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방법 논문

태아 및 신생아 마우스 난소의 전면 면역염색

307 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

2026년 4월 28일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 난소의 전면 면역 표지 방법을 설명하며, 다른 작은 조직에도 적용할 수 있습니다.

초록

난소 예비구는 여성이 번식할 수 있는 난자로 구성되며, 원시 난포에 위치하며, 각 난포에는 여러 개의 과립세포가 둘러싸인 난자 하나가 있습니다. 난자세포는 처음에 생식선 밖에서 형성된 원시 생식세포로 시작하여 배아 발달 과정에서 난소로 이동합니다. 난소에 도달하면 이란 세포가 되어 유사분열로 분열되고, 불완전한 세포질 작용으로 생식세포 낭포라 불리는 상호 연결된 세포 군집을 형성합니다. 낭종 상태에서는 세포가 감수분열에 들어가 난자세포가 됩니다. 생쥐에서는 출생 이틀 전부터 낭종이 분해되기 시작하고, 각 난자는 원시 난포로 포장됩니다. 이 과정에서 일부 난자만 생존하며, 나머지는 세포자살사를 겪습니다. 낭종 분해와 원시 난포 형성의 조절은 부분적으로만 이해되어 있으며, 관련된 분자를 규명하는 것이 이 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 발달 중인 마우스 난소의 전면 면역염색은 잠재적 조절 분자의 위치를 확인하고, 난자 및 체세포 마커를 사용하여 돌연변이나 기타 분자 변화로 인한 원시 난포 형성에 미치는 영향을 평가하는 데 활용될 수 있습니다. 난소는 태아 또는 신생아 쥐로부터 채취되어 포름알데히드에 고정되어 차단됩니다. 난소는 관심 있는 단백질에 대한 항체에 노출되고, 이어서 형광 태그에 결합된 2차 항체가 1차 항체를 감지합니다. 마지막으로 난소를 장착하고 공초점 현미경으로 검사합니다. 이 절차는 관심 있는 여러 단백질을 검출할 수 있으며, 태아 쥐 고환과 같은 다른 작은 조직에도 적용할 수 있습니다.

서론

전체 마운트 면역염색과 공초점 영상을 결합한 것은 절절 없이도 소조직에서 단백질 발현과 세포 형태를 분석하는 강력한방법입니다. 이 방법에서는 먼저 조직을 채취, 고정, 차단한 후, 관심 있는 단백질에 대한 항체에 노출시킵니다. 항체는 형광체에 직접 결합하거나, 1차 항체를 인식하는 2차 항체로 표지합니다. 그 후 조직은 형광 염료인 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)과 함께 배양하여 세포 핵을 시각화합니다. 이 단계는 조직을 촬영할 때 공간적 방향을 제공하는 데 중요합니다. 마지막으로 조직을 장착하고 공초점 현미경으로 시각화합니다. 조직 형태학을 연구하는 또 다른 기법은 조직을 파라핀에 삽입하고, 절절을 하며, 헤마톡실린과 에오신과 같은 염료나 항체로 표지하는 것입니다. 또는 냉동 절편을 준비하여 면역 염색을 할 수도 있습니다. 안타깝게도 이 두 기법 모두 단면 분할이 포함되어 있어 3차원 정보가 손실됩니다. 연속 섹션이 도움이 될 수 있지만, 분석은 번거롭고 많은 섹션을 봐야 합니다. 따라서 전체 마운트 방법은 광학 절편을 통해 시각화할 수 있는 조직의 3차원 구조를 보존할 수 있어 유리합니다.

