm의 단측성 병변으로 나타났습니다. 조직병리학적 분석 결과, 침습성 관암 49건, 엽암 9건, 관내 암 6건, 점액성 암 3건, 그리고 수질암 1건이 확인되었습니다.

조영제 초음파 소견

조영제 초음파 검사 결과, 불규칙한 형태, 이질적인 내부 반향, 캡슐화 부재, 각진 특징이 있는 불분명한 경계 등 특징적인 악성 특징이 발견되었습니다. 조영제 투여 후 44건(64.71%)에서 빠른 강화 패턴과 함께 높은 증강이 나타났습니다. 관류 결함이 30건(44.12%)...

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토론

이 프로토콜은 유방암에서 정량적 초음파 매개변수와 분자 예후 표지 간의 관계를 명확히 보여주며, 비침습적 질환 특성화를 위한 명확한 틀을 제공합니다. 영상 매개변수와 면역조직화학적 표지 간의 상관관계는 영상 중 관찰되는 기계적 특성(조직 강성)과 관류 특성에 영향을 미치는 근본적인 생물학적 변화를 반영합니다.

역학 연구에 따르면 유방암은 여성암 환자의 약 25%를 차지하며, 여성 중 가장 흔하고 이질적인 악성 종양 중 하나로 남아 있습니다20. 역사적으로 임상 예후 측정은 조직학적 등급과 종양 직경에 기반했으며, 분자생물학이 현재 예후 평가의 금본위로 자리 잡고 있습니다. 그러나 이러한 방법들은 침습적 조직 채취에 의존하여 종양의 형태학적 또는 기능적 특성을 완전히 포착하지 못할 수 있습니다24

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

저자들은 진저우의과대학 제3부속병원의 초음파 기술자와 병리학 직원들의 기술 지원에 감사를 표합니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시트르산 완충액 (pH 6.0)12364Thermo Fisher Scientificwww.thermofisher.com
EDTA 완충액 (pH 9.0)88763Thermo Fisher Scientificwww.thermofisher.com
과산화수소 (3%)998765Sigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.com
L11-3 프로브 (초음파)ABC987Myriad Ultrasoundwww.myriad.com, 4-15 MHz
SonoVue (조영제)12345Bracco Diagnosticswww.bracco.com
SPSS 통계 소프트웨어N/AIBMwww.ibm.com
```

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