원시 생식세포(PGCs)가 난자로 발달하고 난자가 원시 난포로 조립되는 과정은 여성 생식력에 필수적입니다. PGC는 배아외에서 형성되며 배아 발달 과정에서 난소로 이동해야 합니다. PGC가 쥐의 배아 일차 약 10.5일에 난소에 도착하면, 이산화 2형으로 분류됩니다. 난자균은 유사분열을 겪지만 불완전한 세포 형성 상태로 생식세포 낭포라 불리는 상호 연결된 세포 군집을 형성합니다. 난고균은 E 13.5부터 감수분열에 들어가 난자가 되어 전단계 I를 거쳐 디플로텐 단계로 진행합니다. 난자가 발달하면서 낭종이 분해되면서 각 난자는 과립 세포층으로 둘러싸여 원시 난포를 형성합니다. 각 난포에는 디플로텐 정지 난자4가 포함되어 있습니다. 낭종 붕괴와 함께 많은 난자가 손실되며, 이는 원시 난포 형성 시 품질 관리에 중요한 것으로 여겨집니다. 원시 난포에 있는 디플로텐 정지 난자의 수는 생식에 사용할 수 있는 난소 내 난자 저장고를 구성하며, 생식력과 직접적으로 관련이 있습니다. 난포 형성이 방해되면 난소 저장고가 줄어들어 여성 생식 수명이 제한될 수 있습니다.

전체 마운트 면역염색을 사용하여 배아, 태아, 신생아 난자 발달 중 단백질의 발현을 식별하고 분석하였습니다. 검사된 분자에는 MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT, STAT3 5,6,7,8,9가 포함됩니다. 이 기법은 원시 난포 형성이 어떻게 조절되는지를 밝히는 데에도 광범위하게 사용되어 왔습니다. 태아 또는 신생아 난소는 배양되어 신호 전달 분자 또는 억제제에 노출되었습니다. 배양된 난소의 난자는 생체 내 난포 형성과 유사한 원시 난포 형성을 겪습니다. 난소 배양은 이 난소 발달 단계에서 스테로이드 호르몬6, 10, 11, KIT8, PI3K 신호전달 12를 성공적으로 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 후에는 난자 세포질에서 발현되는 단백질인 DEAD 박스 헬리케이스 4(DDX4, 마우스 정관 상동체(MVH)라고도 불림)에 대한 항체를 이용한 전이식 면역염색이 시행됩니다. 난소는 공초점 현미경으로 검사하여 원시 난포 형성을 평가합니다.

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프로토콜

쥐를 이용한 모든 절차는 시러큐스 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 검토 및 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 신생아 쥐 난소를 태후 1일째부터 5일째까지 표시하는 것입니다(도식은 그림 1 참조). 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 난소 수확 및 고정

  1. 미국 국립보건원(NIH)의 "실험동물 관리 및 사용 가이드"와 IACUC 승인 동물 프로토콜에 따라 신생아 C57BL/6 마우스를 안락사시키세요. 난소를 1x 인산염 완충식염수(PBS)에 해리합니다.
    참고: 이 절차에서는 신생아 마우스를 IACUC 동물 프로토콜에 따라 참수로 안락사했습니다. C57BL/6 마우스 계통의 수컷과 암컷은 신생아에서 항문생식기 개구 사이에 작은 어두운 점이 있어 구분할 수 있습니다. 난소를 해부하려면 먼저 위를 자르고 장을 파내세요. 그 다음 복부를 꼬리 중앙 절개로 열고 두 개의 수평 절개를 하세요. 각 신장 아래에 난소를 찾아내고, 각 난소를 분리하며, 과도한 조직을 깨끗이 제거하세요.
  2. 난소를 600 μL 5.3% 파라포름알데히드(PFA; 16% EM등급 PFA를 1x PBS에 희석한 상태)에 직접 넣어 실온(RT)에서 마이크로퓨지 튜브에 넣습니다. 난소를 고정된 상태로 4°C에서 하룻밤(O/N) 상태로 배양합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 훈훈장이나 환기가 잘 되는 곳에서 사용하세요. 피부와 눈 접촉을 방지하기 위해 장갑, 안구 보호구, 보호복을 착용하세요. 유해 폐기물로 폐기하세요.
  3. 난소를 1mL 0.1% Triton X-100에 1x PBS(PT)에 빠르게 두 번 세척한 후, 1mL PT에 한 번 최소 30분간 RT에서 세척합니다. 1mL PT + 5% BSA(블록)에 최소 30분간 Nutator RT에서 배양하거나 4°C에서 최대 2주간 보관하세요.

2. 1차 및 2차 항체 인큐베이팅

  1. 1차 항체를 500μl PT + 5% BSA O/N에 희석한 상태로 4°C에서 Nuator 위에 인큐베이팅합니다. 1 mL PT + 1% BSA에 세 번 세척하고, Nutator RT에서 30분간 세척하세요.
    참고: 희석은 항체에 따라 다릅니다. 여기 표시된 대표적인 데이터는 DDX4를 희석한 1:200으로 표시하고 있습니다. 두 가지 다른 단백질에 대한 항체는 1차 항체가 두 종에서 만들어지고, 다른 2차 항체가 인정하는 종에서 생성되지 않는 한 동시에 사용할 수 있습니다(염소 항생쥐 항-Alexa-488과 당나귀 항염소-Alexa 568은 사용하지 마세요).
  2. 1차 항체로 난소를 배양하는 동안, 2차 항체를 500 μL PT + 5% BSA O/N, 4°C에서 4°C에서 2차 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위해 2차 항체의 비특이적 결합을 줄였습니다. 2차 항체를 6000 x g 에서 30초간 원심분리하여 바닥에 잔류 분말을 수집합니다. 샘플 튜브로 2차 유물을 옮길 때 이 잔류물을 반드시 뽑지 마세요.
    참고: 희석은 항체에 따라 다릅니다. 여기 표시된 대표적인 데이터는 염소 반토끼 알렉사 488 희석된 1:200 기준으로 표시되어 있습니다.
  3. 2.2단계에서 제작된 사전 흡수된 형광 2차 항체와 함께 RT 상태에서 2–4시간 동안 Nuator 투여 후 인큐베이팅합니다. 이제부터는 호일을 덮으세요. 1mL PT + 1% BSA에 세 번 세척하고, 30분간 루터테이터로 RT 투여하세요.

3. DAPI로 핵을 표지하고 슬라이드에 난소를 장착하기

  1. DAPI 1:1000 PBS에 90분간 RT 상태로 인큐베이팅. 1mL 1x PBS로 한 번 세척.
  2. 넓은 200 μL 마이크로피펫 팁을 사용해 난소를 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 바늘이나 주사기로 과도한 PBS를 제거하세요. 난소에 마운팅 매체 3방울을 추가하세요.
  3. 난소 위에 커버슬립을 부드럽게 덮어 매체 매체가 커버슬립 가장자리까지 퍼지도록 하세요. 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 마른 후 -20°C에서 보관하세요.

4. 배아 가루 준비

  1. 최소 부피의 얼음처럼 차가운 1x PBS에서 ~ E 12.5–E 14.5 마우스 배아를 균질화합니다. 얼음처럼 차갑게 식힌 아세톤 4부량을 넣고 섞은 뒤 얼음 위에서 30분간 배양하세요.
    주의: 아세톤은 가연성이며 눈과 피부 자극을 유발합니다. 훈훈장이나 환기가 잘 되는 곳에서 사용하세요. 피부와 눈 접촉을 방지하기 위해 장갑, 안구 보호구, 보호복을 착용하세요. 유해 폐기물로 폐기하세요.
  2. 10,000 x g 에서 10분간 원심분리한 후 상원액을 제거한 후 얼음처럼 차가운 아세톤으로 펠릿을 세척하고 다시 돌립니다.
  3. 펠릿을 필터 페이퍼 위에 펴서 플라스틱 트레이에 넣고, 화학 후드에서 O/N을 건조시키세요. 곱게 갈아 완전히 자연 건조한 후 -20 °C에서 보관합니다.

5. 공초점 현미경에 의한 단백질 발현 분석

  1. 관심 단백질을 표지한 후 공초점 현미경으로 시각화합니다. 단백질 발현을 검사할 때는 보통 3–4마리(6–8개의 난소)를 사용해 각 난소의 여러 장의 이미지를 촬영합니다.
    참고: 대표 결과 섹션에 설명된 이미지는 회전 디스크 공초점 현미경 또는 공초점 레이저 주사 현미경에서 얻었습니다. 사용되는 매개변수는 대표 결과 섹션에 설명되어 있으며, 사용되는 현미경에 따라 달라집니다.

6. 원시 난포 형성 및 발달에 의한 공초점 현미경 분석

  1. DDX4와 같은 세포질 난자 마커에 대해 난소를 표시한 후, 각 난소마다 시각화를 위해 두 개의 영역 또는 '코어'를 무작위로 할당합니다.
    참고: 코어는 212 × 212 μm 깊이의 4개의 주요 광학 단면으로 구성되며, 각각 깊이 15–20 μm로 분리되어 있습니다. 4개의 광학 절편은 피질과 연수 모두에 걸쳐 난소의 모든 영역을 평가합니다. 각 난소마다 2개의 코어와 4개의 광학 섹션이 있어 총 8개의 섹션이 됩니다( 그림 2 참조).
  2. 주요 광학 섹션을 분석용으로 촬영한 후, 각 1μm 간격으로 각 5장의 이미지와 아래 5장의 Z-스택을 촬영합니다. 각 주요 절편별로 해당 절편의 난자 총 수를 세어
  3. 그 후 메인 섹션의 각 난자에 대해 메인 섹션과 섹션 스택을 살펴보아 초점 평면 위쪽 또는 아래쪽 난자와 연관되어 있는지 확인합니다. 마지막으로, 모든 난자마다 난포 발달 단계(원시, 1차, 2차)를 결정하세요.
    참고: 통계적으로 유의미한 데이터를 얻기 위해서는 최소 4마리(8개의 난소)를 분석하는 것이 권장됩니다.

7. 대체 핵 표지자로서 프로피듐 요오화물 사용

  1. 2.3단계 후에는 0.1 mg/ml RNase A(10 μL 중 10 mg/ml 10 mL → 1% BSA x 1% BSA)에서 30분간 인큐베이팅합니다. RNase A를 제거하고 10 μg/mL 프로피듐 요오화물(10 μL 1 mg/mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL x 1 Pt + 1% BSA)에서 RT 시, 뉴테이터 위에서 20분간 인큐잉합니다. 이제부터는 튜브를 호일로 덮으세요.
    주의: 프로피듐 요오다이드는 독성이 있고 돌연변이를 유발합니다. 훈훈장이나 환기가 잘 되는 곳에서 사용하세요. 피부와 눈 접촉을 방지하기 위해 장갑, 안구 보호구, 보호복을 착용하세요. 유해 폐기물로 폐기하세요.
    참고: 토토-3는 핵 표지기로도 사용할 수 있습니다.
  2. 프로피듐 요오다이드를 제거하고 1 mL PT + 1% BSA에 30분간 세척하세요. 3.1단계(DAPI 염색)는 건너뛰세요.

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결과

여기서 설명한 면역염색법의 전형적인 결과가 나타났습니다. 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6의 이미지는 40배 오일 대물렌즈 NA 1.3을 사용해 회전 디스크 공초점 현미경으로 촬영되었으며, 노출 시간은 100–250 ms, 레이저 출력은 0.01%에서 0.1% 사이입니다. 그림 3에서는 신생아 쥐 난소가 쥐 난세포질 내에서 발현되는 단백질인 DDX4에 대한 항체와 핵 마커 프로피듐 요오다이드로 표지되어 있습니다. 출생 후 1일(PND) 쥐 난소의 공초점 절편은 그림 3A–C에 나타나며,...

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토론

이 보고서는 관심 있는 단백질에 대해 전체 난소에 형광 표지하는 방법을 설명합니다. 이 절차는 원시 난포 형성 중 단백질의 발현 을 규명하고, 4,5,6,7,8,9,10,11 등 다양한 조건에서 난포 형성 변화를 특성화하는 데 광범위하게 사용되어 왔습니다. 이 방법이 조직 절편 절단 방법에 비해 가지는 장점은 3차원 구조가 보존된다는 점입니다.

...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

영상 촬영은 시러큐스 대학교의 블랫 영상 센터에서 수행되었습니다. 그림 7의 이미지는 NIH S10 OD026946-01A1 지원을 받은 자이스 LSM980과 Airyscan2에서 얻은 것입니다. 이 연구는 NIH(MEP)로부터 R03 HD102016 및 R21 HD112756 보조금으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
반인간 VASA (염소에서 만들어짐)R& DAF2030
안티-DDX4/MVH (래빗에서 만들어짐)앱캠AB13840
안티-GCNA1/TRA98 (쥐로 만들어짐)앱캠AB82527
소 혈청 알부민 (BSA)피셔BP-1600
커버 슬립 22 x 22 #1.5워너 인스트루먼트64-0721
DAPI (분말)시그마 올드리치D-9542dH2O에 5 mg/ml 용액을 준비합니다
해부 스코프
당나귀 안티 고트 알렉사 568인비트로젠A11057
당나귀 안티마우스 알렉사 488인비트로젠A21202
당나귀 안티 래빗 알렉사 568인비트로젠A10042
Donkey 안티-래빗 알렉사 647인비트로젠A31573
당나귀 안티-랫 알렉사 488인비트로젠A21208
에탄올 200 프루프파르코111000200
파인 가위 - 날카롭다파인 사이언스 툴즈14060-09난소 제거와 과잉 조직 다듬기 등 미세한 작업은
겸자 (듀몽 핀셋, 스타일 5)전자현미경 과학72705-01 (0209-5-PO)
염소 반래빗 알렉사 488인비트로젠A11008
마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL써모 사이언티픽3451PK
현미경 슬라이드피셔브랜드12-550-123
튜테이팅 믹서랩넷S0500
파라포름알데히드 16%전자현미경 과학15710
페트리 접시 100 x 15 mm바이오플라스트 제조940-10774
인산염 완충 식염수 1X(피셔) S271-1; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (시그마) P9541-500G; (피셔) BP332-500; (피셔) P285-500800 mL MQ H2O  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 80g NaCl  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; KCl 의 2.0; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 14.4g Na2HPO4 및 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 2.4g KH2PO4   그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; HCl로 pH를 7.4로 조절하세요; 최종 볼륨 1 L 그리고 사용을 위해 10배에서 1배로 희석합니다
핀 홀더파인 사이언스 툴즈26016-12직선 바늘을 약간 굽힌 상태로 잡기 위해
피펫 필터 팁원팁(10uL) 1121-3810; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (20 uL) 1120-1810; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (200 uL) 1120-8810; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (1000 uL XL) 1122-1830
피펫 팁OneTIp(10 uL) 1111-3800; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (200 uL) 1111-1800; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (1250 uL) 1112-1820
피펫 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000길슨(0.1-2 uL) F144054M; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (2-20 uL) F144056M; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (20-200 uL) F144058M; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (100-1000 uL) F144059M
프로피듐 요오다이드, dH2O에 1mg/ml인비트로젠P3566
RNase A 분말시그마 올드리치RG513-50mg0.1M 아세테이트 나트륨(pH 5.2)에 10 mg/mL 용액을 준비합니다. 100도<서><>C로 15분간 가열하세요. 냉각 후 RT로 냉각한 후 1 M Tris-Cl (pH 7.4)의 0.1 부피를 추가하여 pH를 조정합니다.
스트레이트 니들난소에서 과도한 조직을 절단하기 위해 직선 바늘을 곡선으로 구부린 것
트리톤 X-100써모 사이언티픽X100-100ML
투베르쿨린 주사기 28G x 1/2타이코/헬스케어 켄달 모노젝트1180128012
벡타쉴드벡터 연구소H-1900
바그너 가위파인 사이언스 툴즈14068-12참수와 더 큰 상처를 위해
와이드 보어 피펫 팁 20 ul랩콘1026-965-008-9

참고문헌

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